王 鵬，郭 兵，王海鳳，方素芳，顧小龍，關 琛，劉康雅，崔 平*

（ 1． 河北北方學院動物科技學院，河北 張家口 075000 ；2． 張家口市畜牧技術推廣站，河北 張家口 075000 ； 3． 中糧飼料（唐山）有限公司，河北 唐山 064100 ）

雞球蟲病是多種艾美耳屬球蟲寄生在雞腸道上皮細胞而引起的一種原蟲病[1]，疫病流行普遍，可感染不同日齡的雞，對雞群造成不同程度的影響，嚴重危害養(yǎng)禽產(chǎn)業(yè)發(fā)展[2-3]。在世界公認的雞球蟲有效種中以柔嫩艾美耳球蟲與毒害艾美耳球蟲致病性最強[4]。目前，大多養(yǎng)殖戶仍采用化學合成藥物對雞球蟲病進行預防、治療，導致球蟲的耐藥性越來越強[5-6]。本研究從張家口某養(yǎng)雞場的糞樣和患病雛雞盲腸內(nèi)容物中分離到柔嫩艾美耳球蟲，并通過形態(tài)學和分子生物學方法進行鑒定，選取常用抗球蟲藥物進行耐藥性檢測，旨在摸清張家口地區(qū)雞球蟲的耐藥性情況，并為雞場合理選擇抗球蟲藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與處理

從張家口某養(yǎng)雞場取新鮮糞便或病死雞盲腸內(nèi)容物，通過飽和鹽水漂浮法分離球蟲卵囊，經(jīng)80目和100目銅網(wǎng)過濾，收集濾液置至500 mL錐形瓶中，加2.5%重鉻酸鉀溶液，濃度為每毫升1×106個卵囊，置于27～28 ℃恒溫搖床培養(yǎng)3 d，搖床轉(zhuǎn)速100～120 r/min，當孢子化卵囊達到85%以上停止孵化，于4 ℃保存。

1.2 形態(tài)學鑒定

將孢子化的卵囊懸液置于載玻片上鏡檢，參考文獻[7-8]中描述的雞球蟲孢子化卵囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，對樣品進行蟲種的形態(tài)學鑒定。

1.3 分子生物學鑒定

用純化孢子化卵囊，按照基因組DNA 提取試劑盒說明分別對分離得到的孢子化卵囊提取基因組DNA，以GenBank上KY117231.1、KY117230.1、KY117229.1基因序列為參考，選出柔嫩艾美耳球蟲特異性保守區(qū)域，采用Premier 5.0 設計引物。引物序列為上游引物:5'-TCCTACATGCAACTGGAGCA-3'，下游引物:5'-CCCAGTGGGTTACTAGATCCG-3'，片段大小379 bp。由上?；瞪锟萍加邢薰竞铣伞?/p>

反應體系（25 μL）:PCR Mix 12 μL、上游引物（50 pmoL） 1μL、下游引物（50 pmoL) 1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 10 μL。

PCR 反應條件:94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存，電泳觀察結(jié)果。

1.4 耐藥性檢測-雞體試驗法[9]

1.4.1 試驗藥物與給藥途徑

按每150 mL 地克珠利溶液添加300 kg 水，磺胺氯吡嗪鈉可溶性粉按每50 g添加160 kg水，兩種藥物均通過飲水給藥。

1.4.2 試驗設計

選取25日齡且體重接近的黃羽肉雞132只，隨機分為6組，其中4個組是攻毒用藥組，包括地克珠利組A、地克珠利組B、磺胺氯吡嗪鈉組A、磺胺氯吡嗪鈉組B，另外2組分別是攻毒不給藥組（陽性對照組）、不攻毒不給藥組（陰性對照組）。4 個攻毒用藥組和1 個攻毒不給藥組中的試驗雞于第26 日齡分別經(jīng)嗉囊接種1×104個柔嫩艾美耳球蟲分離株孢子化卵囊。攻毒前1 d 對各藥物試驗組進行用藥，連續(xù)用藥8 d。

