盧 玲，翁 晨，鄧澤元，劉小如，李 靜

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330047）

巴氏殺菌乳、高溫滅菌乳和酸奶為最常見的乳制品，普遍存在脂肪聚集上浮的質(zhì)量問題。脂肪上浮程度較輕時(shí)，不會(huì)影響乳制品的營養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味，其理化性質(zhì)也不會(huì)出現(xiàn)較大的變化，但會(huì)影響消費(fèi)者的感官享受；脂肪上浮程度嚴(yán)重時(shí)，奶制品的色澤變暗、香味變淡，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)油脂蛤敗味，甚至?xí)霈F(xiàn)苦味，嚴(yán)重影響消費(fèi)者的購買欲望[1]。此外，乳脂肪聚集后在宏觀結(jié)構(gòu)上，如粒徑、電勢、比表面積方面有差異；在脂肪組成上，如極性脂質(zhì)的種類含量、脂質(zhì)分布、膽固醇含量也有差異。那么，聚集的乳脂肪與未聚集乳脂肪的消化吸收特性是否有差異，目前尚不明確。

本文采用靜態(tài)體外消化，模擬聚集與未聚集乳脂肪在體外胃腸道的消化，通過測定消化過程中乳脂肪顆粒粒徑、電勢、脂解速率的變化，探究熱加工后聚集乳脂肪與未聚集乳脂肪的消化特性。此外，通過給SD 大鼠灌胃聚集與未聚集乳脂肪，測定其糞便中脂肪的含量，獲得聚集和未聚集乳脂肪的生物利用率。通過測定大鼠血清和肝臟中甘油三酯（TG）和膽固醇（TC）的含量，獲得聚集和未聚集乳脂肪對大鼠血脂的影響，從而為提高乳制品質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

無水硫酸鈉（分析純）、其余化學(xué)試劑（分析純），購自上海西隴化工有限公司；豬胃蛋白酶（2 500 U/mg，分析純）、豬胰脂肪酶（350 U/mg，分析純）、甲酸銨（色譜純），購自上海Aladdin 有限公司；普通大鼠飼料，購自南昌福爾特飼料有限公司；甘油三酯測定試劑盒、膽固醇測定試劑盒，購自南京建成科技有限公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純），購自美國霍尼韋爾公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL-5-A 離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZ-A 振蕩恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Malvern MS3000 激光粒度分析儀和Malvern Nano ZSP 電位儀，英國Malvern 公司；DSY-VI 氮吹儀，北京東方精華苑科技有限公司；1260 高效液相色譜儀和色譜柱，美國Agilent 公司；Synergy HTX 多孔道酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 收集乳脂肪 將生牛乳于63 ℃下加熱30 min 進(jìn)行巴氏殺菌，收集聚集與未聚集乳脂肪。采用二氯甲烷-甲醇法提取乳脂肪[2]得巴氏殺菌普通乳脂肪。不同粒徑乳脂肪的分離參考羅潔[3]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。將牛乳沿壁緩慢倒入分液漏斗，于4 ℃下靜置數(shù)小時(shí)進(jìn)行重力分離，轉(zhuǎn)動(dòng)分液漏斗旋塞，使下層脫脂乳緩慢排出，收集上層乳脂肪層，即為聚集乳脂肪，又叫大粒徑乳脂肪球，將排出的脫脂乳在1 000 r/min、25 ℃下離心10 min，收集上層乳脂肪層，即為未聚集乳脂肪，又叫小粒徑乳脂肪球。

1.3.2 體外消化模擬

1.3.2.1 消化液的制備 胃液（Simulated Gastric Fluid，SGF）和腸液（Simulated Intestinal Fluid，SIF）的配制參考Minekus 等[4]的方法，具體組成見表1。

