劉藝苑，何理斌，高璐，邵喜英，2

1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053；2. 浙江省腫瘤醫(yī)院，浙江 杭州 310022

目前癌癥已經(jīng)成為全世界主要死亡原因，對人類健康產(chǎn)生了嚴(yán)重威脅。近半個世紀(jì)以來，盡管化療為數(shù)百萬患者提供了生存益處，但隨之產(chǎn)生的耐藥性和副作用限制了化療的應(yīng)用。許多天然產(chǎn)品都是從傳統(tǒng)中藥中開發(fā)出來的，中醫(yī)藥具有的悠久臨床實踐經(jīng)驗和既往病案是篩選抗癌天然化合物的寶貴資源。在過去的幾十年里，通過體外、體內(nèi)和臨床研究已經(jīng)證明了中醫(yī)藥在癌癥干預(yù)、改善患者生活質(zhì)量等方面的潛力。

川楝子具有疏肝泄熱、行氣止痛、殺蟲、療癬的功效，在我國古代常被用作腸道驅(qū)蟲劑和農(nóng)業(yè)殺蟲劑[1-2]，在《中華人民共和國藥典》中記載為：味苦寒，有小毒，有酸味，歸于肝胃小腸經(jīng)。川楝子中含有多種類型的化合物，包括三萜、木脂素、黃酮、甾體、有機(jī)酸及其他類成分，主要成分為檸檬苦素型三萜[3]。川楝素是從川楝子和苦楝皮的根、皮中提取到的主要活性成分之一。川楝素（TSN，C30H38O11）的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)如圖1 所示。藥理方面包括驅(qū)蛔殺蟲、抗肉毒、抗腫瘤、抗病毒、對神經(jīng)肌肉接頭的作用、抗氧化、呼吸抑制及抑制破骨細(xì)胞等藥理作用[4]。

圖1 川楝素化學(xué)結(jié)構(gòu)

筆者總結(jié)了TSN 參與抑制肺癌、乳腺癌、宮頸癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌等多種癌癥的相關(guān)生物學(xué)機(jī)制。這些結(jié)果揭示了不同腫瘤細(xì)胞系對TSN 的不同敏感性，支持了TSN 的有效性和廣譜抗癌活性。

1 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡主要由外源性途徑（死亡受體途徑）、內(nèi)源性途徑（線粒體途徑）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑介導(dǎo)[5]。外源性凋亡途徑主要由Fas、DR3、DR4、DR5、TNFR1等多種受體介導(dǎo)，如Fas-FasL 和腫瘤壞死因子受體凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL），導(dǎo)致Caspase 級聯(lián)反應(yīng)的啟動[6]。研究證實TSN 呈時間劑量依賴性抑制卵巢癌CAOV-3 和ES-2 細(xì)胞增殖，通過上調(diào)Fas、FasL 蛋白的表達(dá)，激活Caspase-8 和Caspase-3 來誘導(dǎo)人卵巢癌細(xì)胞凋亡[7]。內(nèi)源性線粒體途徑在細(xì)胞受到內(nèi)部刺激因子作用被激活如缺氧、生長因子缺失、癌基因DNA 損傷，進(jìn)而激活BCL-2 家族促凋亡因子，增加線粒體通透性釋放出凋亡因子激活Caspase 級聯(lián)[5]。目前多項研究證實TSN 通過內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。TSN 通過p38 MAPK 途徑誘導(dǎo)人胃癌AGS 細(xì)胞、HGC-27 細(xì)胞線粒體途徑依賴性的凋亡[8]。還有研究認(rèn)為TSN 除了通過外源性途徑，也能誘導(dǎo)人卵巢癌CAVO-3 細(xì)胞和A2870 細(xì)胞的內(nèi)源性途徑凋亡[9]。同樣TSN 也能通過內(nèi)源性線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌SGC-7901 細(xì)胞[10]、三陰性乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞[11]、尤文氏肉瘤SK-ES-1 細(xì)胞凋亡[12]。除此以外還有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，研究證實，TSN 在處理非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)活性氧和鈣離子水平升高產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并通過PERK-Eif2a/ATF4 信號通路激活轉(zhuǎn)錄，通過CHOP、DR5 表達(dá)上調(diào)，由于TRAIL 是通過死亡受體介導(dǎo)對腫瘤的殺傷作用，TSN增強(qiáng)了A549 細(xì)胞對TRAIL 敏感性[13]。p53 是一個重要的腫瘤抑制基因，控制細(xì)胞凋亡，在至少50%的腫瘤中，p53 突變或失活，野生型p53 功能的喪失導(dǎo)致人類腫瘤的發(fā)展[14]。將乳腺癌MCF-7 細(xì)胞（ERβ+/p53 野生型）暴露于TSN 可導(dǎo)致深度凋亡，但TSN 對乳腺癌T47D 細(xì)胞（ERβ+/p53 L194F 突變型）的治療效果較差，TSN 誘導(dǎo)凋亡的效果不同可能依賴于p53的不同表達(dá)[15]。TSN 還能夠通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來降低化療藥物的使用劑量，從而減輕高劑量帶來的不良反應(yīng)。大劑量的多柔比星具有心臟毒性，研究發(fā)現(xiàn)TSN 能過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子FOXO1，增強(qiáng)下游促凋亡分子如Noxa 和Bim，促使乳腺癌MDA-MB-231和MDA-MB-435 細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑凋亡，TSN 與多柔比星的協(xié)同作用降低了多柔比星對乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生顯著殺傷性的使用濃度，減小了多柔比星對心臟的損傷[16]。

