吳昊 劉紫微 鄭穎 戴雅文 時權(quán)

（解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心口腔科，北京 100853）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的優(yōu)良生物學(xué)特性給人類疾病治療帶來了新希望，顯現(xiàn)出巨大應(yīng)用潛力。但越來越多的研究證實MSCs內(nèi)部具有異質(zhì)性，常規(guī)群體水平的測序分析往往無法反映MSCs最真實的特征［1］。而缺乏對MSCs功能異質(zhì)性的全面了解，嚴(yán)重阻礙了MSCs有效的、可復(fù)制的臨床應(yīng)用［2］。單細(xì)胞測序技術(shù)是在單個細(xì)胞水平上，對基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀組進(jìn)行高通量測序，利用生物信息學(xué)分析，挖掘單細(xì)胞水平基因組的生物學(xué)意義，揭示單個細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，反映細(xì)胞間的異質(zhì)性，在發(fā)掘新的疾病診斷標(biāo)志物、分辨細(xì)胞亞型、差異基因等方面具有獨特的優(yōu)勢［3-4］，為探究MSCs內(nèi)部的功能異質(zhì)性提供了可能［5］。

牙齦干細(xì)胞（gingival mesenchymal stem cells,GMSCs）是從牙齦固有層中提取的間充質(zhì)干細(xì)胞［6］，其不但容易獲得、來源豐富，而且具有良好的生物學(xué)功能，在組織工程、再生醫(yī)學(xué)、免疫疾病治療方面展現(xiàn)了較好的應(yīng)用前景［7］。本研究擬分離培養(yǎng)人GMSCs，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（single cell RNA sequencing, scRNA-seq）技術(shù)對GMSCs進(jìn)行分析，從微觀角度分析GMSCs內(nèi)部的功能異質(zhì)性，為GMSCs的精準(zhǔn)化應(yīng)用提供理論與實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 細(xì)胞培養(yǎng)皿、離心管（NEST，中國）；α-MEM、胎牛血清（GIBCO，美國）；Dispase、IV膠原酶、胰蛋白酶（Sigma，美國）；PBS（碧云天，中國）；CCK-8（同仁，日本）;CD73-PE、CD29-APC、CD90-FITC、CD105-APC、CD31-PE、HLA-DRFITC抗體（BD Biosciences，美國）、臺盼藍(lán)（碧云天，中國）；10×Genomics Single Cell 3'v3試劑盒（10×Genomics公司，美國）。

1.1.2 儀器 倒置顯微鏡（Nikon，日本）；酶標(biāo)儀（Thermo Fisher，美國）；流式細(xì)胞儀（BD Biosciences，美國）； 10×Genomics測序儀（10×Genomics公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 GMSCs分離培養(yǎng)及鑒定 人牙齦組織來自我院口腔科接受智齒拔除術(shù)、阻生尖牙導(dǎo)萌術(shù)的患者?；颊呒韧w健，無傳染病、慢性病、牙周疾病，牙齦組織經(jīng)患者同意后獲得，臨床實驗標(biāo)本的獲得經(jīng)過解放軍總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。根據(jù)本課題前期的方法提取人GMSCs［8-10］，簡要步驟為：獲得牙齦組織立即至于含4×雙抗的α-MEM培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移至超凈工作臺，PBS漂洗3-5次后放在2 mg/mL的Dispase酶中4℃消化12 h。隨后分離牙齦，收集固有層皮片剪碎，IV型膠原酶37℃消化1 h，1 000 r/min離心5 min，棄上清。將細(xì)胞重懸后至于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，用含10% FBS、2×雙抗、2 mol/L L-谷氨酰胺的α-MEM培養(yǎng)基中，37℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。6 h后棄除原培養(yǎng)基及未貼壁的細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞匯合率達(dá)80%時，1∶4傳代培養(yǎng)。取P3代GMSCs，消化離心后PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物CD90、CD73、CD29、CD105、CD31、HLA-DR。將GMSCs按2×103/孔的密度接種96孔板，CCK-8法測定GMSCs增殖曲線。

