王曉萌，韓張鵬，李佳樂，付夢琪，桑亞新，高 潔

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 河北保定 071000）

表層蛋白（Surface layer protein，SLP）是一種由蛋白質(zhì)或糖蛋白亞基組成的（糖）蛋白包膜，亞基自組裝形成二維晶格，覆蓋在不同種類的細菌和古細菌的表面[1]。SLP 晶格類型的示意圖見圖1，晶格顯示為斜（p1，p2）、方（p4）或六邊形（p3，p6）對稱的規(guī)則陣列，形態(tài)單元的中心到中心間距約為3 nm 到35 nm，其中六方晶格對稱性在古生菌中占主導(dǎo)地位，詳見圖1[2]。研究發(fā)現(xiàn)SLP 廣泛存在于古細菌、真細菌和某些革蘭氏陽性乳酸菌中[3]。乳酸菌的SLP 具有高度保守性、組成性表達和表面定位特性[4]，這些特性在許多領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，如精確的分子篩，超濾膜，自組裝系統(tǒng)，表面識別，生物傳感器，免疫測定等。隨著相關(guān)研究的不斷增多，近年來乳酸菌SLP 生物技術(shù)功能被學(xué)術(shù)界廣泛研究發(fā)掘：SLP 可以維持細胞形態(tài)，為菌體提供保護層的功能；SLP 可以識別并介導(dǎo)混菌體系菌相共生，介導(dǎo)對腸道的黏附能力，在菌間起"橋梁"作用；SLP 的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)用在疫苗中，以及佐劑的輔助作用；SLP 的高效表達和分泌應(yīng)用于表達載體和工程菌的構(gòu)建；SLP 應(yīng)用在納米技術(shù)諸多領(lǐng)域。通過對知網(wǎng)、Web of Science 和Science Direct 等數(shù)據(jù)庫的檢索發(fā)現(xiàn)，在SLP 的功能研究中，識別黏附能力以及免疫調(diào)節(jié)作用為主要研究熱點?；谝延醒芯?，本文綜述乳酸菌SLP主要功能的研究進展，并從作用途徑或物質(zhì)基礎(chǔ)的角度歸納總結(jié)，較為系統(tǒng)地闡釋乳酸菌SLP 的功能活性、可能的作用機制以及可能的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 SLP 對菌體細胞的支撐和保護作用

維持細胞形態(tài)并為菌體提供保護層是乳酸菌SLP 的基本功能。SLP 的厚度為5～25 nm，為維持細菌細胞形態(tài)提供膠囊狀保護[6]，微生物通過最外層的SLP 與環(huán)境直接接觸，并能夠完全覆蓋微生物在其生長的所有階段[7]，SLP 可以保護細菌細胞免受環(huán)境有害因素的影響，包括環(huán)境pH 值的變化、機械和滲透脅迫[8]，抗菌肽或溶菌酶、輻射、噬菌體和其它微生物捕食者[7]，Satio 等[9]認為在低pH值（pH＜4）條件下，短乳酸菌（Lactobacillus brevis）最外層的SLP 減少可能是因為酸性環(huán)境觸發(fā)了SLP 與細胞表面的部分分離，失去SLP 的保護作用會使短乳酸菌形態(tài)發(fā)生變化，引起短乳酸菌自聚集。SLP 已被證明對測定或維持細胞形狀和作為分子篩的功能至關(guān)重要，Klotz 等[4]研究發(fā)現(xiàn)刪除SLP 基因的嗜酸乳桿菌 NCK2532 突變體（Lactobacillus acidophilus NCK2532）經(jīng)電穿孔試驗后細胞表面損壞程度明顯大于未刪除SLP 基因的菌體，并認為這種差異是由于SLP 對菌體的維持和保護作用帶來的，還發(fā)現(xiàn)SLP 基因的刪除可能嚴重降低菌體細胞的黏附能力并改變其免疫原性。此外，S 層還可以作為輔助蛋白和糖蛋白的外部展示支架以維持細胞的形態(tài)。