2 阻滯細(xì)胞周期

癌細(xì)胞在G1、S、G2、有絲分裂的細(xì)胞周期中由于DNA 不能修復(fù)導(dǎo)致異常增殖，可以通過蛋白激酶信號通路（CDK）保護(hù)癌細(xì)胞避免化療造成的DNA損傷，所以腫瘤發(fā)生和耐藥性與細(xì)胞周期檢查點的缺陷相關(guān)[17]。TSN 可通過阻滯腫瘤細(xì)胞周期來抑制細(xì)胞的增殖。經(jīng)TSN 處理后，三陰性乳腺癌MDAMB-231 細(xì)胞、胃癌AGS 細(xì)胞和HGC27 細(xì)胞、早幼粒白血病HL-60 細(xì)胞、淋巴瘤U937 細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G1/S 期[18]。

3 抑制腫瘤細(xì)胞遷移侵襲

腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和多藥耐藥的發(fā)生是臨床上腫瘤治療失敗的主要原因。表皮生長因子（EGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）與對應(yīng)的跨膜受體結(jié)合促進(jìn)腫瘤血管生成[19]。Zhang T 等[20]研究發(fā)現(xiàn)TSN 可與STAT3 的SH2 結(jié)構(gòu)結(jié)合阻止STAT3 二聚化，破壞STAT3 與EFGR 復(fù)合物形成，從而抑制骨肉瘤143B細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移。降解細(xì)胞外基質(zhì)（EMC）以及基底膜是抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵機(jī)制，據(jù)報道，在乳腺癌細(xì)胞中MMP-2 和MMP-9 具有促進(jìn)EMC 和基底膜降解的作用，MMP 的高表達(dá)與乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[20]。TGF-β 能通過激活A(yù)kt/mTOR 通路促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1 和SNAIL 的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[21]，EMT 的標(biāo)志是上皮細(xì)胞的特征消失，出現(xiàn)間充質(zhì)標(biāo)志蛋白vimentin、N-cadherin 的表達(dá)上調(diào)，及E-cadherin 和其他細(xì)胞黏附分子的表達(dá)下調(diào)[22]。Chaffer CL 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，TSN 能通過抑制核因子κB（NF-κB）/Snail 信號通路介導(dǎo)EMT 來抑制人卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在處理肺癌A549 和H1975 細(xì)胞時，TSN 可能通過ERK1/2 和Snail 途徑抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的EMT、黏附、侵襲和遷移[24]。除此之外，Wnt/β-catenin 通路是介導(dǎo)多種癌癥生物學(xué)過程的重要通路，包括增殖、分化、凋亡、遺傳穩(wěn)定性、侵襲和轉(zhuǎn)移[25]。例如TSN 激活WWOX 通過JAK2/Stat3 和Wnt/β-catenin 信號通路抑制肝癌轉(zhuǎn)移[26]。

