張暉漢，鄧弘揚(yáng)，徐小東

蘭州大學(xué)第二醫(yī)院 普通外科，甘肅 蘭州 730030

肝癌是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)死亡的第3 大原因，5 年生存率僅為18%[1]，即使施行了首次根治性切除，肝癌的5 年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)70%[2]。經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞術(shù)的重復(fù)使用以及索拉菲尼化療也對(duì)肝癌患者產(chǎn)生諸多負(fù)面影響[3]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)中藥及其藥效成分具有的抗癌活性及其較小的細(xì)胞毒性逐漸受到了廣泛關(guān)注[4]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》曾記載黃芪有健脾益氣固表、脫毒生肌、利尿排膿等功效[5]。黃芪甲苷作為一種芳香族皂苷，是黃芪的最重要的藥效成分之一。有研究表明，黃芪甲苷在神經(jīng)保護(hù)[6]、抗纖維化[7]、抗炎[8]、抗氧化應(yīng)激[9]及抗腫瘤[10]方面有廣泛的藥效作用。最近，多項(xiàng)研究報(bào)道黃芪甲苷在抗肝癌方面顯示出了良好前景[11-13]，但其具體作用機(jī)制尚不清楚，缺乏系統(tǒng)性研究。本研究利用生物信息學(xué)肝癌患者測(cè)序樣本及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[14]聯(lián)合分子對(duì)接的方法對(duì)黃芪甲苷抗肝癌的作用分子機(jī)制系統(tǒng)性探索，旨在為肝癌的臨床治療和基礎(chǔ)研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 黃芪甲苷靶點(diǎn)獲取

在 CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)[15]和 OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)[16]以“astragaloside IV”為關(guān)鍵詞檢索黃芪甲苷的作用靶點(diǎn)。從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索黃芪甲苷“SDF”格式二維結(jié)構(gòu)式，并將其輸入PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù)[17]，依據(jù)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)黃芪甲苷靶點(diǎn)。用“org.Hs.eg.db”R包將靶點(diǎn)統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為“Gene Symbol”格式，轉(zhuǎn)換失敗的靶點(diǎn)剔除，以3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)所得結(jié)果合并后作為所有黃芪甲苷藥效靶點(diǎn)。

1.2 TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)處理及肝癌靶點(diǎn)獲取

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，其中包含了371 例肝癌組織和53 例癌旁組織。從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)下載GSE14520 數(shù)據(jù)集轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18]，其中包含225 例肝癌組織和220 例癌旁肝組織。以R 語(yǔ)言“l(fā)imma”包行差異分析，以P＜0.01 且lg2FC＞1 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異基因，結(jié)果以火山圖和熱圖呈現(xiàn)，且差異基因合并后納入肝癌治療靶點(diǎn)。此外，從CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)和GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)以“hepatocellular carcinoma”檢索肝癌靶點(diǎn)，其中GeneCards 結(jié)果僅relevance score≥20”的靶點(diǎn)。最后將差異基因和數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)合并作為所有肝癌預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.3 黃芪甲苷抗肝癌靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及富集分析

將黃芪甲苷和肝癌靶點(diǎn)取交集得到黃芪甲苷抗肝癌靶點(diǎn)，并用“clusterProfiler”R 包行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析，結(jié)果于條形圖和氣泡圖呈現(xiàn)。

1.4 核心靶點(diǎn)篩選

把黃芪甲苷抗肝癌靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，物種設(shè)定為“homo sapiens”。將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，以CytoNCA 插件計(jì)算該網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的 betweenness centralities（BC）、closeness centralities（CC）、degree cntralities（DC）、eigenvector centralities（EC）、local average connectivity-based method centralities（LAC）和network centralities（NC）6 項(xiàng)拓?fù)渲?，以大于? 項(xiàng)指標(biāo)中位數(shù)進(jìn)一步篩選核心靶點(diǎn)，并對(duì)核心靶點(diǎn)KEGG 富集分析。