2 SLP 在菌間互作的“橋梁”作用

益生菌的固有黏附性能有利于它們的駐留和定植于表面結(jié)構(gòu)。SLP 可能是細菌和宿主免疫系統(tǒng)之間的關(guān)鍵中介，有助于形成對病原微生物、共生微生物和益生菌的駐留、定植和免疫調(diào)節(jié)[10-11]，SLP 在乳酸菌的識別和黏附作用中有著重要的“橋梁”作用。

2.1 SLP 的識別黏附能力介導(dǎo)混菌體系菌相共生

SLP 的保守區(qū)域、結(jié)構(gòu)功能甚至表達與否都具有菌株特異性，因此，在不同菌相間的識別機制不同[12]，由乳酸菌與酵母菌相互作用構(gòu)成的混菌發(fā)酵體系十分常見，引起了學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注。

甘露聚糖覆蓋在酵母菌表面，對酵母菌與外界環(huán)境的識別和交互作用具有重要意義，識別甘露聚糖殘基是乳酸菌實現(xiàn)黏附的重要途徑[13]，乳酸菌SLP 與酵母菌甘露聚糖的黏附機制見圖2。Pretzer 等[14]測定了14 株副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）以甘露聚糖特異性黏附素（mannose-specific adhesin，Msa）凝聚釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的能力，通過對Msa 蛋白的結(jié)構(gòu)域同源性分析，鑒定出了已知基因序列l(wèi)p_1229 的糖結(jié)合域，進一步支持其作為甘露糖黏附素的作用，此外，Pretzer 還發(fā)現(xiàn)Msa 參與了植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對釀酒酵母的聚集能力以及與其宿主在腸道的上皮細胞的特異黏附作用。Yamasaki-yashiki 等[15]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ATCC 334 與釀酒酵母IFO0216 的共培養(yǎng)誘導(dǎo)了在純培養(yǎng)中觀察不到的特異性聚集反應(yīng)，SLP 通過特異性識別酵母甘露聚糖與釀酒酵母接觸后，可以誘導(dǎo)植物乳桿菌轉(zhuǎn)運蛋白基因表達，即乳酸菌和酵母的直接接觸能夠上調(diào)SLP 及轉(zhuǎn)運蛋白基因表達水平。Marina 等[16]探究發(fā)現(xiàn)甘露聚糖在酵母細胞表面形成一個膠囊狀結(jié)構(gòu)，細菌可能通過SLP 的凝集素樣活性與囊內(nèi)的甘露聚糖結(jié)合。凝集樣活性是細菌產(chǎn)生的拮抗化合物來限制微生物競爭對手的生長的物質(zhì)，其包括分泌的抗菌肽、蛋白質(zhì)和多蛋白復(fù)合物[17]。外源甘露聚糖的加入會與酵母菌表面甘露聚糖競爭SLP 結(jié)合位點，而使凝集反應(yīng)受到抑制，表明細菌SLP 在這種相互作用中發(fā)揮了重要作用，由此推斷高加索乳桿菌（Lactobacillus kefiri）和解脂假絲酵母（Saccharomyces lipolytica）混菌體系之間通過SLP 和甘露聚糖相互識別并作用。

圖2 乳酸菌與酵母菌的黏附共生機制Fig.2 The symbiosis mechanism of adhesion in Lactobacillus and Saccharomyces

2.2 SLP 識別黏附能力介導(dǎo)菌體與宿主細胞的相互作用

乳酸菌SLP 最主要的功能是介導(dǎo)菌體與不同表面黏附，如菌株間的自聚集、不同菌株間的共聚集、對腸上皮細胞的黏附等[18]。不僅如此，其所介導(dǎo)的黏附還能夠發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，既能促進腸道定殖發(fā)揮有益作用，也能參與抑制致病菌的附著。

