周文漢 鄭康寧 李永民

（河北中醫(yī)學院，石家莊 050200）

原發(fā)性肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）死亡率高居癌癥第三位［1］。目前，除手術和肝移植外，放化療是主要治療手段，但放化療藥物的毒性及耐受性限制了其治療效果，導致患者5年生存率低于30%［2］，因此，HCC是嚴重危害人類健康的重大疾病。

Yes關聯(lián)蛋白1（yes-associated protein 1，YAP1）是Hippo通路下游的關鍵效應分子。研究表明，YAP1的過度活化導致組織器官的增殖失調［3］。臨床研究表明，肝癌組織中，YAP1過表達且處于活化狀態(tài)；同時，激活YAP1促進腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移［4］。沉默YAP1的表達抑制了SMMC-7721的增殖［5］。因此，YAP1是潛在的肝癌治療靶點之一。

瑞香狼毒（Stellera chamaejasmeL.serum group,SCL）為瑞香科狼毒屬植物，一般藥用部位為干燥根，是我國西北、內蒙古、黑龍江等地一種分布廣泛的植物。SCL最早記載于《神農本草經》，是藥用狼毒的正品。其味苦辛、性平，入肺、脾、肝經，具有逐水祛痰、破積殺蟲之功效。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，SCL在治療腫瘤及結核病等方面有很多值得探討與開發(fā)的價值［6］。然而關于SCL抑制肝癌細胞增殖的機制鮮見報道。

本研究以肝癌HepG2215 細胞及Yap1敲除（Yap1LKO）小鼠和Yap1flox/flox小鼠肝原位癌模型為材料，進行了細胞活力檢測、蛋白水平表達驗證、病理組織學觀察和分子對接等體內外實驗，擬得出結論：SCL抑制肝癌增殖與降低YAP1表達有關，為原發(fā)性肝細胞癌的病理機制研究和臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和動物 HepG2215（整合HBV基因的細胞株）和L02（正常肝細胞）細胞株均購自湖南亞大豐暉新材料有限公司，并由上海翼和應用生物技術有限公司進行STR基因型檢測鑒定。SD雄性大鼠購于北京維通利華（許可證號SCXK（京）2016-0006）。肝細胞特異性Yap1敲除（Yap1LKO）小鼠購自賽業(yè)（廣州）生物科技有限公司。此研究已獲得河北中醫(yī)學院倫理委員會批準（倫理編號：DWLL2019029）。

1.1.2 試劑與耗材 SCL干燥根取材于河北省張家口市尚義縣（經河北北方學院劉貴河教授確認是SCL正品）［7］；胎牛血清購自于美國Hyclone公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自于北京索萊寶科技有限公司；蛋白提取試劑盒；柱式動物組織/細胞總蛋白抽提試劑盒購自于上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司； 12%聚丙烯酰胺預制膠購自于南京金斯瑞生物科技有限公司；兔抗YAP1（D8H1X）XP單克隆抗體購自于美國 Cell Signaling Technology 公司；兔抗GAPDH抗體購自于上海泊灣科技有限公司；HRP 標記的山羊抗兔 IgG購自于上海生工生物工程股份有限公司；通用型 ECL 發(fā)光液購自于上海圣爾生物科技有限公司；N-亞硝基二乙胺（diethylnirtosamine，DEN）購自于美國 Sigma 公司； 組成型雄甾烷受體激動劑（3,5-dichloro-2-［4-（3,5-dichloropyridin-2-yl）oxyphenoxy］pyridine，TCPOBOP）購自于北京博奧派克生物科技有限公司；蘇木素-伊紅染色液購自于安徽雷根生物技術有限公司；多功能成像系統(tǒng)購自于法國 VILBER BIO IMAGING公司；多功能微孔板讀數(shù)儀購自于賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Image-J軟件購自于美國National Institutes of Health公司；MS250超聲換能器的成像系統(tǒng)購自于多倫多VisualSonics公司。

1.2 方法

1.2.1 制備SCL水煎液 稱取642 g SCL的干燥根，加水5 L浸泡1 h。將SCL干燥根在砂鍋中煎煮2 h，并濃縮至2 L，制成321 mg/mL的SCL水煎液，放于-20℃凍存?zhèn)溆?。使用時，用蒸餾水稀釋至160.5 mg/mL。

