王殷彤，王成功，賈思凝，俞文秀，王方巖，姜程曦*，程錦國(guó)

莪術(shù)油通過(guò)抑制鐵死亡減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的機(jī)制研究

王殷彤1, 2，王成功3，賈思凝3，俞文秀1，王方巖4，姜程曦3*，程錦國(guó)2*

1. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二學(xué)院，浙江 溫州 325000 2. 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一學(xué)院，浙江 溫州 325000 3. 溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江 溫州 325000 4. 溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325000

探究莪術(shù)油是否通過(guò)抑制鐵死亡減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化及作用機(jī)制。40只雄性C57BL/6小鼠分為對(duì)照組、模型組和莪術(shù)油低、高劑量（3.25、13.00 mg/kg）組。小鼠氣管插管注射博來(lái)霉素（3 mg/kg）制備肺纖維化模型，造模7 d后開(kāi)始給藥，給藥組連續(xù)14 d隔日ip莪術(shù)油。給藥結(jié)束后，通過(guò)各組小鼠體質(zhì)量和肺干濕質(zhì)量比評(píng)估小鼠一般情況；采用蘇木素-伊紅（HE）和Masson染色觀察肺組織病理變化；檢測(cè)血清中炎癥因子水平和肺組織中羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）、氧化應(yīng)激水平；Western blotting檢測(cè)肺組織中肺纖維化和鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)。與模型組比較，莪術(shù)油組小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)（＜0.05），肺水腫程度減輕，肺組織損傷情況好轉(zhuǎn)，膠原纖維沉積減少；肺組織氧化產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）及HYP水平減少（＜0.05、0.01），還原酶谷胱甘肽（glutathione，GSH）活性增加（＜0.05）；血清中炎癥因子水平明顯降低（＜0.01）；肺組織纖維化相關(guān)蛋白I型膠原蛋白（collagen I）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和波形蛋白（vimentin）表達(dá)下調(diào)（＜0.05、0.01），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）蛋白表達(dá)上調(diào)（＜0.01），轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）和二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）蛋白表達(dá)下調(diào)（＜0.05、0.01）。莪術(shù)油能夠通過(guò)抑制鐵死亡，改善氧化應(yīng)激，抑制炎癥水平，減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。

肺纖維化；莪術(shù)油；鐵死亡；氧化應(yīng)激；炎癥因子

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種慢性、高死亡率的間質(zhì)性肺病，由于成纖維細(xì)胞過(guò)度積聚，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）廣泛沉積，最終導(dǎo)致肺泡結(jié)構(gòu)受損，肺功能逐漸下降。IPF的預(yù)后較差，患者的生活質(zhì)量受到嚴(yán)重的影響，并且由于繼發(fā)性呼吸衰竭通常在診斷后2～5年內(nèi)死亡[1-2]。吡非尼酮和尼達(dá)尼布在2014年被指南推薦用于IPF的臨床治療，但這2種藥物的價(jià)格高昂，且無(wú)法徹底逆轉(zhuǎn)纖維化[3-4]。因此探索經(jīng)濟(jì)并且可以有效延緩或治療肺纖維化的藥物尤為重要。

莪術(shù)油是莪術(shù)的提取物，價(jià)格經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，其主要成分包括莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)酮、欖香烯等，具有抗腫瘤、抗菌、抗血栓形成等多種藥理作用[5-7]。研究表明，莪術(shù)醇可下調(diào)肺纖維化大鼠肺組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和纖溶酶原激活劑抑制劑-1的表達(dá)，緩解博來(lái)霉素引起的大鼠肺纖維化[8]，但其具體作用機(jī)制尚不明晰。鐵死亡作為一種新的細(xì)胞死亡形式，與鐵代謝紊亂、脂質(zhì)過(guò)氧化積累、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）缺乏有關(guān)，參與了纖維化的形成[9-10]。研究表明，泛素樣含PHD和環(huán)指域1（ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，Uhrf1）可通過(guò)調(diào)節(jié)GPX4和鐵死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1，F(xiàn)SP1）的水平，從而促進(jìn)肺纖維化；通過(guò)使用鐵死亡抑制劑，抑制鐵的累積能夠緩解由博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化，提示鐵死亡在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中可能扮演著重要的角色[11-12]。本研究擬采用莪術(shù)油對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型進(jìn)行干預(yù)治療，以明確莪術(shù)油對(duì)肺纖維化的療效，并通過(guò)檢測(cè)GPX4、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）、二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）等鐵死亡關(guān)鍵蛋白，進(jìn)一步闡述其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