1.4.3 臨床觀察和卵囊計數(shù)

攻毒后每日觀察各組試驗雞的精神狀態(tài)、采食、飲水、糞便等情況，當發(fā)現(xiàn)有血便排出時進行血便記分。試驗期間，若有雞死亡需及時解剖并觀察病變處，以便確認是否是由雞球蟲病引起的死亡，同時記錄死亡雞個數(shù)。

攻毒后第6 d開始，每天收集各感染組雞糞便，采用麥克馬斯特氏法進行卵囊計數(shù)；攻讀后第8 d，所有試驗組雞先稱重后進行屠宰、解剖，觀察盲腸病變并進行病變記分。當兩側(cè)盲腸病變結(jié)果不一致時，按較嚴重的一側(cè)為準，凡由于盲腸球蟲病導致死亡的雞記4分。同時，取盲腸內(nèi)容物及腸黏膜，采用胃蛋白酶消化后收集卵囊，并進行卵囊計數(shù)。將腸道中的卵囊數(shù)與同一感染組第6～8 d糞便中的卵囊數(shù)相加，即為該組的卵囊總產(chǎn)量，計算該組每只雞的平均卵囊數(shù)。

1.5 耐藥指標與判定標準

各感染給藥組耐藥指標的測定與判定方法見表1。

表1 雞球蟲常用的耐藥指標與判定方法Tab.1 Commonly used drug resistance indexes and judging methodsof chicken coccidiosis

各指標計算方法參考以下公式:

盲腸內(nèi)容物的卵囊值采用角田清[10]的方法進行計算，換算方法見表2。

表2 盲腸內(nèi)容物的卵囊值Tab.2 Oocyst values of cecal content

依據(jù)POAA、RLS、ROP和ACI等4個指標中存在陽性耐藥的量，以此確定柔嫩艾美耳球蟲張家口株對地克珠利與磺胺氯吡嗪鈉的耐藥程度:4 個指標均為陰性判定為無耐藥性；1個指標呈陽性判定為輕度耐藥；2個指標呈陽性判定為中度耐藥；3或4個指標呈陽性則判定為完全耐藥。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞球蟲卵囊的形態(tài)學觀察（見圖1）

圖1 雞球蟲卵囊的形態(tài)學觀察Fig.1 Morphological observation of chicken coccidiosis oocysts

由圖1 可知，采用飽和鹽水漂浮法收集糞便中和病死雞盲腸中的卵囊，培養(yǎng)至孢子化，鏡檢發(fā)現(xiàn)視野中卵囊呈卵圓形、橢圓形或近似圓形的球蟲。

2.2 雞球蟲的PCR鑒定結(jié)果（見圖2）

圖2 分離蟲株PCR鑒定結(jié)果Fig.2 Insect strain isolated PCR identification results

由圖2 可知，提取從張家口某雞場分離獲得的雞球蟲DNA，利用柔嫩艾美耳球蟲特異性引物進行PCR擴增得到約379 bp 的目的條帶，無其他球蟲種的條帶出現(xiàn)，與預期結(jié)果一致，表明試驗分離的球蟲為柔嫩艾美耳球蟲。

2.3 分離蟲株耐藥性分析

2.3.1 臨床觀察結(jié)果

整個試驗期內(nèi)，除陽性對照組出現(xiàn)明顯的柔嫩艾美耳球蟲引起的癥狀以及死亡外，其他攻毒給藥組與陰性對照組的雞生長狀態(tài)均正常。

2.3.2 不同藥物對感染球蟲雛雞增重及POAA 的影響（見表3）

表3 不同藥物對感染球蟲雛雞增重及POAA的影響Tab.3 Effects of different drugs on weight gain and POAA of chicks infected with coccidia