2.2.1 SLP 對腸道黏附發(fā)揮有益作用 S 層最重要的功能之一是調(diào)節(jié)細菌對各種靶點的黏附，利用上皮細胞、膠原蛋白和纖維連接蛋白能夠篩選具有高黏附能力的益生菌[19]。Zhilan 等[20]研究發(fā)現(xiàn)卷曲乳桿菌K313（Lactobacillus crispatus K313）SlpB 的非翻譯前導(dǎo)序列（UTLS）作為黏附結(jié)構(gòu)域參與該菌株對人腸道細胞系HT-29 的黏附。Feng等[21]對清酒乳桿菌PO11（Lactobacillus sakei PO11）和植物乳桿菌PO23（Lactobacillus plantarum PO23）的黏附能力進行了研究，經(jīng)LiCl 處理去除SLP 后，清酒乳桿菌PO11 和植物乳桿菌PO23 對腸上皮細胞的黏附均顯著降低，此外，扁口魚經(jīng)口服益生菌處理后，植物乳桿菌PO23 定殖率約為未益生菌處理水平的548 倍，因此植物乳桿菌 PO23 被認為是潛在的乳酸菌益生菌，對腸道黏附發(fā)揮有益作用。表明高黏性乳酸菌和SLP 在黏附定殖同樣起重要作用。

2.2.2 SLP 黏附能力對致病菌抑制作用 乳酸菌SLP 形成細菌的最外層，通過黏附作用可能有助于抑制致病微生物對宿主的附著，表達SLP 的菌株可以更有效的競爭排除病原體，這種競爭排斥是免疫調(diào)節(jié)的重要途徑之一[22]。Wenming 等[22]從卷曲乳桿菌ZJ001（L.crispatus ZJ001）或瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticusc）中提取的SLP 可以抑制鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）和大腸桿菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）的黏附[23]，此外Zhang 研究發(fā)現(xiàn)相較于未去除SLP的乳酸菌，由5 M LiCl 處理去除SLP 的乳酸菌對致病菌的抑制程度顯著降低，其中羅氏乳桿菌ZJ617（Lactobacillus reuteri ZJ617）在其研究的5種乳酸菌中對大腸桿菌 k88 的黏附抑制率最有效，可高達為33%，并發(fā)現(xiàn)乳酸菌黏附能力與對病原菌的抑制程度成正比。Li 等[24]對嗜酸乳桿菌ATCC4356SLP 的抑菌活性進行了研究，SLP 可直接與Caco-2 細胞系結(jié)合或與鼠傷寒沙門氏菌表面結(jié)合，從而阻斷沙門氏菌附著，能夠降低二者之間69%～88%的關(guān)聯(lián)性。Prado Acosta 等[25]認為乳酸菌的SLP 可以通過阻斷樹突狀細胞表面黏附因子3 結(jié)合非整合素分子（DC-SIGN）細胞受體，從而抑制細菌感染，嗜酸乳桿菌使用DC-SIGN 作為一種黏附因子，可以與腸道中某些桿菌的SLP 脂多糖組分結(jié)合，嗜酸乳桿菌的S 層被證明與DCSIGN[26]受體結(jié)合，這種相互作用啟動抗原呈遞和隨后的免疫應(yīng)答[27]。用SLP 處理表達DC-SIGN 的細胞后，能夠在革蘭氏陰性和分枝桿菌模型中減少高達79%的細菌感染。SLP 的這種新特性可能有助于解釋這些乳桿益生菌株的病原體排除活性，也可作為一種新型的酶抗菌劑來抑制細菌感染和進入宿主細胞。

3 SLP 的免疫調(diào)節(jié)作用

乳酸菌作為益生菌可以調(diào)節(jié)和刺激免疫反應(yīng)，對健康有益[28]，乳酸菌SLP 可能是其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)之一[29]。一些乳酸菌SLP 初級結(jié)構(gòu)是可變的并參與免疫調(diào)節(jié)[30]，通過調(diào)節(jié)細胞因子水平來調(diào)控免疫應(yīng)答是SLP 免疫調(diào)控的重要途徑。此外，SLP 具有的佐劑能力和抗原表位呈遞功能，能夠為疫苗的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