40只SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～25 g，6～8周齡，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SYXK（浙）2021-0020。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，人工晝夜明暗交替12 h/ 12 h，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查會(huì)審查（批準(zhǔn)號(hào)wydw2022-0635）。

1.2 藥品與試劑

莪術(shù)油（批號(hào)5190513）受贈(zèng)于合肥未來(lái)藥物開(kāi)發(fā)有限公司，含牻牛兒酮（C15H22O）8.2%、呋喃二烯（C15H20O）10.5%，符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定；博來(lái)霉素（批號(hào)410730，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20171103）由日本化藥株式會(huì)社生產(chǎn)，購(gòu)自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號(hào)G1340）、Masson染色試劑盒（批號(hào)G1120）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜（批號(hào)IPVH00010、ISEQ00010）購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；兔抗β-actin抗體（批號(hào)ab8227）、兔抗Tubulin抗體（批號(hào)ab210797）、兔抗I型膠原蛋白（collagen I）抗體（批號(hào)ab260043）、兔抗α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體（批號(hào)ab124964）、兔抗GPX4抗體（批號(hào)ab125066）、兔抗TFR1抗體（批號(hào)ab214039）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號(hào)ab205718）、Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)150077）、封固劑DAPI（批號(hào)ab104139）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；兔抗波形蛋白（vimentin）抗體（批號(hào)5741）購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔抗DMT1（批號(hào)NBP1-91840）購(gòu)自美國(guó)Novus公司；小鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號(hào)JL20268）、小鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)JL10484）、小鼠IL-1β ELISA試劑盒（批號(hào)JL18442）購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；GSH測(cè)定試劑盒（批號(hào)A006-1-1）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒（批號(hào)A003-1-2）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒（批號(hào)A001-3-2）、羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）測(cè)定試劑盒（批號(hào)A030-2-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

165-8001型電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；JS-M6P型凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技生物公司）；TGL-16gR型低溫離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BSA224S型電子分析天平（賽多利斯公司）；SpectraMax 190型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司）；80i型正置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；HistoCore Arcadia型石蠟包埋機(jī)、RM2235型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組（10只）和造模組（30只）。小鼠ip 2%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉，固定后燈光下尋找氣管，插入留置針。造模組小鼠通過(guò)氣管插管注射博來(lái)霉素（3 mg/kg）[13]，對(duì)照組注射生理鹽水。造模完成后立即旋轉(zhuǎn)小鼠，使博來(lái)霉素或生理鹽水可以均勻分布肺中。待小鼠蘇醒后，觀察一般情況。根據(jù)課題組前期研究，以莪術(shù)油推薦成人每日最佳使用量換算作為低劑量，為了更好評(píng)估有效劑量的范圍，以4倍臨床劑量作為高劑量。將30只造模組小鼠隨機(jī)分為模型組和莪術(shù)油低、高劑量（3.25、13.00 mg/kg）組。造模7 d后開(kāi)始給藥，給藥組連續(xù)14 d隔日ip莪術(shù)油，對(duì)照組和模型組ip等體積生理鹽水，第21天處死小鼠。