1.5 分子對(duì)接

從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取核心靶點(diǎn)的PDB-ID，導(dǎo)入PyMOL 2.5.2 軟件中去除有機(jī)物和溶劑，保存為pdb格式備用。把黃芪甲苷的SDF 格式二維結(jié)構(gòu)式于OpenBabel 2.3.2 軟件中轉(zhuǎn)換為pdb 格式。將核心靶點(diǎn)和黃芪甲苷的pdb 格式結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Autodock 4.2.6軟件行對(duì)接操作，以對(duì)接結(jié)合能最低的構(gòu)象作為最終結(jié)果。若對(duì)接能量＜0 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）則可以說(shuō)明二者具有結(jié)合潛力，若對(duì)接能量＜?6 kcal/mol，說(shuō)明二者有良好結(jié)合潛力，并于PyMOL軟件中呈現(xiàn)。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

依據(jù)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的黃芪甲苷二維結(jié)構(gòu)式，于PharmMapper 中預(yù)測(cè)到148 個(gè)靶點(diǎn)。OMIM和CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中分別得到674 個(gè)和39 個(gè)靶點(diǎn)。3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)結(jié)果合并后去除重復(fù)共得到841 個(gè)黃芪甲苷靶點(diǎn)。

2.2 肝癌靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

經(jīng)計(jì)算，TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集共得到2 917 個(gè)差異基因，其中1 162 個(gè)上調(diào)基因和1 755 個(gè)下調(diào)基因（圖1A、B），而GSE 14520 數(shù)據(jù)集共得699 個(gè)差異基因，其中283 個(gè)上調(diào)基因和416 個(gè)下調(diào)基因（圖1C、D）。從GeneCards 獲得relevance score≥20 靶點(diǎn)407 個(gè)。此外，從CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了69個(gè)肝癌靶點(diǎn)。4 項(xiàng)結(jié)果合并去除重復(fù)后得到3 564 個(gè)肝癌靶點(diǎn)。

圖1 差異分析結(jié)果Fig.1 Difference analysis result

2.3 黃芪甲苷抗肝癌靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和富集分析結(jié)果

將黃芪甲苷和肝癌靶點(diǎn)取交集得到201 個(gè)黃芪甲苷抗肝癌靶點(diǎn)（圖2）。對(duì)這些靶點(diǎn)富集分析可知，生物過(guò)程（BP）顯著富集了老化、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)壓力的反應(yīng)、對(duì)活性氧的反應(yīng)、腺發(fā)育等，細(xì)胞組分（CC）顯著富集了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、含有膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜、血液微粒等，分子功能（MF）顯著富集了細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、膽固醇轉(zhuǎn)移活性、氧氣結(jié)合、內(nèi)肽酶抑制劑活性。KEGG 富集分析顯著富集了磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）–蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路、relaxin信號(hào)通路、乙型肝炎、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等相關(guān)通路（圖3）。

圖2 黃芪甲苷和肝癌交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Venn diagram of astragaloside IV and liver cancer target intersection

圖3 黃芪甲苷抗肝癌靶點(diǎn)富集分析結(jié)果Fig.3 Enrichment analysis of astragaloside IV anti-liver cancer targets

2.4 核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果

經(jīng)篩選，從201 個(gè)靶點(diǎn)中最終篩選出9 個(gè)黃芪甲苷抗肝癌的核心靶點(diǎn)，分別為基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、腫瘤壞死因子（TNF）、腫瘤蛋白p53（TP53）、白細(xì)胞介素（IL）-6、雷帕霉素激酶作用靶點(diǎn)（MTOR）、細(xì)胞凋亡相關(guān)半胱氨酸蛋白酶（CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、Akt1、白蛋白（ALB），見(jiàn)圖4。這些核心靶點(diǎn)與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞衰老、癌癥中的碳代謝、乙型肝炎、丙型肝炎、IL-17 信號(hào)通路、鉑類(lèi)耐藥、癌癥中的蛋白聚糖以及TNF 信號(hào)通路等密切相關(guān)，見(jiàn)圖5。

圖4 黃芪甲苷抗肝癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果Fig.4 Astragaloside IV anti-liver cancer target network and core target screening results

圖5 核心靶點(diǎn)KEGG 富集分析Fig.5 Enrichment analysis of core targets

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

將核心靶點(diǎn)與黃芪甲苷對(duì)接后，發(fā)現(xiàn)這些核心靶點(diǎn)與黃芪甲苷均有結(jié)合潛力，其中IL-6、CASP3、ALB 與黃芪甲苷有良好結(jié)合潛力，見(jiàn)圖6、表1。