3.1 SLP 對細胞因子的調(diào)控作用

乳酸菌SLP 可以通過調(diào)節(jié)細胞因子水平實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)，Abramov 等[31]以彎曲乳桿菌2029（Lactobacillus crispatus 2029）為試驗菌株，以同源基因中的Slp2 為主要研究對象經(jīng)ELISA 法定量測定細胞因子的產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)Slp2 蛋白和彎曲乳桿菌2029 細胞均可誘導(dǎo)Caco-2 和HT-29 細胞中的NF-kB 信號通路的激活，并能夠抑制巨噬細胞產(chǎn)生的IL-8 和增加抗炎細胞因子IL-6、CXCL1和RANTES 的產(chǎn)生。不僅如此，它們還參與誘導(dǎo)腸道上皮細胞中caspase 9 和caspase 3 的激活和凋亡的發(fā)生，從而保護上皮細胞單層免受食源性病原體的直接作用。Ksenijia 等[32]發(fā)現(xiàn)含有SLP 的短乳酸桿菌與樹突狀細胞（moDC）作用后，moDC 的白細胞介素的產(chǎn)生保持不變，TNF-α 的產(chǎn)生受到誘導(dǎo)。盡管屬于TNF-α 超家族的細胞因子與炎癥性疾病的發(fā)生有關(guān)，但短暫的炎癥狀態(tài)有助于宿主防御，它們的誘導(dǎo)有益于免疫細胞間的相互作用，而且不會引起疾病或有害影響[33]。Johnson 等[34]通過體外嗜酸乳桿菌NCFM 與小鼠樹突狀細胞（DC）共孵育試驗來評估△prtX 株相對于野生株的免疫調(diào)節(jié)潛能。PrtX 是一個S 層特定的絲氨酸蛋白酶同源物，嗜酸乳桿菌NCFM（Lactobacillus acidophilus NCFM）染色體中prtX 的缺失使抗炎細胞因子IL-10 在體外小鼠樹突狀細胞中的表達提高兩倍，而雖然促炎細胞因子IL-12 維持不變，但△prtX 組相較于野生組IL-10/IL-12 的比值顯著升高，其中抗炎細胞因子占據(jù)主導(dǎo)地位，表明SLP 的免疫調(diào)節(jié)作用顯著。

3.2 SLP 在疫苗研發(fā)中的作用

SLP 能介導(dǎo)菌體與宿主細胞的免疫增強和抗原呈遞作用，結(jié)合其自組裝特性及獨特的物理化學(xué)性質(zhì)可用于疫苗研發(fā)。疫苗包含部分致病因子、免疫增強劑或佐劑[35]，在SLP 疫苗中，SLP 作為一個有吸附力的工具充當(dāng)抗原或半抗原載體，可成為輔助疫苗接種的一部分[36]，因此SLP 的佐劑能力以及抗原表位呈遞作用使其在疫苗研發(fā)中具有非凡潛力。

3.2.1 SLP 具有的佐劑能力 SLP 能與免疫細胞相互作用是其充當(dāng)新佐劑的重要原因之一[36]。Luo等[6]選擇制備以花生為主要過敏原的多肽的載體疫苗，并以布氏乳桿菌CD034（Lactobacillus buchneri CD034）SLP 作為佐劑，用于治療由IgE引起的超敏反應(yīng)，采用10 份成人血清預(yù)孵育后IgE 的平均抑制率為（19.3±11.53）%，高于疫苗lgE平均抑制率，說明SLP 在細胞免疫作為佐劑的效果顯著。目前，疫苗佐劑發(fā)揮體液或抗體介導(dǎo)的保護機制為主，然而，許多困擾人類和動物的疾病，如結(jié)核病和瘧疾，都需要細胞介導(dǎo)的免疫才能提供足夠的保護[35]，因此，作為細胞免疫佐劑，SLP 可以發(fā)揮其最大助力作用。

