付丹文，陳亞慧，楊少華，高 峰

（1.華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510631；2.廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所，廣東 廣州 510315）

【研究意義】甘薯〔Ipomoea batatas（L）.Lam.〕是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物?；ㄉ剀站哂锌寡趸颓宄杂苫淖饔?，對肝臟和眼睛具有保護(hù)作用，對糖尿病具有一定的治療作用［1］。紫心甘薯的塊根生長于土壤中，處于完全黑暗的環(huán)境，內(nèi)部能大量積累花色素苷，其花色素苷積累部位具有一定的特殊性。目前，對于植物的花、果、莖、葉等地上部分花色素苷合成以及環(huán)境信號因子影響的分子機(jī)制有了一定認(rèn)識，尤其是光照對花色素苷合成的調(diào)控機(jī)制及信號傳導(dǎo)過程已比較清楚［2］。對于非依光型或無法直接接受光照的植物根、塊根或塊莖中花色素苷合成調(diào)控機(jī)制及信號傳遞過程卻不明了。紫心甘薯具有重要的開發(fā)價值，對其進(jìn)行非依光型及植物地下部分花色素苷合成的調(diào)控機(jī)制研究，可以豐富和深化植物花色素苷生物合成分子調(diào)控的基礎(chǔ)理論，為紫心甘薯高花色素苷品種選育提供新的遺傳標(biāo)記，為其分子育種篩選出合適的操作元件或改造靶標(biāo)，還可為提高塊根中色素含量提供新的思路。

【前人研究進(jìn)展】花色素是類黃酮家族最大的分支，類黃酮是一類以黃烷C6-C3-C6 為骨架的衍生物，是普遍存在的植物次生代謝產(chǎn)物。根據(jù)黃烷骨架上烴基和甲氧基的數(shù)目和位置，花色素可以分為六類：花葵素、花青素、花翠素、甲基花青素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素［3］。植物花色素苷是原位合成的，由一系列的酶催化完成。隨后，由谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶將花色素苷由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至液泡，并儲藏于液泡中［3］。在植物體內(nèi)，特定花色素苷是否合成、合成多少及合成部位主要是由其合成途徑中多個結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平?jīng)Q定，而表達(dá)水平受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［4］。參與植物花色素苷合成酶基因表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子主要有三類：MYB、bHLH（也稱MYC）和WD40。其中，R2R3-MYB 型轉(zhuǎn)錄因子直接與花色素苷生物合成酶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，從而激活其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。R2R3-MYB 參與植物花色素苷生物合成已有較多報道，如R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子GhMYB1a參與調(diào)控非洲菊花青素和黃酮醇積累［5］；茄子中R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子SmMYB75受光誘導(dǎo)，在花瓣中特異性表達(dá)，調(diào)控茄子花青素的積累［6］；毛白楊中R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子MYB6，主要在幼葉中表達(dá)，MYB6的過表達(dá)上調(diào)類黃酮生物合成基因的表達(dá)，導(dǎo)致花青素和原花青素的積累顯著增加［7］；R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子MdMYB114促進(jìn)蘋果果皮中花色素苷的積累［8］；葡萄紫色葉和莖中，2 號染色體上的VvMYBA1表達(dá)上調(diào)，14號染色體上VvMYBA5、VvMYBA6和VvMYBA7調(diào)控葡萄營養(yǎng)組織花色素苷的積累，1 組R2R3-MYB 負(fù)調(diào)控葡萄營養(yǎng)組織花色素苷的積累［9］，LMMYB參與番茄果實顏色的形成［10］，CsMYB4-5、CsMYB4-6 和CsMYB4-7 參與調(diào)控茶樹樹葉花青素積累［11］。