表1 核心靶點(diǎn)與黃芪甲苷的分子對(duì)接結(jié)果Table 1 Molecular docking results of core targets with astragaloside IV

圖6 靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果Fig.6 Molecular docking results of targets

3 討論

肝癌作為全球癌癥死亡的主要原因之一，盡管在診斷和治療方面取得了重大進(jìn)展，但預(yù)后依然不盡人意，尤其是晚期肝癌患者可選的治療方式十分有限[19]，探索新的治療方法或許能為肝癌患者帶來(lái)新希望。傳統(tǒng)中草藥以多靶點(diǎn)作用、不良反應(yīng)小、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，在抗腫瘤領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注[20]。作為黃芪的主要藥效成分之一的黃芪甲苷，其抗肝癌作用已被多項(xiàng)研究證實(shí)[21-22]。探索該藥效作用，可為進(jìn)一步應(yīng)用提供依據(jù)。

本研究共篩選出201 個(gè)黃芪甲苷抗肝癌靶點(diǎn)，說(shuō)明黃芪甲苷通過(guò)多靶點(diǎn)發(fā)揮抗肝癌作用。GO 富集分析結(jié)果提示黃芪甲苷的抗肝癌作用很可能與老化、氧化應(yīng)激以及脂質(zhì)代謝等過(guò)程相關(guān)。此外，對(duì)靶點(diǎn)KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)的多條通路與肝癌密切相關(guān)，如PI3K-Akt 通路[23]、relaxin 通路[24]、乙肝[25]、HIF-1 信號(hào)[26]、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性[27]，這些通路均為介導(dǎo)肝癌進(jìn)展的重要途徑，表明本研究所篩選靶點(diǎn)具有可靠性。

為了進(jìn)一步明確黃芪甲苷抗肝癌的核心靶點(diǎn)，本研究利用201 個(gè)靶點(diǎn)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)該網(wǎng)絡(luò)6 項(xiàng)拓?fù)渲岛Y選出了9 個(gè)核心靶點(diǎn)。MMP-9 是基質(zhì)金屬蛋白酶的一種，它可以負(fù)向調(diào)節(jié)異檸檬酸脫氫酶2，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移和肝癌轉(zhuǎn)移[28]。TNF與肝細(xì)胞凋亡中代償性肝細(xì)胞增殖有關(guān)，推動(dòng)了肝細(xì)胞向肝癌發(fā)展[29]。TP53 在13%～48%的肝癌病例中有突變[30]，它在肝癌中誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或凋亡，是一個(gè)抑癌基因。IL-6 可以磷酸化并激活轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3），導(dǎo)致肝癌細(xì)胞增殖、耐藥、侵襲轉(zhuǎn)移等[31]。MTOR 是PI3K-Akt 通路下游分子，是參與肝癌發(fā)病的經(jīng)典失調(diào)通路[32]。CASP3 是抑制肝癌及減輕肝損傷的關(guān)鍵因子[33]。MAPK3 被證實(shí)可以靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）促進(jìn)肝癌血管生成[34]。Akt1 與細(xì)胞存活、增殖、代謝等過(guò)程相關(guān)，對(duì)腫瘤生長(zhǎng)至關(guān)重要[35]。ALB 被證實(shí)是影響肝癌患者總生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[36]?？傊?，這些核心靶點(diǎn)均在肝癌的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用，這在對(duì)它們的KEGG 富集中得到佐證，也證實(shí)了黃芪甲苷抗肝癌的潛在價(jià)值。本研究最后對(duì)核心靶點(diǎn)與黃芪甲苷的分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)IL-6、CASP3、ALB 與黃芪甲苷有良好結(jié)合潛力，說(shuō)明它們可能是黃芪甲苷抗肝癌的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，這為進(jìn)一步研究提供了參考。

綜上，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)聯(lián)合生物信息學(xué)及分子對(duì)接系統(tǒng)性探索了黃芪甲苷抗肝癌的作用機(jī)制，結(jié)果一方面證實(shí)了黃芪甲苷的抗肝癌的潛在價(jià)值，一方面說(shuō)明黃芪甲苷通過(guò)多靶點(diǎn)以及多通路實(shí)現(xiàn)該功能，為后續(xù)研究及肝癌臨床治療提供了理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突