杜冬冬 錢晶 李思琪 劉雯菲 魏向利 劉長勇 羅瑞峰 康立超

（新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測試中心 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團食品檢驗所, 石河子 832000）

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是一種人獸共患食源性致病菌，在自然環(huán)境廣泛存在，對多種惡劣環(huán)境有較強的耐受力，并且能通過多種途徑抵御食品加工過程的極端環(huán)境，從而在食品中存活［1］。研究顯示食用被LM污染的食物可導(dǎo)致患李斯特菌病，其臨床癥狀包括發(fā)熱性胃腸炎、敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)和死胎等，孕婦、新生兒、老人和免疫功能低下的人為主要易感人群，病死率高達30%［2］。據(jù)研究統(tǒng)計，在發(fā)達國家有多次李斯特菌病暴發(fā)的報道。2011年，在美國28個州發(fā)生了由于食用被LM污染的香瓜而導(dǎo)致147人感染發(fā)生李斯特菌病暴發(fā)疫情，30人死亡［3］。在2018南非爆發(fā)了一次最嚴重李斯特菌病疫情，導(dǎo)致1 000多人患病，216人死亡［4］。我國LM感染引發(fā)的暴發(fā)事件和臨床病例報道較少，但LM在食品中的污染情況普遍存在，例如2010-2014年間遼寧省14個城市的食品中LM的檢出率為1.87%［5］；2016-2019年重慶市39個區(qū)縣的即食食品中檢出率為1.77%［6］。同時隨著抗生素的濫用，使得LM對抗生素耐藥性水平逐漸提高，導(dǎo)致LM的預(yù)防治療愈加復(fù)雜困難，對人們的健康產(chǎn)生嚴重的威脅［7］。

隨著測序技術(shù)迅速發(fā)展，大量的LM菌株完成基因組測序，為研究LM提供了參考信息。全基因組測序不僅有利于了解菌株遺傳背景和生理特性，以及基因組結(jié)構(gòu)變化，進化關(guān)系和基因功能等［8］，而且也能通過分析基因組中的毒力基因來預(yù)測菌株的潛在致病性。多位點序列分型（mutilocus sequence typing, MLST）是通過對細菌的多個管家基因（abcZ,bglA,cat,dapE,dat,ldh,lhkA）測序后，分析不同等位基因間的差異從而確定菌株間的相關(guān)性和進化關(guān)系［9-10］。

目前關(guān)于新疆地區(qū)食源性LM的基因組研究報道較少，本研究對一株新疆某地區(qū)分離的食源性LM進行了全基因組測序，分析了其攜帶的毒力基因，并與其它地區(qū)和國家來源菌株進行了親緣關(guān)系的比較，為研究本地區(qū)的LM分子特征提供了參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 單核細胞增生李斯特菌LMXJ15菌株由新疆農(nóng)墾科學(xué)院分析測試中心微生物鑒定室從新疆某地的調(diào)理肉制品中分離鑒定并保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 腦心浸出液肉湯（brain heart infusion broth，BHI），北京路橋有限公司；單核細胞增生李斯特菌診斷血清，日本DENKS SEIKEN公司；細菌基因組DNA快速提取試劑盒，北京博邁德生物技術(shù)有限公司；臺式高速冷凍離心機，Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組測序和拼接 將LMXJ15菌株劃線接種于BHI固體培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)進行活化，挑取單菌落接種于10 mL BHI液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16 h。按照DNA提取試劑盒說明書提取LMXJ15菌株的基因組DNA，并通過瓊脂糖電泳和核酸蛋白測定儀（SMARTSPEC PIUS，美國BIO-RAD）檢測，確保提取基因組的質(zhì)量和濃度。提取的LMXJ15菌株DNA由生工生物工程（上海）股份有限公司采用PacBio和Illumina HiSeq測序平臺進行全基因組測序和拼接組裝。

1.2.2 基因預(yù)測與注釋 采用Glimmer 3.02軟件進行開放閱讀框（open reading frame，ORF）預(yù)測，Prokka對組裝結(jié)果進行基因元件預(yù)測，CRISPR預(yù)測采用CRT，將所有預(yù)測蛋白序列與Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫比對，完成蛋白序列的功能注釋。

1.2.3 血清型鑒定 利用單核細胞增生李斯特菌血清型鑒定試劑盒的方法測定分離株LM的O和H抗原，并結(jié)合參照Doumith等［11］的多重PCR方法中的引物序列與基因組序列匹配方法確定LM血清型。

1.2.4 毒力基因預(yù)測及分析 通過VirulenceFinder-2.0 Server（https://cge.cbs.dtu.dk/services/VirulenceFinder/）分析LMXJ15菌株的毒力基因攜帶情況。