2.2 樣本收集

末次給藥2 h后，腹主動(dòng)脈采血后處死小鼠，取血清用于ELISA檢測(cè)。小鼠乙醇局部消毒，沿前中線剪開(kāi)胸腔，暴露氣管和心肺器官。用手術(shù)線結(jié)扎右肺，取右肺上葉保存，余下置于液氮中保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。分離氣管后，用眼科剪在氣管上端剪一“Y”形小口，插入留置針，左肺中打入4%多聚甲醛固定液，直至左肺飽滿，結(jié)扎左肺剪下，固定后進(jìn)行石蠟包埋。

2.3 小鼠體質(zhì)量及肺干濕質(zhì)量比測(cè)定

每天記錄小鼠體質(zhì)量，給藥結(jié)束后，取右肺上葉，稱定質(zhì)量后，80 ℃烘箱中烘烤72 h，直至質(zhì)量恒定，稱定質(zhì)量，計(jì)算肺干濕質(zhì)量比，用于反映肺組織含水量。

2.4 肺組織病理學(xué)觀察

取固定后的肺組織，梯度乙醇脫水、透明、浸蠟后進(jìn)行石蠟包埋，切片（厚度4 μm），脫蠟至水，進(jìn)行HE和Masson染色，脫水，中性膠封片，于顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

2.5 免疫熒光法檢測(cè)肺組織collagen I和GPX4蛋白表達(dá)

取固定后的肺組織，梯度乙醇脫水、透明、浸蠟后進(jìn)行石蠟包埋，切片（厚4 μm），脫蠟至水，抗原修復(fù)后加入0.2%牛血清白蛋白，室溫封閉30 min，滴加collagen I（1∶500）、GPX4（1∶200）抗體，4 ℃過(guò)夜孵育。室溫復(fù)溫1 h后，加入熒光二抗避光孵育1 h。DAPI復(fù)染10 min后，滴加防熒光淬滅劑封片。正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。DAPI紫外激發(fā)波長(zhǎng)330～380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)420 nm，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長(zhǎng)465～495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515～555 nm，發(fā)綠光。

2.6 肺組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)及HYP含量測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組小鼠肺組織中GSH、MDA、SOD和HYP含量。

2.7 血清中炎癥因子水平檢測(cè)

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

2.8 Western blotting檢測(cè)肺組織collagen Ⅰ、α-SMA、vimentin、GPX4、TFR1、DMT1蛋白表達(dá)

取各組小鼠肺組織，按照50∶1的比例加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，提取組織蛋白。BCA法進(jìn)行蛋白定量測(cè)定蛋白濃度，變性后的蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h；分別加入collagen I抗體（1∶500）、α-SMA抗體（1∶10 000）、vimentin抗體（1∶1000）、GPX4抗體（1∶5000）、TFR1抗體（1∶5000）、DMT1抗體（1∶1000）、Tubulin抗體（1∶1000）和β-actin抗體（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜；洗膜后，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體，室溫孵育1 h，洗膜。滴加ECL曝光液，放入曝光機(jī)中成像，用Image J圖像軟件分析對(duì)條帶灰度。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 莪術(shù)油緩解肺纖維化小鼠體質(zhì)量減輕及肺水腫

如圖1-A所示，造模7 d后，對(duì)照組小鼠體質(zhì)量增加，造模組小鼠體質(zhì)量均下降；給藥后，與模型組比較，莪術(shù)油低劑量組小鼠體質(zhì)量顯著增長(zhǎng)（＜0.05）。如圖1-B所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺干濕質(zhì)量比顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，莪術(shù)油低劑量組小鼠肺干濕質(zhì)量比顯著降低（＜0.05）。