1.2.2 制備SCL含藥血清 12只雄性SD大鼠隨機分為2組。SCL組：灌胃SCL水煎液（3.21 g/kg）1 mL，每天2次；生理鹽水（NS）組：灌胃NS 1 mL，每天2次。連續(xù)灌胃4 d，末次灌胃2 h后，SD大鼠經2%戊巴比妥鈉麻醉，股動脈取血。全血常溫靜置2 h，2 500 r/min離心15 min，取上清液，56℃水浴30 min，分裝后，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 CCK-8法檢測細胞生長活性 將HepG2215和L02細胞分別置于含10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2飽和濕度環(huán)境培養(yǎng)。收集處于對數(shù)生長期的HepG2215和L02細胞，制成1×105個/mL的細胞懸液，以每孔100 μL細胞懸液接種于96孔板中。細胞貼壁后，加入用培養(yǎng)基稀釋的含不同體積比的SCL含藥血清（0%、5%、10%、15%、20%和30%）培養(yǎng)24 h，每孔加入100 μL配置的CCK-8溶液（CCK-8溶液∶RPMI1640培養(yǎng)基=1∶9），混勻后，孵育2 h，多功能微孔板讀數(shù)儀檢測波長為450 nm處的OD值。細胞存活率（%）=（試驗孔吸光度-空白孔吸光度）/（對照孔吸光度-空白孔吸光度）×100%。

1.2.4 Western blot法檢測HepG2215細胞中YAP1表達水平的變化 SCL含藥血清處理細胞24 h后，按照柱式動物組織/細胞總蛋白抽提試劑盒步驟提取HepG2215細胞蛋白，100℃加熱變性，用12%聚丙烯酰胺預制膠進行蛋白分離；轉膜后封閉，并用兔抗YAP1（D8H1X）XP單克隆抗體（1∶1 000稀釋）和兔抗GAPDH抗體（1∶2 000稀釋），4℃過夜；洗膜后加入山羊抗兔IgG-HRP（1∶10 000稀釋）室溫下?lián)u床孵育1.5 h。洗膜后，進行ECL曝光，用多功能成像系統(tǒng)檢測條帶，并用Image-J軟件測量條帶灰度值，分析結果。

1.2.5 大鼠肝臟毒性檢驗 為了選出有療效且不損傷正常肝細胞的SCL劑量，將大鼠隨機分為3組，分別為高濃度SCL水煎液組（3.21 g/kg）、低濃度SCL水煎液組（1.605 g/kg）和NS組。連續(xù)灌胃4 d，取出大鼠肝臟，拍照。

1.2.6 DEN/TCPOBOP化學誘導的肝原位腫瘤小鼠模型 肝細胞特異性Yap1敲除（Yap1LKO）小鼠由廣州賽業(yè)生物科技有限公司構建并鑒定成功［8］。將2周齡雄性Yap1flox/flox小鼠和Yap1LKO小鼠，腹腔注射DEN 25 mg/kg； 從第4周齡開始，每2周注射1次TCPOBOP（3 mg/kg），共計10次。24周齡時，通過MS250超聲換能器的成像系統(tǒng)，通過超聲測定小鼠肝臟內的腫瘤數(shù)量［9］。對造模成功的10只Yap1flox/flox小鼠和10只Yap1LKO小鼠隨機分為SCL組和NS組。根據(jù)動物之間給藥劑量的計算參照公式：小鼠藥量×3=大鼠藥量×6。小鼠的給藥量是大鼠的2倍。SCL用量為2.293 g/（kg·d），共計7 d。

1.2.7 H&E染色觀察腫瘤組織的病理形態(tài) 小鼠肝臟組織經4%多聚甲醛固定后，梯度酒精脫水、透明、浸蠟、組織包埋后，進行組織切片（厚度5 μm）。組織切片脫蠟后，經蘇木精染色、分化液酸化、返藍后，再用伊紅染色，酒精脫水，透明、中性樹膠封片，晾干后顯微鏡觀察拍照。