【本研究切入點(diǎn)】已有研究表明，紫心甘薯中R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子IbMYB1通過與花色素苷合成途徑酶基因啟動子的直接結(jié)合激活其表達(dá)，從而促進(jìn)花色素苷的合成［12］。IbMYB1基因在轉(zhuǎn)基因黃肉甘薯中超表達(dá)，導(dǎo)致一系列花色素苷合成酶基因表達(dá)上調(diào)，花色素苷含量增加，出現(xiàn)黃中帶紫的“雙色”薯肉，抗氧化性顯著提高［13］。IbMYB1基因的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。本研究前期利用已克隆的IbMYB1啟動子序列，分別進(jìn)行酵母單雜交文庫篩選，以篩選其上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，并對篩選出的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與靶基因關(guān)系、亞細(xì)胞定位、自激活活性以及它們之間的相互作用進(jìn)行研究，篩選得到的7 個IbMYB1上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子分別為IbERF1、IbPDC、IbPGP19、IbSCF、IbWRKY1、IbJOX4 和IbEIN3-2?！緮M解決的關(guān)鍵問題】 本研究對7 個IbMYB1上游調(diào)控蛋白的互作與表達(dá)進(jìn)行分析，進(jìn)一步闡明花色素苷在特定時空合成與積累的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為紫心甘薯品系‘A5’和白心甘薯‘禺北白’，采自華南師范大學(xué)生物園。野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子保存于華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室。載體pCambia1300由華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高彩吉老師提供；載 體pSAT4-nEYP-C1 和pSAT4-cEYP-C1 由 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院王亞琴老師提供；載體pGADT7 和pGBKT7 由華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1植物總RNA 提取、純度鑒定及反轉(zhuǎn)錄 使用植物總RNA 小提試劑盒（Magen），進(jìn)行紫心甘薯塊根RNA 的提取，具體方法參照試劑盒操作步驟。從所得RNA 溶液中吸取2 μL 總RNA，使用Nano Drop ND1000 微量測定分光光度計測定RNA 濃度并進(jìn)行純度鑒定，測定結(jié)果為OD260/OD280＜2.0，OD260/OD280＞2.0，可用于反轉(zhuǎn)錄試驗，同時吸取5 μL 總RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測其純度。紫外檢測能看到兩條清晰可區(qū)分的主帶（28S 和18S）的RNA，表明RNA 無降解，用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄試驗。按照Takara 說明書合成cDNA 第一鏈，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2目的片段與表達(dá)載體的連接 以紫心甘薯塊根cDNA 為模板，用TaKaRa 高保真酶PrimeSTAR?Max DNA Polymerase 擴(kuò)增兩端帶有不同酶切位點(diǎn)末端的目的片段序列，PCR 產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒（Magen）純化回收，具體方法參照試劑盒操作步驟。使用TaKaRa 限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，反應(yīng)條件為37 ℃，連接30 min。經(jīng)電泳檢測正確的酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。使用Clon Express II One Step Cloning Kit試劑盒（Vazyme）將目的片段和表達(dá)載體進(jìn)行連接，反應(yīng)條件為37 ℃，連接30 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。取陽性菌落進(jìn)行菌落PCR檢測，取擴(kuò)增得到與目的片段大小一致的陽性菌種的菌液200 μL，送至上海生工生物有限公司進(jìn)行測序。測序正確的菌液中加入20%的滅菌甘油于1.5 mL 離心管，-80 ℃冰箱保存。

1.2.3pGBKT-7-上游調(diào)控因子載體的毒性檢測 將前期篩選得到的7 個IbMYB1上游調(diào)控因子（IbERF1、IbPGP19、IbPDC、IbEIN3-2、IbJOX4、IbSCF 和IbWRKY1），分別構(gòu)建pGBKT-7-上游調(diào)控因子酵母重組表達(dá)載體，將重組載體與空載體pGBKT-7 分別轉(zhuǎn)到酵母Y2HGold 細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化的酵母菌液均勻涂布在SD/-Trp 培養(yǎng)基，觀察重組表達(dá)載體與空載體酵母菌株生長情況，進(jìn)行毒性檢測。選擇載體中EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ作為目的片段插入的酶切位點(diǎn)，合成引物序列。LB 固體培養(yǎng)基含Kan 抗性，使用Magen 質(zhì)粒小量提取試劑盒提取構(gòu)建好的酵母重組表達(dá)載體質(zhì)粒，-20℃保存。