1.2.2 單細(xì)胞測序樣本制備 取生長良好的P3代GMSCs，用PBS洗滌2遍，加入0.125%無EDTA胰酶消化細(xì)胞，離心、棄上清，PBS重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，取10 μL的細(xì)胞懸液與90 μL 0.4%臺盤藍(lán)溶液混合，細(xì)胞計數(shù)，要求單細(xì)胞懸液細(xì)胞存活率在95%以上，細(xì)胞濃度700-1 200 cells/μL，細(xì)胞總量不少于5×105，無明顯的結(jié)團(tuán)現(xiàn)象，用于建立單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本文庫。參照10×Genomics平臺操作流程及要求制備單細(xì)胞微滴并建立文庫，進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 高通量測序中產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別轉(zhuǎn)化為測序讀段（sequenced reads）。使用Fast QC軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制評估。采用Cell Ranger對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計和比對參考基因組，對高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行定量，獲得高質(zhì)量細(xì)胞數(shù)、基因中位值、測序飽和度等質(zhì)量控制統(tǒng)計信息。

應(yīng)用Cell Ranger Seurat軟件對細(xì)胞進(jìn)行聚類和分群；利用CellCycleScore函數(shù)對細(xì)胞進(jìn)行G1、S和G2/M分期、細(xì)胞周期狀態(tài)推斷；應(yīng)用Seurat中的VlnPlot函數(shù)對GMSCs表面標(biāo)記物、成骨、成軟骨等相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行分析；應(yīng)用FindAllMarkers函數(shù)獲得GMSCs細(xì)胞亞群的差異表達(dá)基因，并對各亞群的標(biāo)記基因進(jìn)行GO通路富集分析。CellPhoneDB分析各個亞群之間受體配體的互作關(guān)系情況。

2 結(jié)果

2.1 GMSCs觀察與鑒定

本研究中提取到的人GMSCs呈旋渦狀貼壁生長，為長梭形、多邊形（圖1-A）。體外培養(yǎng)的GMSCs生長旺盛，增殖趨勢呈“S”型（圖1-B）。流式細(xì)胞儀檢測GMSCs陽性表達(dá)CD73、CD90、CD105、CD29，陰性表達(dá)CD31、HLA-DR（圖1-C）。

圖1 GMSCs培養(yǎng)與鑒定Fig.1 Culture and identification of GMSCs

2.2 單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)質(zhì)量

根據(jù)圖2中的基因數(shù)和線粒體數(shù)分別設(shè)置過濾參數(shù)及閾值，過濾掉多重細(xì)胞、基因數(shù)小于200以及線粒體基因比例大于20%的低質(zhì)量細(xì)胞，共獲取了9 842個高質(zhì)量的單細(xì)胞測序數(shù)據(jù)，每個細(xì)胞基因檢測數(shù)中位數(shù)為4 245，細(xì)胞中的Fraction reads為91.3%。

圖2 數(shù)據(jù)總體質(zhì)量Fig.2 Overall data quality

2.3 GMSCs細(xì)胞亞群分析

t-SNE可視化結(jié)果顯示GMSCs包含9個細(xì)胞亞群，但每個細(xì)胞亞群包含的細(xì)胞數(shù)不同（圖3-A）。如圖3-B所示，在單細(xì)胞水平分析GMSCs的細(xì)胞表型結(jié)果表明，GMSCs高表達(dá)ENG（CD105）、NT5E（CD73）、THY1（CD90）、ITGB1（CD29）和CD44，陰性表達(dá)CD34、CD14、PTPRC（CD45）及PECAM1（CD31）。

圖3 單細(xì)胞測序分析GMSCs功能亞群與標(biāo)記物Fig.3 Single cell sequencing analysis of functional clusters and markers of GMSCs

2.4 GMSCs亞群增殖異質(zhì)性分析

CellCycleScore函數(shù)對所有細(xì)胞進(jìn)行G1、S、G2/M細(xì)胞周期狀態(tài)分析（圖4-A），結(jié)果顯示GMSCs總體G2/M期所占比例為41.59%；亞群1、3、5、6、7、8、9的G2/M比例最低，提示這些亞群內(nèi)的細(xì)胞大多處于靜止期，細(xì)胞增殖能力低，其中亞群6的G2M期比例最低為16.44%；而亞群2（99.08%）、亞群4（78.93%）的G2/M期細(xì)胞所占比例明顯高于其它亞群，提示這些細(xì)胞大多處于分裂期，細(xì)胞增殖能力強。以上結(jié)果提示GMSCs包含的9個細(xì)胞亞群具有增殖的異質(zhì)性。