1.2.8 LC-MS技術對SCL全物質鑒定 取SCL水煎液，SCL含藥血清和NS血清各100 μL，加入400 μL的萃取液（甲醇∶乙腈=1∶1）。渦流混勻30 s后，低溫超聲萃取30 min（5℃，40 kHz）。然后用4℃冷凍離心機13 000 r/min離心15 min，取出上清液，用氮氣吹干。加入100 μL的重組液（乙腈∶水=1∶1），超聲提取，離心。最后轉入小瓶進行LC-MS分析。將原始數(shù)據(jù)導入代謝組學處理軟件Progenesisqi進行基礎分析。接著利用該軟件對特征峰搜索數(shù)據(jù)庫進行識別，并對代謝數(shù)進行分析。MS的質量誤差設置為小于10 PPM，根據(jù)二級質譜匹配評分鑒定代謝物（主要數(shù)據(jù)庫為http://www.hmdb.ca/和https://metlin.scripps.edu/）。上述檢測和分析由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行。

1.2.9 SCL含藥血清活性成分與YAP1分子對接 應用PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載活性成分的2D結構，并進行能量最優(yōu)化。在Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）中尋找YAP1蛋白結構，通過PDB數(shù)據(jù)庫（https://pdbj.org/）下載靶蛋白結構。用PyMol軟件去除水分子和小分子配體，使用Auto Dock Tools 1.5.6軟件添加氫鍵，Vina進行受體和配體分子對接，得到分子對接的分數(shù)值。利用PyMol軟件展示配體分子與受體蛋白的結合位點。

1.2.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差（S）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SCL含藥血清不影響人正常肝細胞L02的增殖

選用高濃度（3.21 g/kg）與低濃度（1.605 g/kg）SCL水煎液及生理鹽水，分別灌胃大鼠7 d。肉眼觀察大鼠肝臟的形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)高濃度SCL組大鼠的肝臟形態(tài)有肉眼可見的改變，而低濃度SCL組和NS組的大鼠肝臟并未觀察到明顯的變化（圖1-A）。選用低濃度的SCL含藥血清進一步處理L02細胞24 h，CCK-8法檢測結果顯示，不同體積比（0%、5%、10%、15%、20%和30%）的SCL含藥血清對L02細胞的增殖均無影響（圖1-B）。因此，在后續(xù)細胞試驗中，均采用低濃度的SCL含藥血清干預細胞。

圖1 低濃度瑞香狼毒含藥血清對人正常肝細胞L02增殖的影響Fig.1 Effects of low concentration of SCL serum on the proliferation of normal liver cells L02

2.2 低濃度SCL含藥血清抑制肝癌HepG2215細胞的增殖

為了探究SCL含藥血清對HepG2215細胞的影響，不同體積比（0%、5%、10%、15%、20%和30%）的SCL含藥血清處理HepG2215細胞24 h。形態(tài)學觀察結果發(fā)現(xiàn)，隨著SCL含藥血清比例的增加，HepG2215細胞形態(tài)皺縮、細胞數(shù)量減少、懸浮細胞增多；NS血清處理的細胞生長狀態(tài)良好，細胞呈多邊形生長，形態(tài)規(guī)則（圖2-A）。

圖2 不同濃度瑞香狼毒含藥血清抑制HepG2215細胞的增殖Fig.2 Proliferation of HepG2215 cells inhibited by different concentrations of SCL serum

不同體積比SCL含藥血清處理HepG2215細胞24 h，CCK-8法結果顯示，隨著SCL含藥血清濃度的增加，HepG2215細胞的存活率逐漸降低（圖2-B）。24 h時，SCL含藥血清干預HepG2215細胞的IC50值為（19.38±0.73）%（圖2-C）。結果表明，SCL含藥血清能抑制HepG2215細胞的增殖活力。

2.3 SCL含藥血清降低HepG2215細胞中YAP1蛋白的表達水平

臨床上，YAP1在肝腫瘤組織中高表達。為進一步探究SCL能否影響YAP1的表達水平，Western blot分析結果顯示，SCL含藥血清降低了HepG2215細胞中YAP1的蛋白表達水平（P＜0.05）（圖3）。

圖3 瑞香狼毒含藥血清降低HepG2215細胞YAP1蛋白表達水平Fig.3 Expression of YAP1 decreased by SCL serum in HepG2215 cells