表1 消化液的配制Table 1 Preparation of SGF and SIF

1.3.2.2 模擬胃腸道消化 將巴氏殺菌普通乳脂肪、巴氏殺菌乳聚集脂肪和巴氏殺菌乳未聚集脂肪用PBS 將脂肪含量稀釋到2%，獲得初始消化樣品。消化方法參考梁麗[5]，稍作修改。取20 mL 樣品與20 mL 已預(yù)熱的SGF（終體系豬胃蛋白酶活性為400 U/mL）充分混合，調(diào)節(jié)pH 值至3，將反應(yīng)容器放入37 ℃水域搖床100 r/min 振蕩2 h。取上述反應(yīng)的胃消化物，調(diào)節(jié)pH 值至7 終止反應(yīng)。加入已預(yù)熱的SIF 和膽鹽溶液，調(diào)節(jié)pH 值至7。快速加入胰脂肪酶（終體系酶活為140 U/mL），放入37 ℃水域搖床100 r/min 振蕩2 h。pH 值體系恒定在7，采用滴定方法測定體系消耗NaOH 體積。

1.3.3 消化產(chǎn)物表征

1.3.3.1 粒徑的測定 測定參考Lopez 等[6]的方法。樣品在25 ℃下用激光粒度分析儀測定乳脂肪顆粒粒徑，設(shè)置激光粒度分析儀測定波長為633 nm，散射角度為90°，溶劑為蒸餾水，乳脂肪顆粒的折射率為1.458，蒸餾水的折射率為1.333，黏度值1.002 mPa·s。乳脂肪顆粒粒徑的分布通過計(jì)算粒子大小的體積分?jǐn)?shù)獲得。

1.3.3.2 ζ-電勢的測定 測定參考Lopez 等[6]的方法。對樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在25 ℃下用zeta 電位分析儀測定乳脂肪顆粒的ζ-電勢，設(shè)置電位儀測定波長為633 nm，乳脂肪球的折射率為1.458，折光指數(shù)為1.33。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)平行。

1.3.3.3 脂肪酸釋放速率測定 模擬小腸消化過程中，用滴定法記錄2 h 內(nèi)體系NaOH 消耗情況，進(jìn)而釋放的脂肪酸量通過公式（1）計(jì)算[3]：

式中：MFFA——單位體積樣品釋放脂肪酸的量，μmol/mL；VNaOH——消耗的NaOH 體積，mL；mNaOH——NaOH 的濃度，0.15 mol/L；V——腸消化階段樣品的體積（根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算）。

1.3.4 乳脂肪體內(nèi)的生物利用

1.3.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級SD 雄性大鼠，6 周齡，體重為250～280 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（SCLK（湘）2019-0004）。

1.3.4.2 動(dòng)物分組 將15 只大鼠隨機(jī)分為3 組，每組5 只，按成人每日推薦乳制品攝入量300 g/d計(jì)，乳中含有約3%脂肪，灌胃劑量為985.238 mg/kg 體重。

設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分組：1）普通乳脂肪組：以985.238 mg/kg 體重的劑量灌胃巴氏殺菌普通乳脂肪；2）聚集乳脂肪組：以985.238 mg/kg 體重的劑量灌胃巴氏殺菌乳聚集乳脂肪；3）未聚集乳脂肪組：以985.238 mg/kg 體重的劑量灌胃巴氏殺菌乳未聚集乳脂肪。

1.3.4.3 動(dòng)物處理 15 只SD 雄性大鼠飼養(yǎng)于南昌大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)期間自由攝食飼料和水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。在灌胃后2，4，6 h 于大鼠尾部取血于離心管中，靜置分層后于4 ℃，2 500 g 離心10 min，吸取上層血清，-80 ℃凍存。灌胃6 h 后，將所有大鼠處死，取肝臟、胃、消化道組織，并用生理鹽水沖洗干凈，收集消化道內(nèi)容物和糞便，于-80 ℃凍存。

1.3.4.4 指標(biāo)測定 按照試劑盒說明書測定2，4，6 h 血清和肝臟中甘油三酯、膽固醇含量。

糞便脂肪含量測定：采用二氯甲烷-甲醇法提取乳脂肪[2]，具體如下：乳脂肪與二氯甲烷/甲醇（體積比2∶1）以1 ∶20 混合，再加入0.2 倍體積溶質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%氯化鈉溶液，渦流，4 000 r/min離心10 min。取下層有機(jī)相過無水硫酸鈉，氮吹至全干。脂肪排泄率按照公式（2）計(jì)算：