3.2.2 SLP 的抗原表位呈遞作用 SLP 作為“橋”是具有良好生物穩(wěn)定性的包覆體，這歸因于“配體-受體相互作用” 效應(yīng)，SLP 包覆體極有可能成為藥物傳遞和生物醫(yī)學(xué)用途的理想平臺。乳酸菌SLP 因其易獲得、安全性高等特性，是疫苗開發(fā)中作為抗原表位載體的極佳候選材料[37]。Julia 等[37]制備了布氏乳桿菌CD034 的融合蛋白SlpBAH3a42，該肽由免疫顯性的B 細胞表位和一個T細胞表位組成，檢測花生過敏患者血清中抗SlpBAH3a42 或Ara h2 特異性IgG 兔抗體對IgE 結(jié)合的抑制能力，血清中有69%檢測到SlpB-AH3a42融合蛋白特異性IgE，這種新方法開發(fā)為SLP 呈遞抗原表位的新型疫苗的可行性提供了依據(jù)。Knobloch 等[38]利用含有重組蛋白的干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、短乳酸桿菌等乳酸菌進行免疫標(biāo)記試驗，認為上述乳酸菌可以異源表達和高效分泌來自巴氏芽孢八疊球菌（Sporosarcina ureae ATCC 13881）的血細胞凝集素表位標(biāo)記型表層蛋白SslA，構(gòu)建了3 個嵌合蛋白，包括人流感血凝素表位標(biāo)記的表層蛋白SslA 的前體、C 末端殘基和N 端、C 末端殘基形式，分離出的SLP 是含有融合血細胞凝集素標(biāo)記的高度有序結(jié)構(gòu)，能夠在體外結(jié)晶、可被抗體識別。由此可見，細菌或細胞表面的SLP 能夠高密度、精確定位的呈現(xiàn)功能表位。

4 SLP 在工程菌的構(gòu)建中高效表達和分泌作用

工程菌的構(gòu)建在蛋白質(zhì)的研究中發(fā)揮巨大作用，然而基因表達系統(tǒng)往往產(chǎn)生低水平的重組蛋白，高效分泌表達成為迫切需求[39]。SLP 通過各種機制固定在細胞壁上或釋放分泌到周圍的介質(zhì)中[40]，乳酸菌SLP 基因存在多啟動子結(jié)構(gòu)，具有高效表達的特性。不僅如此，乳酸菌SLP 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性也有助于SLP 的高水平翻譯[41]。

4.1 SLP 高效表達在工程菌株構(gòu)建中的作用

Kahala 等[42]以短乳酸桿菌SlpA 基因的表達信號為基礎(chǔ)，利用β-葡萄糖苷酶（gusA）、熒光素酶（luc）和氨肽酶N（pepN）3 個報告基因?qū)氲涂截悢?shù)載體pKTH2095，構(gòu)建表達載體并研究SlpA啟動子在乳球菌、植物乳桿菌和加氏乳桿菌中生產(chǎn)報告基因相應(yīng)蛋白的效率，短乳酸桿菌的SlpA基因的表達信號起著非常強的啟動子的作用，最終的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高達細胞內(nèi)總蛋白的50%，比常規(guī)乳酸菌表達高35%～40%[20]。外源蛋白在細菌中成功表達的關(guān)鍵因素之一是高效啟動子的選擇，Lizier 等[43]研究了3 種不同乳酸菌的啟動子在乳酸乳球菌（Lactobacillus lactis）中驅(qū)動增強型綠色熒光蛋白（EGFP）表達的能力大小，3 種啟動子中羅伊氏乳桿菌來源的啟動子GFP 表達量最高，帶有slp-GFP 載體的乳酸乳球菌的GFP 表達量明顯高于未帶有SLP 的載體，選擇有效啟動子和SLP 的輔助作用均可以得到高效表達目的基因的乳酸菌類工程菌。