1.2.4pGBKT-7-IbERF1菌株最低AbA濃度的確定自激活試驗結(jié)果顯示，pGBKT-7-IbERF1菌株具有自激活活性，需確定抑制其自激活活性的最低金擔(dān)子素A（AbA）濃度。從Y2H［pAGBKT-7-IbERF1］、陽性對照和陰性對照的培養(yǎng)皿中挑取較大的單克隆菌落，將0.9 % NaCl 重懸溶液稀釋成10-1、10-2和10-3濃度梯度。吸取10 μL 重懸菌液于相應(yīng)缺素培養(yǎng)基和添加不同濃度AbA 的缺素培養(yǎng)基上培養(yǎng)。若在某濃度下菌落Y2H［pAGBKT-7-IbERF1］和陰性對照不生長，而陽性對照正常生長，則該濃度為該酵母菌株的最低AbA 濃度，可用于后續(xù)試驗。

1.2.5酵母雙雜交載體的構(gòu)建與Y2HGold 酵母轉(zhuǎn)化 使用酵母雙雜交的方法，研究7 個IbMYB1上游調(diào)控因子的相互作用。構(gòu)建酵母雙雜交試驗所需的載體，通過轉(zhuǎn)化酵母Y2H 驗證蛋白與蛋白之間的相互作用，將IbERF1構(gòu)建到pGADT-7 載體中，將IbPGP19、IbPDC、IbEIN3-2、IbJOX4、IbSCF和IbWRKY1構(gòu)建到pGBKT-7 載體中。LB 固體培養(yǎng)基含Kan 抗性，使用Magen 質(zhì)粒小量提取試劑盒提取構(gòu)建好的酵母重組表達(dá)載體質(zhì)粒，-20 ℃保存。

酵母轉(zhuǎn)化參照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 進(jìn)行，取5 μL Yeastmaker Carrier DNA 于95 ℃水浴5 min 使其變性，快速置于冰上至溫度降至4 ℃（重復(fù)1 次）。在已預(yù)冷的1.5 mL 離心管中依次加入500 μL PEG/LiAc（50 μL TE、50 μL LiAc、400 μL PEG4000）、5 μL 變性的Yeastmaker Carrier DNA、100 ng 重組融合表達(dá)質(zhì)粒、50 μL Y2HGold 感受態(tài)細(xì)胞，渦旋混勻，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化30 min（期間每隔10 min 輕輕倒混數(shù)次）。加入20 μL DMSO，輕混勻，置于42 ℃水浴中15 min（期間每隔5 min 輕輕倒混數(shù)次）。12 000 r/min 離心30 s，棄上清，加入0.9% NaCl 溶液1 mL，重懸菌體。吸取200 μL 轉(zhuǎn)化后的酵母菌液，涂布于SD/-Trp 培養(yǎng)皿。30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48～96 h。從缺陷培養(yǎng)基SD/-Trp 培養(yǎng)皿上挑取陽性克隆，轉(zhuǎn)移到含AbA 的缺陷培養(yǎng)基SD/-His/AbA，觀察其生長情況。再從缺陷培養(yǎng)基SD/-His/AbA 挑取陽性克隆，轉(zhuǎn)移到缺陷培養(yǎng)基SD/-His/AbA/X-a-Gal plus，30 ℃避光條件培養(yǎng)2～3 d，觀察酵母生長情況，拍照記錄。