式中：P——排泄率，%；m總——攝入脂肪含量，g；m排——排泄物的脂肪含量，g。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次。采用SPSS20.0 軟件（SPSS Inc，2008）對數(shù)據(jù)的均值、標(biāo)準(zhǔn)差和顯著性差異進(jìn)行分析，單因素方差分析采用Duncan 法（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外消化過程中聚集乳脂肪和未聚集乳脂肪粒徑和電勢的變化

通過靜態(tài)體外消化模型探究聚集與未聚集乳脂肪的消化差異，經(jīng)體外消化后乳液粒徑的變化見圖1。普通乳脂肪、聚集乳脂肪和未聚集乳脂肪的初始平均粒徑分別為3.99，4.54，2.80 μm。經(jīng)過胃消化模擬后，聚集脂肪組和未聚集脂肪組樣品較初始階段平均粒徑顯著增大（P＜0.05），普通乳脂肪組變化不顯著。被蛋白質(zhì)包裹的脂肪在胃中容易聚集，胃液的酸性壞境、離子濃度和酶的作用也是引起脂肪顆粒聚集形成凝塊的因素[7-8]。經(jīng)腸消化后，3 組樣品乳液的平均粒徑均顯著減小（P＜0.05），該結(jié)果表明胃消化階段形成的大顆粒在小腸階段被水解，并且未聚集乳脂肪顆粒粒徑下降的幅度大于聚集乳脂肪顆粒，表明未聚集乳脂肪水解程度更大，聚集乳脂肪水解程度更小，不容易被消化。但聚集脂肪組和未聚集乳脂肪組的腸消化物粒徑比初始階段平均粒徑大，表明有部分腸消化物產(chǎn)物聚集。

圖1 消化階段粒徑變化Fig.1 Changes in particle size during digestion

乳脂肪在模擬消化階段的電勢變化如圖2 所示。初始階段所有樣品乳脂肪表明均帶負(fù)電荷，ζ-電勢分別為-10.15，-7.14，-4.67 mV。經(jīng)胃消化后，普通乳脂組ζ-電勢顯著降低（P＜0.05），聚集乳脂肪組和未聚集乳脂肪組電勢由負(fù)轉(zhuǎn)正，且兩組樣品無顯著性差異。乳液表面電勢由負(fù)轉(zhuǎn)正可能是胃液的酸性pH 值低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，并賦予顆粒大量正電荷，電勢高于電中性。經(jīng)腸消化后，所有樣品均具有較高的負(fù)電勢，普通乳脂組表面電勢進(jìn)一步顯著降低（-59.10 mV，P＜0.05），聚集乳脂肪組和未聚集乳脂肪組電勢由胃消化階段的正電性轉(zhuǎn)為強(qiáng)負(fù)電性（-46.90 mV 和-56.60 mV），各組樣品之間無顯著性差異。腸消化階段較高的負(fù)電性可能是由于膽鹽和游離脂肪酸附著在脂肪球表面造成的[9-10]。電勢降低幅度越大表明乳脂肪水解程度越大[9]，聚集乳脂肪組的電勢降低幅度小于未聚集乳脂肪組，表明聚集乳脂肪的水解程度弱于未聚集乳脂肪組，進(jìn)一步反映出聚集與未聚集乳脂肪的消化差異。