圖4 GMSCs亞群細(xì)胞周期與三系分化基因表達(dá)分析Fig.4 Analysis of cell cycle and three-line differentiation gene expression in GMSCs clusters

2.5 GMSCs多向分化能力異質(zhì)性分析

GMSCs的9個細(xì)胞亞群表達(dá)三系分化的基因差異結(jié)果顯示，成脂、成軟骨、成骨相關(guān)的基因表達(dá)在9個細(xì)胞亞群中的表達(dá)不完全相同（圖4-B-D）。其中，亞群7的相關(guān)基因表達(dá)與其余亞群具有較大不同，在本研究展示的基因中，其只高表達(dá)成脂相關(guān)基因CAV1與CD81。成軟骨相關(guān)基因在亞群9僅MEG3高表達(dá)。

2.6 GMSCs亞群差異表達(dá)基因分析

9個亞群具有不同的基因表達(dá)譜（圖5），對top表達(dá)的marker基因分析顯示，亞群2/4具有較高的相似性，相對高表達(dá)TOP2A、UBE2C、KPNA2、CENPF等基因；亞群3/6具有較高相似性，高表達(dá)HIST1H4C、HIST1H1B、CLSPN等基因；亞群5高表達(dá)DKK1、KRT7、ID1等基因；亞群9高表達(dá)MALAT1、FN1、NEAT1等基因。對不同亞群的基因進(jìn)行GO通路富集分析（圖6），亞群2/4主要與細(xì)胞分裂相關(guān)，亞群3與ATP代謝、鈣黏著蛋白附著、蛋白絲氨酸激酶活性相關(guān)，亞群5主要與胞外基質(zhì)組成、氧化應(yīng)激反應(yīng)、腺體發(fā)育相關(guān)，亞群6主要與G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合、受體配體活性、信號受體激活相關(guān)，亞群7/9與細(xì)胞黏附、胞外基質(zhì)組成相關(guān)，亞群8主要與胞外囊泡形成和分泌相關(guān)。

圖5 GMSCs亞群差異表達(dá)top基因heatmap圖Fig.5 Heatmap of differentially expressed top genes in GMSCs clusters

圖6 GMSCs亞群差異基因 GO 通路富集分析Fig.6 Analysis of GO pathway enrichment of GMSCs clusters differential genes

2.7 GMSCs各亞群之間受體配體互作情況

如圖7-A所示，在GMSCs各亞群中，亞群9與其他亞群間的通訊最為活躍，進(jìn)一步分析亞群9和其他亞群的受配體對相互作用，結(jié)果顯示其與亞群1-7在PROS1/AXL受體配體對的相互作用均較強，且亞群9與亞群7在多個受體配體對中均顯示了較強的作用，涵蓋了WNT通路、轉(zhuǎn)化生長因子及胞外基質(zhì)等相關(guān)的受體配體對，如WNT5A/FZD2、TGF-β1/TGFbR2、NOTCH2/IL-24等（圖7-B）。

圖7 GMSCs各亞群之間受體配體互作情況Fig.7 Interactions of receptors and ligands between different clusters of GMSCs

3 討論

MSCs具有多種優(yōu)良的特性，在組織工程、疾病治療等方面被寄予厚望。但是進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MSCs治療疾病的效果存在差異性［1,11］，嚴(yán)重影響了MSCs的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用，造成這種現(xiàn)狀的原因之一可能是MSCs內(nèi)部的功能異質(zhì)性。因此，深入分析MSCs內(nèi)部的功能異質(zhì)性，提高對MSCs細(xì)胞亞群的認(rèn)識對MSCs的精準(zhǔn)與有效應(yīng)用具有重要的意義。本研究利用scRNA-seq技術(shù)，首次對GMSCs的異質(zhì)性進(jìn)行分析。