1.2.6雙分子熒光互補(bǔ)載體的構(gòu)建 將IbERF1構(gòu)建到pSAT4-nEYFP-C1 載體中，將IbSCF和IbWRKY1構(gòu)建到pSAT4-cEYFP-C1 載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體瞬時表達(dá)蛋白，在共聚焦顯微鏡下觀察檢測GFP 信號并拍照，在活細(xì)胞內(nèi)驗證蛋白與蛋白之間的相互作用，選擇pSAT4-nEYFP-C1 和pSAT4-cEYFP-C1 載體中作為目的片段插入的酶切位點(diǎn)為BglII 和BamH I，合成引物序列。LB固體培養(yǎng)基含Amp 抗性，使用Magen 質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7擬南芥原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化 擬南芥原生質(zhì)體的制備：將配制好的酶解液于55 ℃水浴鍋中預(yù)熱，4 周后選擇抽苔前的野生型擬南芥葉片，將葉片下表皮撕掉迅速置于酶解液中。25 ℃、50 r/min 避光輕微振動酶解50 min，至葉肉細(xì)胞酶解完全，顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞較圓、透亮?xí)r狀態(tài)較好。

用等體積的W5 稀釋酶液，輕輕混勻，然后將洗干凈的75 μm 尼龍網(wǎng)布用W5 浸濕后過濾原生質(zhì)體。800 r/min 離心2 min，盡量吸去上清，用1 mL W5 溶液重懸原生質(zhì)體（3 次重復(fù)）。將原生質(zhì)體重懸于1 mL W5 溶液中，冰上放置30 min，備用。

擬南芥原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化：2 mL EP 管中加入10～20 μg 目的質(zhì)粒，加入100 μL 擬南芥原生質(zhì)體，輕輕混勻后立即放置冰上。加入110 μL PEG/CaCl2，輕彈離心管使之混勻，室溫孵育10 min。加入220 μL W5 溶液，顛倒離心管使其混勻，放置1 min。再向離心管加入440 μL W5 溶液，輕輕顛倒，放置1 min。最后向離心管加入880 μL W5溶液，顛倒混勻，放置1 min。4 ℃ 800 r/min 離心3 min，吸去上清。原生質(zhì)體用500 μL W5 溶液重懸，22 ℃黑暗條件培養(yǎng)16～20 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGBKT-7-上游調(diào)控因子載體的毒性檢測

pGBKT-7-上游調(diào)控因子毒性檢測，觀察pGBKT-7-上游調(diào)控因子載體與空載在SD/-Trp培養(yǎng)基上單克隆菌落的生長情況，結(jié)果顯示，試驗組和對照單克隆菌落在數(shù)量和大小上無明顯差異（圖1），說明pGBKT-7-上游調(diào)控因子載體對酵母沒有毒性。

2.2 最低AbA 濃度的確定

將已檢測的具有自激活活性的上游調(diào)控因子單克隆陽性菌體置于10 μL 0.9% NaCl 溶液重懸菌液，將重懸容液稀釋為10-1、10-2和10-3濃度梯度，點(diǎn)在SD/-Trp 和SD/-Trp/AbA（100～1 000 ng/mL）培養(yǎng)基培養(yǎng)。結(jié)果顯示，pGBKT7-IbERF1自激活A(yù)bA 最低抑制濃度為600 ng/mL。

2.3 酵母雙雜交檢測IbMYB1 上游調(diào)控因子之間的相互作用

將具有自激活活性的IbERF1與pGADT-7 連接構(gòu)建重組載體，其余上游調(diào)控因子與pGBKT-7連接構(gòu)建重組載體，進(jìn)行酵母雙雜交試驗檢測其相互作用，結(jié)果顯示，IbERF1 與IbSCF、IbWRKY1 存在相互作用（圖2），IbERF1 與IbPDC、IbPGP19、IbJOX4 和IbEIN3-2 不存在相互作用。

圖2 酵母雙雜交檢測 IbMYB1 啟動子上游調(diào)控因子的相互作用Fig.2 Interaction detection among upstream transcription factors on the promoter of IbMYB1 by yeast two-hybrid assay