圖2 消化階段ζ-電勢變化Fig.2 Changes in ζ-potential during digestion

2.2 體外消化過程中聚集乳脂肪和未聚集乳脂肪總脂肪酸釋放動(dòng)力學(xué)的變化

通過計(jì)算腸消化階段脂肪球消耗NaOH 的量，反映脂肪球釋放動(dòng)力學(xué)，結(jié)果如圖3 所示。胃消化為腸消化中胰脂肪酶的水解提供了完美條件，使乳脂肪進(jìn)入腸消化階段快速脂解，反應(yīng)由胰脂肪酶和膽鹽共同完成。在腸消化0～5 min 時(shí)，脂肪酸釋放量近似呈線性關(guān)系，3 組樣品初始消化斜率大小為：普通乳脂肪≈未聚集乳脂肪＞聚集乳脂肪，前25 min，脂肪酸釋放量快速增加，達(dá)到第1個(gè)平衡值，聚集乳脂肪組脂肪酸釋放量低于其余2組。普通乳脂肪組在25～35 min 時(shí)脂肪酸釋放量快速增加，此后達(dá)到相對平衡。聚集乳脂肪組脂肪酸釋放增多，在35～75 min 達(dá)到第2 個(gè)平衡值，釋放量低于其余2 組；75～105 min 脂肪酸持續(xù)釋放，并在105 min 后進(jìn)入相對平衡狀態(tài)。未聚集乳脂肪組在75 min 達(dá)到第2 個(gè)平衡值后，繼續(xù)釋放脂肪酸，在90 min 進(jìn)入相對平衡狀態(tài)。75～105 min時(shí)的脂肪酸釋放速率放緩，小于初始速率。隨著時(shí)間的變化酶解速率放緩，一方面是由于脂肪含量減少，酶促反應(yīng)速率減慢，另一方面是由于酶解在脂肪球表面生成大量酶解產(chǎn)物和蛋白質(zhì)聚集，界面逐漸趨于飽和阻止脂肪酶接觸，最終脂肪酸釋放達(dá)到平衡。聚集乳脂肪初始粒徑最大，導(dǎo)致其在90 min 內(nèi)水解程度低于普通乳脂肪組和未聚集乳脂肪組。粒徑大小造成比表面積差異，進(jìn)一步影響脂肪酶的結(jié)合位點(diǎn)，使之最慢達(dá)到最終脂肪酸釋放平衡，但不影響最終脂肪的釋放。Martine 等[11]研究了組成相同粒徑不同的兩種腸溶劑對人體膳食脂肪消化吸收的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小粒徑溶劑的脂解程度高于大粒徑。Garcia 等[12]的研究也有相同的結(jié)論，小脂肪球較高的脂質(zhì)界面區(qū)域，增加脂肪酶結(jié)合位點(diǎn)，使之更有效地被酶水解。

圖3 腸消化階段脂肪酸釋放動(dòng)力學(xué)Fig.3 Fatty acids release during intestinal digestion

2.3 聚集乳脂肪和未聚集乳脂肪脂肪排泄率的差異

脂肪經(jīng)消化吸收后，一部分經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)器官實(shí)現(xiàn)生物利用，未被吸收部分隨糞便排出體外。排泄物中的脂肪含量可以說明其生物利用率的高低。收集大鼠糞便測定脂肪含量，并計(jì)算脂肪排泄率，結(jié)果如圖4 所示。普通乳脂肪組脂肪的排泄率為5%，聚集乳脂肪的排泄率為8.68%，未聚集乳脂肪的排泄率為6.66%。與普通乳脂肪組相比，聚集乳脂肪與未聚集乳脂肪的排泄率偏高，表明聚集乳脂肪生物利用率最低，乳脂肪的吸收利用受到脂肪粒徑大小的影響。結(jié)合體外消化的試驗(yàn)結(jié)果，聚集的乳脂肪影響了乳脂肪的消化與吸收。