2.4 SCL水煎液抑制肝原位癌小鼠肝臟腫瘤的增長

為了驗證SCL是否能通過YAP1抑制肝癌細胞的增長，DEN/TCPOBOP聯(lián)合誘導Yap1flox/flox和Yap1LKO小鼠構建肝原位癌模型，SCL水煎液和NS灌胃7 d。在NS組中，與Yap1flox/flox小鼠相比，Yap1LKO小鼠的肝腫瘤體積明顯減小。結果表明，敲除Yap1能減小小鼠肝腫瘤的體積。在Yap1flox/flox組中，與NS組相比，SCL組小鼠肝臟的腫瘤體積縮小了。結果表明，SCL能抑制Yap1flox/flox小鼠腫瘤增長。在Yap1LKO組中，與NS對照組相比，SCL組小鼠肝臟的腫瘤體積縮小，但效果不如Yap1flox/flox組。結果表明SCL能抑制Yap1LKO小鼠腫瘤增長。有趣的是，YAP1敲除后，SCL抑制肝腫瘤體積增長的作用減弱（圖4-A）。H＆E染色結果顯示，在Yap1flox/flox和Yap1LKO組中，NS組的正常肝臟組織結構被腫瘤組織浸潤破壞，肝癌細胞呈巢狀排列，松散程度更高，多數(shù)肝癌細胞體積大，有大小不一的空泡，胞漿豐富，細胞核多核分裂象多見；SCL組腫瘤組織邊界清楚，肝癌細胞排列呈多角形，細胞核雙核分裂象多見。在SCL組中，與Yap1flox/flox小鼠相比，Yap1LKO小鼠肝臟組織結構更加完整（圖4-B）。這些結果說明SCL能抑制肝原位癌小鼠肝臟腫瘤的增長。

2.5 SCL降低肝原位癌小鼠肝癌細胞中YAP1的表達

為了進一步探究SCL抑制小鼠肝原位癌增長的機制，肝原位癌Yap1flox/flox和Yap1LKO小鼠分別經NS和SCL灌胃后，Western Blot檢測小鼠肝癌組織中YAP1蛋白的表達水平。Western Blot結果顯示了Yap1LKO小鼠的YAP1已被敲除。同時在Yap1flox/flox小鼠中，與NS組相比，SCL降低了小鼠肝癌組織中YAP1的表達水平（圖5）。綜合2.4和2.5的結果，SCL抑制小鼠肝臟腫瘤增長與降低肝腫瘤組織中YAP1表達水平有關。

圖5 瑞香狼毒降低肝原位癌小鼠肝癌細胞YAP1的表達Fig.5 Expression of YAP1 decreased by SCL in the mice with tumors in liver

2.6 SCL含藥血清中的4種主要活性成分

為進一步驗證SCL抑制肝癌細胞的主要成分，利用LC-MS對NS血清、SCL含藥血清和SCL水煎液所含成分進行全物質鑒定。分析結果顯示，NS血清、SCL含藥血清和SCL水煎液3組樣本LC-MS負極檢測到的化合物數(shù)量分別為314、309和1 468種，正極檢測到的化合物數(shù)量分別是527、527和1 068種，以上結果均為去除未命名化合物后的數(shù)量（圖6）。SCL含藥血清與SCL水煎液中共有的化合物，確定為SCL發(fā)揮作用的活性成分（附圖1）。這些活性成分是3-硫酸咖啡酸（caffeic acid 3-sulfate）、5-芐惡唑-2-酮（5-benzyloxolan-2-one）、3, 4, 5-三羥基-6-［（2-氧代-2H-鉻-5-基）氧］氧烷-2-羧酸（3,4,5-trihydroxy-6-［（2-oxo-2H-chromen-5-yl）oxy］oxane-2-carboxylic acid）和異東莨菪內酯（Isoscopoletin），見表1。

表1 瑞香狼毒發(fā)揮作用的活性成分Table 1 Active ingredients of SCL

圖6 LC-MS檢測不同組別化合物數(shù)量Venn圖Fig.6 Venn diagram of the number of compounds of different groups detected by LC-MS