4 逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對化療耐藥

目前化療已經(jīng)成為癌癥主要治療手段之一，除了原發(fā)性多藥耐藥，腫瘤細(xì)胞還可能在多次化療后對不同機(jī)理的化療藥產(chǎn)生交叉耐藥，稱為獲得性多藥耐藥。筆者試圖尋找到逆轉(zhuǎn)耐藥的藥物來提高腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性，增加患者的生存率。腫瘤耐藥往往與多藥耐藥基因MDR-1 激活導(dǎo)致P-gP 表達(dá)上調(diào)、過度表達(dá)多藥耐藥相關(guān)蛋白家族（MRPs）、胞內(nèi)信號異常改變、DNA 修復(fù)異常、細(xì)胞周期與凋亡自噬途徑變化、EMT 的發(fā)生、miRNAs 表達(dá)等相關(guān)[27]，目前報道的TSN 逆轉(zhuǎn)耐藥的機(jī)制主要包括減少藥物流出和誘導(dǎo)或抑制腫瘤細(xì)胞自噬。

4.1 減少藥物流出多藥耐藥的主要機(jī)制是藥物攝入障礙或向外轉(zhuǎn)運增多導(dǎo)致藥物在細(xì)胞內(nèi)的積累減少。通過ATP 依賴的藥物外排泵的過表達(dá)，化療藥物被泵出細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度降低，產(chǎn)生耐藥性。最常見的藥物外排泵是P-gp[28]。據(jù)報道，MRP2/ABCC2 和P-gp 可轉(zhuǎn)運順鉑（CDDP），并導(dǎo)致細(xì)胞對CDDP 耐藥。另外銅出口蛋白ATP7A、ATP7B 和銅轉(zhuǎn)運蛋白hCTR1 也可以參與了CDDP 的轉(zhuǎn)運。但最近研究證明TSN 并不調(diào)節(jié)P-gp，而是通過下調(diào)膜聯(lián)蛋白Anxa4，抑制銅出口蛋白ATP7A 在細(xì)胞膜上的定位，從而減少了CDDP 從A549 細(xì)胞內(nèi)的流出[29]。另外有研究證明在對阿霉素（ADM）耐藥的乳腺癌MCF-7 細(xì)胞中，TSN 能夠增加ADM 在細(xì)胞核中的濃度，逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞對ADM 耐藥[30]。