2.4 雙分子熒光互補(bǔ)試驗檢測IbMYB1 上游調(diào)控因子之間的相互作用

用雙分子熒光互補(bǔ)試驗對酵母雙雜交檢測結(jié)果進(jìn)行驗證，檢測上述蛋白在植物細(xì)胞中是否存在相互作用。將IbERF1與EYFP 蛋白N 端融合，IbSCF和IbWRKY1與EYFP 蛋白C 端融合，然后將帶EYFP 蛋白N 端的融合質(zhì)粒和帶EYFP 蛋白C 端的融合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體中進(jìn)行表達(dá)，若兩個蛋白有相互作用，則EYFP 蛋白N 端和C 端靠近形成完整的蛋白，能檢測到熒光信號。

由圖3 可知，GFP 熒光蛋白在擬南芥原生質(zhì)體里呈現(xiàn)組成型表達(dá)，在整個原生質(zhì)體中均有表達(dá)，IbERF1-nYFP+cYFP 和nYFP+IbSCF/IbWRKY1-cYFP 分別轉(zhuǎn)到擬南芥原生質(zhì)體中都未檢測到熒光信號，說明這3 個蛋白與空載并沒有相互作用，而共轉(zhuǎn)到擬南芥原生質(zhì)體后能夠檢測到明顯的熒光信號，且熒光信號均在細(xì)胞核內(nèi)，說明IbERF1蛋白與IbSCF 和IbWRKY1 蛋白在細(xì)胞核中可發(fā)生相互作用，兩者形成復(fù)合物共同調(diào)控基因的表達(dá)。

圖3 雙分子熒光互補(bǔ)試驗檢測IbERF1 與其他上游調(diào)控因子在擬南芥原生質(zhì)體的相互作用Fig.3 Interaction detection among IbERF1 and other upstream transcription factors by BiFC experiment in Arabidopsis thaliana protoplast

2.5 IbMYB1 上游調(diào)控因子表達(dá)分析

從圖4 可以看出，不同發(fā)育時期紫心甘薯柴根、膨大根和塊根中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量均高于白心甘薯根，說明花色素苷的合成需要這些轉(zhuǎn)錄因子的大量表達(dá)。IbERF1基因在紫心甘薯根不同時期的表達(dá)量均低于白心甘薯，且隨著根中花色素苷的積累其表達(dá)量逐漸減低，推測IbERF1可能負(fù)調(diào)控花色素苷的合成。IbWRKY1與IbSCF基因在紫心甘薯和白心甘薯根不同發(fā)育時期中的表達(dá)量與花色素苷的積累沒有呈現(xiàn)單一的正相關(guān)或者負(fù)相關(guān)，推測這些基因參與紫心甘薯花色素苷的合成與調(diào)控可能還存在更為復(fù)雜的機(jī)制。

圖4 紫心甘薯與白心甘薯不同根系階段花色素苷合成調(diào)控基因的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of anthocyanin synthesis regulatory genes in purple-fleshed and white-fleshed sweet potato at different root stages

3 討論

花色素是目前發(fā)現(xiàn)最有效的天然抗氧化物質(zhì)［1］，近年來廣泛受到人們的青睞。紫心甘薯中調(diào)控花色素苷合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子IbMYB1上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之間存在的互作關(guān)系鮮有報道。本研究采用酵母雙雜交試驗，對7 個IbMYB1上游調(diào)控因子（IbERF1、IbPDC、IbPGP19、IbSCF、IbWRKY1、IbJOX4 和IbEIN3-2）之間的相互作用進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，IbERF1 與IbSCF、IbWRKY1 存在相互作用，雙分子熒光互補(bǔ)試驗證實了酵母雙雜交的試驗結(jié)果。