3.2 莪術(shù)油減少肺纖維化小鼠肺組織纖維化改變和膠原沉積

如圖2所示，HE染色結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰完整，肺泡和肺泡間隔正常，未見(jiàn)明顯的病理性改變，未見(jiàn)膠原沉積。模型組小鼠的肺組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，肺泡壁顯著增厚，肺泡不完整甚至不可見(jiàn)，肺泡腔內(nèi)有大量的纖維組織團(tuán)聚集，間質(zhì)部分可見(jiàn)肌成纖維細(xì)胞增生，同時(shí)伴有炎性浸潤(rùn)。與模型組相比，莪術(shù)油組肺泡結(jié)構(gòu)更加完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度更輕，纖維化改變更少。Masson染色結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組小鼠肺組織中存在明顯的間質(zhì)內(nèi)藍(lán)色條索樣膠原纖維沉積，伴隨肺泡壁增厚和肺紋理紊亂。與模型組相比，莪術(shù)油組肺組織內(nèi)的膠原沉積有一定程度減少。

3.3 莪術(shù)油減少肺纖維化小鼠肺組織中纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)

如圖3所示，Western blotting結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組肺組織中collagen I、α-SMA、vimentin蛋白表達(dá)均明顯升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，莪術(shù)油各劑量組collagen I蛋白表達(dá)顯著降低，莪術(shù)油低劑量組vimentin蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.05），莪術(shù)油高劑量組α-SMA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（＜0.01）。免疫熒光染色結(jié)果與Western blotting結(jié)果一致，與對(duì)照組比較，模型組collagen I陽(yáng)性表達(dá)增加；與模型組比較，莪術(shù)油組collagen I陽(yáng)性表達(dá)減少。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖2 莪術(shù)油對(duì)肺纖維化小鼠肺組織病理變化的影響(×400)

圖3 莪術(shù)油對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中collagen I、α-SMA和vimentin蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.4 莪術(shù)油降低肺纖維化小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，莪術(shù)油低劑量組小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均顯著降低（＜0.01）。

3.5 莪術(shù)油改善肺纖維化小鼠氧化應(yīng)激及減少HYP

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠肺組織中MDA和HYP含量顯著升高（＜0.01），GSH含量顯著降低（＜0.01），SOD活性呈降低趨勢(shì)；與模型組比較，莪術(shù)油各劑量組GSH含量顯著升高（＜0.01），MDA含量顯著降低（＜0.01），SOD活性呈升高趨勢(shì)；莪術(shù)油低劑量組HYP含量顯著降低（＜0.05）。

圖4 莪術(shù)油對(duì)肺纖維化小鼠血清中炎癥因子水平的影響(, n = 7)

圖5 莪術(shù)油對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)和HYP含量的影響(, n = 6)

3.6 莪術(shù)油抑制肺纖維化小鼠肺組織中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)

如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組肺組織中GPX4蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），TFR1和DMT1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，莪術(shù)油各劑量組GPX4蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），TFR1和DMT1蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01）。免疫熒光染色結(jié)果與Western blotting結(jié)果一致，與對(duì)照組比較，模型組GPX4陽(yáng)性表達(dá)減少；與模型組比較，莪術(shù)油組GPX4陽(yáng)性表達(dá)增加。

圖6 莪術(shù)油對(duì)肺纖維化小鼠肺組織中GPX4、TFR1和DMT1蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

4 討論

肺纖維化是一種慢性間質(zhì)性肺病，主要特征為ECM的過(guò)度表達(dá)和沉積、肌成纖維細(xì)胞形成的纖維灶累積以及肺重塑異常[14]。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生和ECM過(guò)度分泌的重要途徑之一，最終可能導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生[15]。EMT的過(guò)程主要表現(xiàn)為上皮黏附蛋白下調(diào)和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA上調(diào)，同時(shí)包括纖連蛋白、vimentin、collogen I、collogen III、collogenIV等的生成[16]。莪術(shù)為姜科姜黃屬植物，其性溫，味辛、苦，歸肝、脾經(jīng)，其功效為破血祛瘀行氣、消腫止痛。莪術(shù)油是從莪術(shù)中提取的揮發(fā)油，臨床常用于抗炎、抗腫瘤治療[17]。本課題組前期研究已證實(shí)莪術(shù)提取物對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的小鼠急性肺損傷有一定的改善作用[18]，但對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化是否有改善作用及其作用機(jī)制尚未明確。