1.2.5 MLST分析 對LMXJ15菌株的基因組序列與其它從 NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/）網(wǎng)站下載的72株LM全基因組序列通過https://cge.cbs.dtu.dk/services/MLST/進行分析，確定單核細胞增生李斯特菌的7個管家基因（abcZ，bglA，cat，dapE，dat，ldh，lhkA）的等位基因號和ST型別及CC復(fù)合克隆系。

2 結(jié)果

2.1 LMXJ15菌株的基因組特征

采用PacBio和Illumina HiSeq測序平臺獲得LMXJ15菌株的完成圖?；蚪M序列總長度（genome size）為3 017 732 bp，平均GC含量為37.81%?；蝾A(yù)測分析，獲得編碼基因（CDS No）3 154個，編碼57個tRNA、6個rRNA，編碼基因總長度為2 734 315 bp，平均長度為866.94 bp。

2.2 CRISPR預(yù)測結(jié)果

CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences）是一類獨特的DNA正向重復(fù)序列家族，通常由長度為25-48的重復(fù)序列以及單一序列間隔組成［12-13］。CRISPR的作用機制類似于真核生物的RNAi，即利用間隔區(qū)識別并沉默外源的遺傳物質(zhì)。CRISPR/Cas系統(tǒng)為細菌抵抗外來基因片段的自身免疫系統(tǒng)，對LM的致病性、耐藥性及新陳代謝具有重要作用［14］。LMXJ15菌株中發(fā)現(xiàn)一個CRISPR序列，位于染色體上的270 451-270 928 bp位置，長度為478 bp（表1），提示LMXJ15菌株可能通過CRISPR途徑提供相應(yīng)的獲得性免疫，來對抗侵略細菌的外源DNA、質(zhì)粒和噬菌體，提高在自然環(huán)境中的適應(yīng)性。

表1 LMXJ15菌株的CRISPR序列Table 1 CRISPR sequences of strain LMXJ15

2.3 GO注釋結(jié)果

GO注釋結(jié)果（圖1）顯示，LMXJ15基因組中有2 241個基因得到了功能注釋，占所有編碼基因的75.03%，包括細胞組成（cellular component，CC）、生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）三大類（圖2）。在BP這一層面得到22種功能注釋，其中和代謝有關(guān)基因數(shù)量、與細胞過程相關(guān)基因最多。在CC層面得到17種功能注釋，其中細胞膜和細胞膜組分功能相關(guān)的基因最多。在MF層面得到12 種功能注釋，其中與催化活性和細胞附著有關(guān)的基因最多。

圖1 CRISPR重復(fù)片段的SeqLogo圖Fig.1 SeqLogo plot of CRISPR repeats

圖2 LMXJ15菌株基因的GO功能分類Fig.2 GO functional classification of genes of strain LMXJ15

2.4 血清鑒定結(jié)果

血清型是細菌分型中非常重要的意義，往往和細菌的毒力、宿主特異性疫苗是否有保護性相關(guān)［15］。本研究利用鑒定LM的O和H抗原、對已獲得的基因組序列和血清分型相關(guān)基因及特異性引物進行匹配，鑒定LMXJ15菌株為1/2a血清型。

2.5 毒力基因預(yù)測

通過VirulenceFinder-2.0 Server的毒力基因預(yù)測顯示，LMXJ15菌株攜帶88個毒力相關(guān)基因，其中與表達調(diào)控相關(guān)的基因10個，與耐受環(huán)境壓力相關(guān)的基因21個，與逃避宿主免疫系統(tǒng)作用相關(guān)的毒力基因18個，與侵襲和黏附相關(guān)的毒力基因26個，與生存和增殖相關(guān)的毒力基因12個，其他相關(guān)毒力相關(guān)基因2個（表2）。

表2 LMXJ15菌株基因組上的致病相關(guān)基因Table 2 Pathogenicity-related genes on the genome of strain LMXJ15

2.6 MLST分析結(jié)果與基因組共線性分析

對72株單核細胞增生李斯特菌分型結(jié)果顯示如表3，通過7個保守基因序列進行分子進化樹構(gòu)建（圖3），結(jié)果顯示72株菌分成3個不同的分支，并呈現(xiàn)譜系聚類，譜系I和譜系II分別含有25和28個進化分支，譜系III含有4個進化分支，顯示菌株進化關(guān)系與血清型有較為直接的關(guān)系。譜系I中主要以4b血清型菌株最多，譜系II中主要為1/2a血清型菌株。LMXJ15序列型為ST8屬于CC8復(fù)合克隆系，與意大利分離株IZSAM_Lm_15_17439_A144、瑞士分離株LmN1546和一株從熏鮭魚分離菌株R479a在同一個進化分支上，親緣關(guān)系較近，具有相同的ST型和血清型（1/2a）。采用Mauve 軟件對4株菌株進行共線性分析，結(jié)果如圖4所示，菌株間基因組的相似度較高，含有9個較大的本地共線性模塊（locally colinear blocks, LCB），但是它們所在的區(qū)域以及排列順序有一定的差異。