乙烯響應(yīng)因子ERF 家族蛋白屬于已知最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，參與多個生理過程［14］。在植物中，轉(zhuǎn)錄因子ERF 參與花色素苷生物合成的調(diào)控。比較紫心甘薯和白心甘薯的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，花色苷合成結(jié)構(gòu)基因受轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控，參與調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子有MYB、bHLH、ERF 和WRKY［15］。比較紫花和白花的轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)可知，在紫色花中分別檢測到MYB、bHLH、AP2/ERF、WD40、WRKY 和Zinc-finger轉(zhuǎn)錄因子14、9、1、33、4、12 個，其中上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量分別為10、6、0、30、4、10 個［16］。轉(zhuǎn)錄因子ERF 與MYB 存在相互作用，轉(zhuǎn)錄因子ERF 既可以與轉(zhuǎn)錄因子MYB 蛋白結(jié)合調(diào)控花色素苷合成相關(guān)基因的表達(dá)，也可與MYB基因啟動子結(jié)合調(diào)控其表達(dá)。在蘋果的愈傷組織中過表達(dá)MdERF1B，乙烯合成途徑中的相關(guān)基因MdACO1、MdERF1和MdERF3與花色素苷合成與調(diào)控相關(guān)的基因MdCHS、MdCHI、MdF3H、MdDFR、MdANS、MdLAR、MdANR、MdMYB9和MdMYB11均顯著上調(diào)，花色素苷和原花色素苷含量也明顯上升。通過酵母雙雜交、雙分子熒光互補(bǔ)和pull-down 試驗結(jié)果顯示，MdERF1B與MdMYB9、MdMYB1 和MdMYB11 蛋白存在相互作用。酵母單雜交和EMSA 試驗結(jié)果顯示，MdERF1B 與MdMYB9、MdMYB1和MdMYB11的啟動子具有相互作用。在LUC 試驗中，MdERF1B主要通過激活MdMYB9和MdMYB11啟動子的活性來調(diào)控其基因表達(dá)［17］。在紅皮梨中，PpERF24和PpERF96 與PpMYB114 調(diào)節(jié)藍(lán)光誘導(dǎo)的花色素苷合成，PpERF24 和PpERF96 加強(qiáng)PpMYB114 和PpbHLH3 蛋白的相互作用，也加強(qiáng)PpMYB114 誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)［18］。在紅皮梨中，PpERF3與PpMYB114、PpbHLH3 形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物調(diào)控紅皮梨中花色素苷的合成［19］。WRKY基因家族是高等植物轉(zhuǎn)錄因子家族中一個大家族，在植物生理過程和環(huán)境適應(yīng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起重要作用［20］。在甘薯中，WRKY 蛋白（SPF1）的cDNA 序列被首次克?。?1］。有報道發(fā)現(xiàn)，WRKY 參與花色素苷合成的調(diào)控，如WRKY40 參與蘋果中花色素苷合成的調(diào)控［22］。SCF 蛋白（GID2）復(fù)合物介導(dǎo)了DELLA 蛋白（GAI、RGA 和RGL2）的泛素化和降解。本研究結(jié)果顯示，IbERF1 與IbSCF 和IbWRKY1 相互作用參與紫心甘薯中參與花色素苷合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子IbMYB1表達(dá)，為提高甘薯花色素苷含量的分子定向育種提供新的操作元件和研究思路。

4 結(jié)論

酵母雙雜交與雙分子熒光互補(bǔ)試驗發(fā)現(xiàn)，紫心甘薯IbMYB1上游7 個調(diào)控蛋白中，IbERF1 與IbSCF、IbWRKY1 存在相互作用。定量檢測結(jié)果顯示，IbERF1基因在紫心甘薯根不同時期的表達(dá)量均低于白心甘薯，且隨著根中花色素苷的積累其表達(dá)量逐漸降低，推測IbERF1可能負(fù)調(diào)控花色素苷的合成。IbWRKY1和IbSCF基因在紫心甘薯和白心甘薯根不同發(fā)育時期中的表達(dá)量，與花色素苷的積累未呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)或者負(fù)相關(guān)關(guān)系，推測這些基因參與紫心甘薯花色素苷的合成與調(diào)控可能還存在更為復(fù)雜的機(jī)制。本研究結(jié)果為進(jìn)一步深入闡釋紫心甘薯塊根及地下部分特異性合成與積累花色素苷的調(diào)控機(jī)理奠定基礎(chǔ)。