4.2 誘導(dǎo)或抑制腫瘤細(xì)胞自噬在癌癥的發(fā)展過程中，自噬根據(jù)癌癥的類型、階段或遺傳因素發(fā)揮著雙重作用：一方面自噬可以防止慢性細(xì)胞損傷和炎癥，抑制致癌p62 蛋白復(fù)合物的積累，會在特定環(huán)境下以與Caspase 無關(guān)的模式導(dǎo)致細(xì)胞死亡，稱為自噬性細(xì)胞死亡，特別是在腫瘤早期[31]。有研究表明TSN 通過PI3K/Akt/mTOR 通路對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）U87 細(xì)胞存在自噬誘導(dǎo)作用，并觀察到自噬在GBM中起到促凋亡作用，用自噬抑制劑3-MA 阻斷自噬可以明顯減少細(xì)胞凋亡，而通過mTOR 抑制劑雷帕霉素增強(qiáng)自噬則導(dǎo)致更多細(xì)胞凋亡[32]。在甲狀腺癌、結(jié)直腸癌和乳腺癌等多項研究中證明，自噬是增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對阿霉素敏感性的重要機(jī)制，阿霉素耐藥與自噬的缺失密切相關(guān)[33-34]。研究表明TSN 能通過抑制PI3K/AKT/mTOR 信號通路逆轉(zhuǎn)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞對阿霉素耐藥[35]，推測可能與TSN 誘導(dǎo)自噬相關(guān)，阿霉素和TSN 聯(lián)合治療可能是人類乳腺癌治療的一種有效策略，還需進(jìn)一步驗證。另一方面自噬已被認(rèn)為是多種癌癥生存和耐藥發(fā)展的有效機(jī)制。腫瘤細(xì)胞能通過自噬降解喪失功能的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等胞內(nèi)物質(zhì)，實現(xiàn)細(xì)胞新陳代謝，為其他腫瘤細(xì)胞提供能量，特別在腫瘤晚期，自噬發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)功能[31]。目前只有2 項研究描述了TSN 與哺乳動物細(xì)胞自噬的關(guān)系[16，36]，研究指出TSN 通過誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞和TNBC 的自噬而產(chǎn)生凋亡增敏效應(yīng)。然而，由于沒有應(yīng)用自噬流分析，因此對結(jié)果的解釋有待考究。另一項研究通過高含量篩選模型確定TSN 是自噬調(diào)節(jié)劑，并進(jìn)一步證實它阻斷自噬流和抑制其底物降解；TSN 在腫瘤細(xì)胞系和移植瘤裸鼠模型中都表現(xiàn)出高度的自噬抑制活性；發(fā)現(xiàn)TSN 在較低濃度（細(xì)胞培養(yǎng)10 nm，小鼠0.5mg/kg）時能有效抑制自噬流，表明TSN 是一種強(qiáng)效的自噬抑制劑，他們還研究了TSN 對化療抗癌效果的互補作用，結(jié)果表明，在細(xì)胞和動物模型中，TSN 可抑制喜樹堿誘導(dǎo)的保護(hù)性自噬，并顯著提高Hela 細(xì)胞對喜樹堿誘導(dǎo)的毒性的敏感性，具有良好的耐受性和安全性[37]。在另一項研究中TSN 同樣發(fā)揮了自噬抑制劑作用使TNBC 細(xì)胞對伊立替康/SN-38 化療敏感[38]。綜上所述，TSN 有可能通過阻斷化療誘導(dǎo)的保護(hù)性自噬而被開發(fā)成一種抗癌藥物，化療聯(lián)合自噬抑制劑可能是未來癌癥治療的新方向。

5 小結(jié)

筆者從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻斷細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)或抑制腫瘤細(xì)胞自噬、增加化療藥物胞內(nèi)濃度等方面總結(jié)了TSN 的廣譜抗腫瘤作用，涉及分子機(jī)制和信號通路包括啟動抑癌p53通路和抑制下調(diào)NF-κB、Wnt/β-catenin、PI3K-AKT和MAPK/ERK 通路。其中最重要的是，TSN 對于多種化療藥物的逆轉(zhuǎn)耐藥作用，不論是通過減少腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物流出，還是增加腫瘤細(xì)胞的自噬性死亡，或者通過提高溶酶體pH 抑制自噬，逆轉(zhuǎn)TNBC對伊立替康和阿霉素耐藥。目前的早期自噬抑制劑如3-MA 和LY294002、靶向自噬晚期的抑制劑如CQ 和HCQ 均不是強(qiáng)效和選擇性的，我們需要發(fā)現(xiàn)更有效、生物利用度更高、生物靶向性更好的藥物。最后，TSN 的生物利用率較低，需要開發(fā)和篩選TSN 衍生物或修飾TSN 靶向結(jié)構(gòu)使其作為一種新型增敏抗癌藥物改善未來癌癥治療。