鐵死亡是一種新型程序性細(xì)胞死亡，其特征為細(xì)胞內(nèi)鐵過(guò)載和活性氧（reactive oxygen species，ROS）積累[19]。鐵離子是脂質(zhì)過(guò)氧化物積累和鐵死亡過(guò)程所必需的。因此，參與鐵離子結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)、解離和儲(chǔ)存的蛋白在鐵死亡的調(diào)節(jié)中起著重要作用。Fe3+與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合后通過(guò)膜上的TFR進(jìn)入細(xì)胞。隨后，細(xì)胞中的Fe3+被前列腺六跨膜上皮抗原3（six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3，STEAP3）還原為Fe2+，F(xiàn)e2+通過(guò)DMT1或鋅-鐵調(diào)節(jié)蛋白家族8/14（zinc-iron regulatory protein family 8/14，ZIP8/14）釋放到細(xì)胞質(zhì)中。這些相關(guān)蛋白的異常表達(dá)或功能障礙會(huì)使細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度失衡，導(dǎo)致鐵過(guò)載。GPX4可減弱脂質(zhì)過(guò)氧化物的毒性并維持雙層脂質(zhì)細(xì)胞膜穩(wěn)定性，表明它是鐵死亡的中樞調(diào)節(jié)因子[20]。GPX4表達(dá)降低導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物累積，最終引起鐵死亡[21]。研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化和肺損傷的誘導(dǎo)劑博來(lái)霉素和LPS可以誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。鐵死亡抑制劑利普羅他汀-1（liproxstatin-1，Lip-1）可通過(guò)減少脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制鐵死亡緩解博來(lái)霉素或LPS誘導(dǎo)的肺纖維化癥狀。TGF-β刺激上調(diào)人肺成纖維MRC-5細(xì)胞和小鼠原代肺成纖維細(xì)胞中TFR1的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Fe2+增加，從而促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[12]。還有研究發(fā)現(xiàn)，一些化合物和傳統(tǒng)中藥證實(shí)了鐵死亡與纖維化之間存在聯(lián)系[22-23]。表明鐵死亡在肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。因此，通過(guò)抑制鐵死亡來(lái)緩解肺纖維化具有較高的創(chuàng)新性和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

本研究采用博來(lái)霉素誘導(dǎo)建立小鼠肺纖維化模型，造模7 d后隔日給予不同劑量莪術(shù)油治療，給藥14 d后，收集小鼠肺組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，莪術(shù)油改善了博來(lái)霉素引起的小鼠體質(zhì)量減輕和肺干濕質(zhì)量比增加。進(jìn)一步，HE染色結(jié)果表明，與模型組相比，莪術(shù)油治療組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)更加完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度更輕，肺臟纖維化改變減少；Masson染色結(jié)果表明，與模型組相比，莪術(shù)油治療組小鼠肺組織中膠原明顯減少。肺泡上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞，以及成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化在肺纖維化的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織collogen I、α-SMA、vimentin蛋白表達(dá)上調(diào)，且肺組織中collogen I沉積增多，表明博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化中有EMT發(fā)生；莪術(shù)油治療減少了肺泡上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞，及成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，下調(diào)了這些相關(guān)蛋白的表達(dá)。表明莪術(shù)油可以通過(guò)調(diào)節(jié)EMT，抑制上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化或成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化從而改善肺纖維化。HYP為膠原纖維所特有，因此可以通過(guò)檢測(cè)HYP的含量，從而評(píng)估纖維化程度。結(jié)果表明，莪術(shù)油治療組可以在一定程度上改善小鼠肺組織中的纖維化程度。