2.7 SCL中3種活性成分能直接結合YAP1蛋白

在PubChem數(shù)據(jù)庫中，未檢索到活性成分5-芐惡唑-2-酮的化學結構。因此，選取SCL的3種活性成分3-硫酸咖啡酸、3,4,5-三羥基-6-［（2-氧代-2H-鉻-5-基）氧］氧烷-2-羧酸和異東莨菪內酯分別與YAP1進行分子對接，進一步驗證SCL活性成分是否與YAP1蛋白存在直接結合作用。結果表明，3-硫酸咖啡酸與YAP1在Gln410位點處形成氫鍵，對接能為-6.0 kcal/mol；3,4,5-三羥基-6-［（2-氧代-2H-鉻-5-基）氧］氧烷-2-羧酸與YAP1在Glu381和Lys281位點處形成氫鍵，對接能為-7.8 kcal/mol；異東莨菪內酯與YAP1在Gln410處形成氫鍵，對接能為-7.2 kcal/mol。陽性對照verteporfin（YAP1抑制劑）與YAP1在ARG-291和GLY-283處形成氫鍵，對接能為-7.5 kcal/mol（圖7）。結果表明，SCL的這3種活性成分能直接結合YAP1蛋白,與陽性對照相比，3種活性成分與YAP1的結合能力與Verteporfin類似。表明SCL的3種活性成分可能通過直接結合YAP1，從而發(fā)揮抑制肝癌細胞增殖的作用。

圖7 瑞香狼毒活性成分與YAP1分子對接示意圖Fig.7 Schematic diagram of molecular docking between the active ingredients of Stellera chamaejasme L.and YAP1

3 討論

約50%的HCC臨床標本中存在YAP1過表達且核定位的活化形式［10］。而且，YAP1作為一種基因轉錄共激活因子在維持腫瘤細胞的自我更新及分化中起著重要的作用［11］。YAP1的活化是肝癌發(fā)展的早期事件，YAP1過表達導致細胞增殖和集落形成能力增加［12］。沉默YAP1抑制了肝癌細胞SMMC-7721的增殖［5］。因此，YAP1是肝癌的治療靶點。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞特異性Yap1敲除的小鼠肝臟表面腫瘤的數(shù)量明顯減少［13］。

SCL作為一種傳統(tǒng)的中藥，已經廣泛應用于我國北部和西南部的許多地區(qū)。主要應用于癌癥、皮膚病、支氣管炎以及結核病的治療［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度SCL含藥血清在體外能抑制肝癌細胞HepG2215生長活性，體內能抑制小鼠肝腫瘤的增殖；同時，對正常肝細胞的生長活性無明顯抑制作用。相似的研究也顯示，SCL提取物能逆轉TGF-β誘導的HepG2間充質形態(tài)，調節(jié)標記蛋白的表達，顯著抑制TGF-β誘導的肝癌HepG2細胞遷移和侵襲［15］。而且，SCL提取物提高了H22細胞體外移植小鼠腫瘤抑制率，且沒有明顯的毒副作用［16］。

現(xiàn)有資料未闡明SCL抑制腫瘤增殖的活性成分。本研究利用LC-MS進一步闡釋了SCL抑制肝癌細胞增殖的成分，明確了SCL水煎液和SCL含藥血清中均含有3-硫酸咖啡酸、5-芐惡唑-2-酮、3,4,5-三羥基-6-［（2-氧代-2H-鉻-5-基）氧］氧烷-2-羧酸和異東莨菪內酯4種有效成分。同時，分子對接的結果也證實，3-硫酸咖啡酸、3,4,5-三羥基-6-［（2-氧代-2H-鉻-5-基）氧］氧烷-2-羧酸和異東莨菪內酯這3種主要成份能與YAP1蛋白形成氫鍵，發(fā)揮直接結合YAP1的作用。因此，認為這3種成分可能是SCL水煎液在體內發(fā)揮降低YAP1表達關鍵成分。體外試驗結果表明，異東莨菪內酯能抑制肝癌細胞HepG2、肺癌細胞A549、乳腺癌細胞MCF7［17］和結腸癌［18］的生長。體內研究也表明，SCL水提物能抑制肝臟腫瘤細胞的生長，延長肝癌原位移植瘤小鼠的生存時間［19］。

在機制方面，本研究利用肝細胞特異性Yap1敲除小鼠的肝原位荷瘤模型進一步明確了SCL抑制肝癌增殖的效應與降低YAP1表達水平有關。但是，關于SCL調控肝癌細胞YAP1表達的具體機制仍有待進一步深入探討。

4 結論

肝臟YAP1基因異常是肝腫瘤形成的重要因素，瑞香狼毒可通過降低肝癌細胞中YAP1的表達抑制肝細胞癌增殖。其內在的作用機制可能是瑞香狼毒中的3-硫酸咖啡酸、3,4,5-三羥基-6-［（2-氧代-2H-鉻-5-基）氧］氧烷-2-羧酸和異東莨菪內酯等3種瑞香狼毒活性成分直接結合YAP1有關。

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