本研究成功提取了人GMSCs，目前GMSCs的分離與培養(yǎng)方法比較成熟，本課題組前期已經(jīng)利用相同的方法提取到GMSCs并從形態(tài)、表面標(biāo)記物、多向分化等方面進(jìn)行了鑒定［8-10］，本文中的鑒定結(jié)果與前期結(jié)果相一致。單細(xì)胞分析顯示GMSCs內(nèi)部具有9個功能亞群，這些亞群在細(xì)胞增殖能力、多向分化能力等方面具有異質(zhì)性。對GMSCs細(xì)胞亞群的表面標(biāo)記物基因分析結(jié)果與常規(guī)的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果相同。既往研究顯示GMSCs具有較強增殖能力，且這種能力高于骨髓干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞［12-13］。本研究中對細(xì)胞周期檢測顯示，GMSCs的G2/M期占比為41.59%，高于經(jīng)單細(xì)胞測序研究的人羊水間充質(zhì)干細(xì)胞［14］、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞［15］等，與既往關(guān)于GMSCs增殖能力的研究結(jié)果相一致。但GMSCs各個亞群的具體比例不同，尤其是亞群2、4，具有高于其他亞群的G2/M期比例，說明GMSCs內(nèi)部存在增殖異質(zhì)性。

GMSCs的多向分化能力已經(jīng)被證實［6］，我們前期研究也證實GMSCs在體外可以向成脂、成骨、成軟骨向分化［8-10］。本研究對GMSCs單細(xì)胞測序分析顯示GMSCs亞群多向分化能力具有異質(zhì)性，其各細(xì)胞亞群相關(guān)基因的表達(dá)量有差異。這與鄭瑞婷等［14］的研究一致。此外，我們的研究顯示GMSCs亞群7的基因表達(dá)情況與其余亞群具有較大差異，可能是一類特殊的細(xì)胞群，尚需進(jìn)一步研究。

細(xì)胞通訊分析可以了解細(xì)胞與細(xì)胞之間的互作關(guān)系，解析細(xì)胞間通信網(wǎng)絡(luò)，揭示發(fā)育過程中各類細(xì)胞的相互作用、挖掘疾病潛在的治療靶點等。本研究中發(fā)現(xiàn)GMSCs亞群9與其他亞群間的通訊非?；钴S，因此，進(jìn)一步分析了亞群9和其他所有亞群的受體配體對相互作用，結(jié)果顯示其與亞群1-7在PROS1/AXL受配體相互作用均較強，且亞群9與亞群7在多個受體配體對中均作用較強，這些結(jié)果提示我們有必要針對亞群9及PROS1/AXL受配體在其中的作用深入探討，以明確其中潛在的生物學(xué)特性與作用。

對各個亞群表達(dá)的基因分析顯示，不同亞群的細(xì)胞基因表達(dá)譜、富集的生物學(xué)通路具有差異性。例如亞群2/4高表達(dá)細(xì)胞增殖相關(guān)的基因TOP2A、UBE2C、KPNA2等，GO通路富集分析也顯示亞群2/4主要與細(xì)胞分裂相關(guān)，這與對GMSCs亞群細(xì)胞周期分析的結(jié)果相一致。本研究與目前關(guān)于MSCs功能異質(zhì)性的研究相類似［16-17］，這些研究結(jié)果都證明了在MSCs內(nèi)部的功能異質(zhì)性及其可能的生物學(xué)基礎(chǔ)，同時也提示需要對MSCs的內(nèi)部異質(zhì)性進(jìn)行深入分析才能獲得需要的MSCs功能亞群及生物學(xué)作用，從而實現(xiàn)臨床的精準(zhǔn)應(yīng)用。

本研究為后續(xù)進(jìn)一步研究GMSCs的生物學(xué)特征以及相關(guān)的機制提供了研究基礎(chǔ)。但本研究也有一定的局限性，雖然初步分析了GMSCs亞群的異質(zhì)性，但為了對GMSCs的功能亞群進(jìn)行精準(zhǔn)定義，需要進(jìn)一步對各個亞群的具體功能及對應(yīng)的表面標(biāo)記物進(jìn)行確定，才能為GMSCs功能亞群的分選及精準(zhǔn)應(yīng)用提供參考。

4 結(jié)論

本研究基于單細(xì)胞水平分析了GMSCs的異質(zhì)性，證實了GMSCs存在不同的功能亞群，且各個亞群的基因組表達(dá)譜、增殖能力存在差異性，即GMSCs具有功能異質(zhì)性、增殖能力的異質(zhì)性，需進(jìn)一步研究各亞群的生物學(xué)特性為GMSCs精準(zhǔn)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。