研究表明，肺纖維化的發(fā)展與多種炎癥因子相關(guān)，肺纖維化極易出現(xiàn)IL-1β、IL-6、TNF-α的過(guò)表達(dá)，高水平的TNF-α增加膠原沉積，導(dǎo)致肺損傷[24]；IL-1β和IL-6通過(guò)激活TGF-β信號(hào)通路誘導(dǎo)EMT發(fā)生[25-26]。結(jié)果顯示，博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平提高，而經(jīng)過(guò)莪術(shù)油干預(yù)后肺纖維化小鼠血清中相關(guān)炎癥因子有所減少，其中莪術(shù)油低劑量組的下調(diào)作用明顯，說(shuō)明低劑量莪術(shù)油可能通過(guò)降低與纖維化相關(guān)的炎癥因子水平，達(dá)到改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的目的。研究證實(shí)，氧化應(yīng)激促進(jìn)了肺纖維化的產(chǎn)生，在肺纖維化的過(guò)程中，氧化應(yīng)激水平提高，大量ROS產(chǎn)生，肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，促進(jìn)了成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化和肌成纖維細(xì)胞分化，引起了ECM過(guò)表達(dá)和過(guò)量沉積，最終導(dǎo)致了纖維化的產(chǎn)生[27]。結(jié)果顯示，肺纖維化的產(chǎn)生會(huì)引起氧化應(yīng)激相關(guān)產(chǎn)物（MDA）、還原酶（GSH、SOD）的活性改變，通過(guò)莪術(shù)油治療可以下調(diào)MDA表達(dá)、上調(diào)GSH表達(dá)。說(shuō)明莪術(shù)油可以改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化組織中的氧化損傷程度。Western blotting法檢測(cè)鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果表明，與模型組相比，莪術(shù)油給藥治療后GPX4表達(dá)上調(diào)，TFR1和DMT1表達(dá)下調(diào)，免疫熒光染色結(jié)果與Western blotting一致。說(shuō)明莪術(shù)油減輕肺纖維化小鼠纖維化程度可能是通過(guò)抑制鐵死亡實(shí)現(xiàn)的。莪術(shù)油作為一種中草藥，具有天然、經(jīng)濟(jì)、易獲取等優(yōu)勢(shì)，可以為肺纖維化患者提供有效的治療選擇。此外，最新的研究結(jié)果表明，雷公藤可以通過(guò)調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2）/血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）通路抑制鐵死亡，從而減輕百草枯所致的急性肺損傷和肺纖維化[28]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論相吻合。證明了中草藥的多成分、多靶點(diǎn)特性也為肺纖維化的個(gè)體化治療提供了新的思路和方法。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)博來(lái)霉素通過(guò)促進(jìn)炎癥因子釋放，誘導(dǎo)氧化失衡，從而激活鐵死亡引起小鼠肺組織發(fā)生ECM沉積，纖維化形成。莪術(shù)油干預(yù)后改善肺組織的炎性狀態(tài)，重建氧化還原平衡狀態(tài)，上調(diào)肺組織中GPX4，下調(diào)TFR1和DMT1的表達(dá)從而抑制鐵死亡，減少膠原沉積，最終減輕博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Gross T J, Hunninghake G W. Idiopathic pulmonary fibrosis [J]., 2001, 345(7): 517-525.

[2] Noble P W, Barkauskas C E, Jiang D H. Pulmonary fibrosis: Patterns and perpetrators [J]., 2012, 122(8): 2756-2762.

[3] King T E Jr, Jr B, Castro-Bernardini S,. A phase 3 trial of pirfenidone in patients with idiopathic pulmonary fibrosis [J]., 2014, 370(22): 2083-2092.

[4] Richeldi L, du Bois R M, Raghu G,. Efficacy and safety of nintedanib in idiopathic pulmonary fibrosis [J]., 2014, 370(22): 2071-2082.

[5] Chen K D, Li G P, Cui H R,. Systems pharmacology and GC-MS metabolomics reveal the efficacy and mechanisms of zedoary oil on acute liver injury induced by oxidative stress [J]., 2022, 104: 154295.