4.2 SLP 的高效分泌在基因表達載體構(gòu)建中的作用

乳酸菌的胞外蛋白主要由SLP 和釋放到胞外的胞內(nèi)分泌蛋白組成[44]。細菌會將過量產(chǎn)生的SLP儲存在肽聚糖層或分泌到環(huán)境中，SLP 的分泌能力與其N 端信號肽密切相關(guān)。Lin 等[39]以來自乳酸乳球菌的β-1，4-甘露聚糖酶（ManB）基因作為報告基因，構(gòu)建了包含SlpA 蛋白和信號肽（SPSlpA）的載體，研究對載體驅(qū)動ManB 基因在乳酸乳球菌中的表達能力進行了評估，結(jié)果表明SPSlpA不僅被乳酸乳球菌分泌機制功能性識別和加工，而且SPSlpA分泌的ManB 的效率高達80%，SPSlpA可以同時輸出分泌的和錨定的ManB，表明SPSlpA和全長的SlpA 可能是一個很好的輸出信號或細胞表面的候選。Axel 等[45]將編碼短乳酸桿菌表層蛋白（SlpA）的ORF 克隆到乳酸乳球菌中，發(fā)現(xiàn)SlpA蛋白的相對含量與生長期有關(guān)，誘導(dǎo)22 h 后（穩(wěn)生期）SlpA 表達水平最高，分泌量增加到初始水平的8 倍以上，SlpA 的高效表達極大程度的增加構(gòu)建表達載體的成功率和目標(biāo)基因的表達量，短乳酸桿菌的高效生產(chǎn)和分離SLP 在生物技術(shù)上也有著廣泛應(yīng)用，它為生產(chǎn)S 層穩(wěn)定脂質(zhì)體提供藥物傳遞和定點肽表位固定化等方面開辟了新的可能性。

5 SLP 在納米技術(shù)中的應(yīng)用

乳酸菌SLP 的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)重復(fù)性、均勻性均達到亞納米尺度，現(xiàn)如今已經(jīng)應(yīng)用在生物技術(shù)和仿生學(xué)中[46-47]。乳酸菌SLP 的織物/纖維及其獨特結(jié)構(gòu)的研發(fā)，為乳酸菌SLP 的仿生能力應(yīng)用在紡織品中提供了黃金機遇，Asadi 等[48]利用嗜酸乳桿菌ATCC 4356 細菌的SLP 在紡織品表面成功重結(jié)晶，發(fā)現(xiàn)在30 min、pH 值為5 時聚丙烯織物具有最佳復(fù)合性能。目前S 層通過模仿古生菌或病毒的超分子表面結(jié)構(gòu)也被用于支持脂膜或脂質(zhì)體，脂膜和脂質(zhì)體是具有雙分子層結(jié)構(gòu)的與皮膚細胞膜結(jié)構(gòu)相同的人工膜，是SLP 制備超分子結(jié)構(gòu)是納米技術(shù)領(lǐng)域的一個新進展[7]。SLP 具有重復(fù)的空間結(jié)構(gòu)，可以作為模板用于制備稀有金屬納米顆粒催化劑，Bolla 等[49]以兩株高加索乳桿菌SLP 為模板，在Pt/CBS8348 和Pt/CBS83111 催化劑中觀察到納米和亞納米Pt 團簇，成功獲得了鉑質(zhì)生物催化劑并實現(xiàn)了重復(fù)使用性，且催化轉(zhuǎn)化率在75%～90%之間，具有較高的催化活性。由此可見，乳酸菌的SLP 在仿生、催化、傳感器和生物醫(yī)學(xué)[50-51]等納米級系統(tǒng)領(lǐng)域都有廣泛前景。

6 結(jié)論與展望

本文綜述了乳酸菌SLP 的支撐保護、識別黏附、疫苗研發(fā)、免疫調(diào)節(jié)、仿生能力等功能，表明了SLP 作為生物大分子物質(zhì)，在工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域的巨大開發(fā)潛力。乳酸菌SLP 被認為是地球上最豐富的生物聚合物之一，不僅具有來源豐富、容易提取的優(yōu)點，還具有良好的安全性，在蛋白質(zhì)資源開發(fā)利用中具有廣闊的前景。