圖4 脂肪的排泄率Fig.4 Excretion rate of fat

2.4 聚集乳脂肪和未聚集乳脂肪對大鼠血清甘油三酯和膽固醇的影響

由前述結(jié)果可知，聚集與未聚集乳脂肪在胃腸消化過程中，具有不同的消化特性，這些差異可能會(huì)造成脂肪體內(nèi)吸收和生物利用度的不同。脂肪經(jīng)消化加工后進(jìn)入淋巴循環(huán)，參與體循環(huán)，吸收的差異最直觀的體現(xiàn)在血脂中。采用SD 大鼠，灌胃聚集與未聚集乳脂肪，觀察灌胃后血清中甘油三酯和膽固醇含量隨時(shí)間的變化，結(jié)果如圖5 所示。灌胃2 h 后，聚集乳脂肪組血清中甘油三酯含量低于普通乳脂肪組。與聚集乳脂肪組相比，未聚集乳脂肪組影響了大鼠血清甘油三酯含量。灌胃4 h 后，血清甘油三酯含量減少，但聚集乳脂肪組血清甘油三酯含量變化不顯著；未聚集乳脂肪組血清中甘油三酯含量顯著低于普通乳脂肪組（P＜0.05）。灌胃6 h 后，3 組樣品血清甘油三酯含量進(jìn)一步減少，具有顯著性差異（P＜0.05）。灌胃普通乳脂肪后，大鼠血清中膽固醇水平隨時(shí)間呈現(xiàn)下降趨勢，聚集乳脂肪和未聚集乳脂肪對血清膽固醇影響較小。在6 h 時(shí)，聚集乳脂肪組血清膽固醇含量顯著高于未聚集乳脂肪（P＜0.05），可能是因?yàn)榫奂橹镜南俣嚷谖淳奂橹荆c2.3節(jié)試驗(yàn)結(jié)論一致。Michalski 等[13]的研究報(bào)道灌胃不同粒徑脂肪的大鼠血清膽固醇水平無顯著性差異。與2.4 節(jié)結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，灌胃6 h 后，聚集乳脂肪組糞便脂肪排出量增加，而血脂水平還明顯升高的原因在于乳脂肪的聚集不僅僅影響乳脂肪的消化吸收，還會(huì)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。

圖5 大鼠血清甘油三酯和膽固醇含量變化Fig.5 Changes in serum triglyceride and cholesterol in rats

2.5 聚集乳脂肪和未聚集乳脂肪對大鼠肝臟甘油三酯和膽固醇的影響

肝臟是脂肪合成和代謝的重要器官，可進(jìn)一步促進(jìn)物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化。大鼠灌胃不同聚集程度乳脂肪6 h 后，將大鼠處死后取肝臟，測定肝臟甘油三酯和膽固醇的分布，結(jié)果如圖6 所示。攝入乳脂肪6 h 后，聚集乳脂肪組和未聚集乳脂肪組大鼠肝臟甘油三酯和膽固醇含量顯著低于普通乳脂肪組（P＜0.05），而聚集乳脂肪組肝臟甘油三酯和膽固醇水平最低，且對血液甘油三酯含量影響最小（2.5 節(jié)結(jié)果），可能表明聚集乳脂肪的吸收轉(zhuǎn)化率較低。

圖6 大鼠肝臟甘油三酯和膽固醇含量變化Fig.6 Changes of triglyceride and cholesterol in rat liver

3 結(jié)論

本文通過體外胃腸道消化模型和大鼠灌胃實(shí)驗(yàn)，探討了聚集乳脂肪和未聚集乳脂肪對其消化和吸收以及對大鼠脂質(zhì)代謝方面的特征差異，在體外消化過程中，脂肪粒徑隨消化階段均有較大變化，聚集乳脂肪組的電勢變化幅度小于未聚集乳脂肪組。聚集乳脂肪的脂肪酸初始釋放速率和釋放程度均小于普通乳脂肪，表明聚集乳脂肪的消化程度弱于普通乳脂肪。大鼠灌胃實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聚集乳脂肪組糞便中脂肪排泄率顯著高于未聚集乳脂肪組（P＜0.05），表明聚集乳脂肪生物利用率較低。灌胃6 h 后，與未聚集乳脂肪組相比，聚集乳脂肪組能顯著升高大鼠血清甘油三酯和膽固醇（P＜0.05），但顯著降低大鼠肝臟甘油三酯和膽固醇的含量（P＜0.05），說明聚集乳脂肪能顯著影響大鼠脂質(zhì)代謝。