[6] 孔紅芳, 袁書(shū)同, 袁飛龍, 等. 莪術(shù)油注射液化學(xué)成分、藥理作用和臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 中草藥, 2023, 54(12): 4053-4060.

[7] 姜程曦, 郭月琴, 張淑君, 等. 莪術(shù)油注射液協(xié)同治療新型冠狀病毒肺炎 (COVID-19) 可行性淺析 [J]. 中草藥, 2020, 51(11): 3062-3069.

[8] 顧燕蘭, 張雅琴, 孫鋼. 莪術(shù)醇對(duì)大鼠肺纖維化模型的干預(yù)作用及對(duì)TGF-β1和PAI-1表達(dá)的影響 [J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2019, 25(10): 27-31.

[9] Xie Y, Hou W, Song X,. Ferroptosis: Process and function [J]., 2016, 23(3): 369-379.

[10] Gong Y, Wang N, Liu N G,. Lipid peroxidation and GPX4 inhibition are common causes for myofibroblast differentiation and ferroptosis [J]., 2019, 38(7): 725-733.

[11] Liu Y, Cheng D M, Wang Y,. UHRF1-mediated ferroptosis promotes pulmonary fibrosis via epigenetic repression of GPX4 andgenes [J]., 2022, 13(12): 1070.

[12] Pei Z, Qin Y F, Fu X H,. Inhibition of ferroptosis and iron accumulation alleviates pulmonary fibrosis in a bleomycin model [J]., 2022, 57: 102509.

[13] Lazo J S, Hoyt D G, Sebti S M,. Bleomycin: A pharmacologic tool in the study of the pathogenesis of interstitial pulmonary fibrosis [J]., 1990, 47(3): 347-358.

[14] Chapman H A. Epithelial-mesenchymal interactions in pulmonary fibrosis [J]., 2011, 73: 413-435.

[15] Kim K K, Kugler M C, Wolters P J,. Alveolar epithelial cell mesenchymal transition developsduring pulmonary fibrosis and is regulated by the extracellular matrix [J]., 2006, 103(35): 13180-13185.

[16] Lederer D J, Martinez F J. Idiopathic Pulmonary Fibrosis [J]., 2018, 378(19): 1811-1823.

[17] 魏巍, 王冰瑤. 莪術(shù)及其主要成分的藥理作用研究進(jìn)展[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2022, 45(10): 2154-2160.

[18] Wu Y Z, Zhang Q, Wei X H,. Multiple anti-inflammatory mechanisms of Zedoary Turmeric Oil Injection against lipopolysaccharides-induced acute lung injury in rats elucidated by network pharmacology combined with transcriptomics [J]., 2022, 106: 154418.

[19] Stockwell B R, Friedmann Angeli J P, Bayir H,. Ferroptosis: A regulated cell death nexus linking metabolism, redox biology, and disease [J]., 2017, 171(2): 273-285.

[20] Xu W T, Deng H M, Hu S,. Role of ferroptosis in lung diseases [J]., 2021, 14: 2079-2090.

[21] Kim S, Kang S W, Joo J,. Characterization of ferroptosis in kidney tubular cell death under diabetic conditions [J]., 2021, 12(2): 160.

[22] Zhang Z L, Guo M, Li Y J,. RNA-binding protein ZFP36/TTP protects against ferroptosis by regulating autophagy signaling pathway in hepatic stellate cells [J]., 2020, 16(8): 1482-1505.

[23] Kong Z Y, Liu R, Cheng Y R. Artesunate alleviates liver fibrosis by regulating ferroptosis signaling pathway [J]., 2019, 109: 2043-2053.

[24] Shao S Q, Qu Z Y, Liang Y W,. Iguratimod decreases bleomycin-induced pulmonary fibrosis in association with inhibition of TNF-α in mice [J]., 2021, 99: 107936.