圖3 72株單核細胞增生李斯特菌基于MLST管家基因序列的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree of 72 Listeria monocytogenes strains based on the housekeeping gene sequences of MLST

圖4 全基因組共線性分析Fig.4 Whole genome alignment analysis

表3 72株單核細胞增生李斯特菌MLST分型結(jié)果Table 3 MSLT typing results of 72 strains of Listeria monocytogenes

3 討論

LM是一種人畜共患病病原菌，具有分布廣、耐受力強和致病力高等特征，通過污染食品來傳播疾病，孕婦、新生兒及免疫力低下的成人為主要易感人群，感染后將引起敗血癥、腦膜炎、孕婦流產(chǎn)及新生兒死亡，病死率高達30%，因此被WHO列為四大食源性致病菌之一［16-17］。近幾年，全國各地大量食品污染監(jiān)測數(shù)據(jù)表明，LM在各類食品中存在不同程度的污染，其風(fēng)險不容忽視［18-20］。但由于中國居民飲食習(xí)慣的差異以及對食源性致病菌監(jiān)控體系建立起步較晚，目前對該致病菌的監(jiān)測數(shù)據(jù)少，分離株數(shù)量少，大量的研究工作仍然停留在污染監(jiān)測上，同樣在新疆地區(qū)也是如此，對于LM分子遺傳特征闡述與分析的數(shù)據(jù)量低，數(shù)據(jù)的缺失，使得防控出現(xiàn)空白。因此闡明LM的血清型、分子分型、基因組功能特性和毒力基因攜帶情況，對LM的預(yù)防與控制具有重要的意義。

本研究通過PacBio和Illumina HiSeq測序平臺完成了1株分離自調(diào)理肉制品的單核細胞增生李斯特菌LMXJ15的全基因組測序，基因總長度為3 017 732 bp，GC含量為37.81%，預(yù)測到3 154個編碼基因，其中編碼基因總長度為2 734 315 bp，平均長度為866.94 bp，基因中包含6 個rRNA操縱子和57個tRNA。通過CRISPR預(yù)測，LMXJ15菌株中發(fā)現(xiàn)一個CRISPR序列，位于染色體上的270 451-270 928 bp位置，長度為478 bp，說明菌株LMXJ15可能通過CRISPR途徑提供相應(yīng)的獲得性免疫，提高在環(huán)境中適應(yīng)能力。

通過血清型分析LMXJ15為1/2b型，對LMXJ15與臨床、食品、動物、環(huán)境相關(guān)的LM（NCBI上公布）進行MLST比較分析并構(gòu)建進化樹，發(fā)現(xiàn)72株菌株主要屬于CC6、CC7、CC8、CC9復(fù)合克隆系，同時呈現(xiàn)譜系聚類。LMXJ15序列型為ST8屬于CC8復(fù)合克隆系，屬于譜系II，與意大利IZSAM_Lm_15_17439_A144臨床分離株［21］、瑞士LmN1546臨床分離株［22］和一株從熏鮭魚中分離的R479a菌株［23］具有相同ST型血清型（1/2a），并在同一個進化分支上，對這4株LM的基因組共線分析結(jié)果顯示高度相似，其毒力因子的數(shù)目也相同，這與梁慧賢等［24］的研究結(jié)果相類似，毒力基因的分布與遺傳進化表現(xiàn)出一定的相關(guān)性。

LM成功入侵宿主細胞中存活、增殖需要多種毒力因子在不同感染階段發(fā)揮作用［25］，對LMXJ15毒力分析顯示，不僅具有hpt、pycA、fri、relA、oppA、lplA1、prsA2、chiA、dal、fur、pgl、stp等毒力因子來提高在各種環(huán)境中的生存能力，還有促進LM入侵宿主上皮細胞且在感染動物的毒性表型中具有重要作用的inlA、inlB、inlF、inlH、inlJ、lap等毒力因子，以及在自噬識別逃逸中發(fā)揮重要作用的hly、plcA、plcB、mpl等毒力因子，這些表明LMXJ15菌株具有較強的毒力，有感染人患病的風(fēng)險。

4 結(jié)論

LMXJ15基因組大小為3 017 732 bp，包含3 154個基因，其中GO中注釋有2 241個基因；通過CRISPR預(yù)測LMXJ15菌株中發(fā)現(xiàn)一個CRISPR序列；MLST比較分析LMXJ15屬于CC8復(fù)合克隆系ST8型，與人源臨床分離株親緣關(guān)系較近、基因組高度相似性，并且攜帶有多種毒力因子。本研究豐富了單核細胞增生李斯特菌的基因組數(shù)據(jù)庫，為新疆地區(qū)單核細胞增生李斯特菌的研究提供了參考數(shù)據(jù)。