[25] Epstein Shochet G, Brook E, Bardenstein-Wald B,. TGF-β pathway activation by idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) fibroblast derived soluble factors is mediated by IL-6 trans-signaling [J]., 2020, 21(1): 56.

[26] Zhang W J, Chen S J, Zhou S C,. Inflammasomes and fibrosis [J]., 2021, 12: 643149.

[27] Otoupalova E, Smith S, Cheng G,. Oxidative stress in pulmonary fibrosis [J]., 2020, 10(2): 509-547.

[28] Song C Y, Feng M X, Li L,.Hook. f. ameliorates paraquat-induced lung injury by reducing oxidative stress and ferroptosis via Nrf2/HO-1 pathway [J]., 2023, 252: 114575.

Mechanism of Zedoary Turmeric Oil on attenuating bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice through inhibition of ferroptosis

WANG Yin-tong1, 2, WANG Cheng-gong3, JIA Si-ning3, YU Wen-xiu1, WANG Fang-yan4, JIANG Cheng-xi3, CHENG Jin-guo2

1. The Second Affiliated College of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China 2. The First Affiliated College of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China 3. School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China 4. School of Basic Medicine, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China

To explore whether Zedoary Turmeric Oil (莪術(shù)油) can alleviate bleomycin induced pulmonary fibrosis in mice by inhibiting ferroptosis and the specific mechanism.A total of 40 C57BL/6 male mice were divided into control group, model group, and Zedoary Turmeric Oil low-and high-dose (3.25, 13.00 mg/kg) groups. The model of pulmonary fibrosis was established by injecting bleomycin (3 mg/kg) through tracheal intubation in mice. The drug was administered 7 d after the model was established. The drug group was given Zedoary Turmeric Oil every other day for 14 consecutive days. After administration, the general condition of mice was evaluated by comparing their body weight and lung dry wet weight ratio in each group; Pathological changes of lung tissue was observed by HE and Masson staining; Levels of inflammatory factors in serum and hydroxyproline (HYP) and oxidative stress levels in lung tissue were detected; Western blotting was used to detect the expressions of pulmonary fibrosis and ferroptosis related proteins in lung tissue.Compared with model group, the body weight of mice in Zedoary Turmeric Oil group was increased (< 0.05), the degree of pulmonary edema was reduced, the damage of lung tissue was improved, and the deposition of collagen fibers was reduced; The levels of oxidation products malondialdehyde (MDA) and HYP in lung tissue were decreased (< 0.05, 0.01), and the activity of glutathione (GSH) was increased (< 0.05); The levels of inflammatory factors in serum were significantly reduced (< 0.01); Expressions of protein associated with pulmonary fibrosis collagen I, α-smooth muscle actin (α-SMA) and vimentin in lung tissue were down-regulated (< 0.05, 0.01), glutathione peroxidase 4 (GPX4) protein expression was up-regulated (< 0.01), transferrin receptor 1 (TFR1) and divalent metal transporter 1 (DMT1) protein expressions were down-regulated (< 0.05, 0.01).Zedoary Turmeric Oil can alleviate bleomycin induced-pulmonary fibrosis in mice by inhibiting ferroptosis, improving oxidative stress and inhibiting inflammation.

pulmonary fibrosis; Zedoary Turmeric Oil; ferroptosis; oxidative stress; inflammatory factors

R285.5

A

0253 - 2670(2023)16 - 5274 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.16.016

2023-03-07

溫州市新型冠狀病毒肺炎疫情防控應(yīng)急攻關(guān)項(xiàng)目（ZY202003）

王殷彤（1997—），女，碩士研究生，主要從事中醫(yī)藥防治纖維化的基礎(chǔ)和臨床研究。

程錦國(guó)，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治腎臟病的基礎(chǔ)和臨床研究。E-mail: wzwsjcjg@163.com

姜程曦，男，研究員，主要從事中藥質(zhì)量研究。E-mail: jiangchengxi@126.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]