由表3 可知，陰性對照組雞的增重為669.3 g，高于攻毒給藥組與陽性對照組；磺胺氯吡嗪鈉組增重效果比地克珠利組好?；前仿冗拎衡c組的POAA均大于50%，呈耐藥陰性；地克珠利組POAA均小于50%，為耐藥陽性。

2.3.3 不同藥物對感染球蟲雛雞盲腸病變記分及RLS 的影響（見表4）

表4 不同藥物對感染球蟲雛雞盲腸病變記分及RLS的影響Tab.4 Effects of different drugs on cecal lesion score and RLS of chicks infected with coccidia

由表4可知，排血便數(shù)最多的是陽性對照組，血便記分均為3.40分，有3只雞死亡；排血便數(shù)最少的是磺胺氯吡嗪鈉給藥組，血便記分為0，無死亡情況?；前仿冗拎衡c組RLS 均為61.76%，呈耐藥陰性。地克珠利組排血便數(shù)較多，血便記分為2.65、2.68分，每組死亡2只雞，RLS分別為22.06%和21.18%，均小于50%，呈耐藥陽性。整個試驗期間陰性對照組雞均正常，盲腸未見異常變化，試驗結(jié)束時糞檢未見卵囊。

2.3.4 不同藥物對感染球蟲雛雞盲腸卵囊產(chǎn)量的影響（見表5）

表5 不同藥物對感染球蟲雛雞盲腸卵囊產(chǎn)量的影響Tab.5 Effects of different drugs on cecal oocyst production of chicks infected with coccidia

由表5可知，陰性對照組雛雞的盲腸內(nèi)均無卵囊，陽性對照組卵囊數(shù)量最多，兩個地克珠利組的ROP 值均高于50%，表明張家口分離株柔嫩艾美耳球蟲對地克珠利具有耐藥性。兩個磺胺氯吡嗪鈉組的ROP值均低于15%，均為不耐藥即藥物敏感。

2.3.5 不同藥物對感染球蟲雛雞ACI的影響（見表6）

表6 不同藥物對感染球蟲雛雞ACI的影響Tab.6 Effects of different drugs on ACI in chicks infected with coccidia

ACI 是根據(jù)存活率、相對增重率、病變值等多項參數(shù)綜合判定球蟲耐藥性的藥效指標。

由表6 可知，磺胺氯吡嗪鈉組1 的ACI 值最高，達到159.79，呈耐藥陰性，屬于抗球蟲高效水平；地克珠利組ACI 值分別為148.70 和134.70，均低于160，呈耐藥陽性。結(jié)果表明，張家口柔嫩艾美耳球蟲分離株對地克珠利耐藥，對磺胺氯吡嗪鈉部分敏感。

2.3.6 分離蟲株對磺胺氯吡嗪鈉和地克珠利耐藥性的綜合判定結(jié)果（見表7）

表7 分離蟲株對磺胺氯吡嗪鈉和地克珠利耐藥性的綜合判定結(jié)果Tab.7 Results of comprehensive evaluation of resistance to sulfameclopyrazine sodium and diclazuril in isolated strains

由表7可知，綜合POAA、RLS、ROP和ACI等4項指標判定，分離蟲株對磺胺氯吡嗪鈉對地克珠利完全耐藥，對磺胺氯吡嗪鈉表現(xiàn)輕度耐藥。

3 討論

雞球蟲蟲種之間僅依靠形態(tài)特征及其病理變化進行區(qū)分很難完成，所以需要結(jié)合分子生物學方法對球蟲種類進行鑒定[11-12]。本試驗從發(fā)病雛雞的盲腸內(nèi)容物中分離到球蟲，利用艾美耳屬球蟲特異性引物對已分離的球蟲進行PCR 檢測以鑒定蟲種。PCR 鑒定結(jié)果顯示擴增出約379 bp 的目的條帶，無其他球蟲種的條帶出現(xiàn)，與預期結(jié)果一致，確定分離的球蟲為柔嫩艾美耳球蟲。本鑒定方法適用于規(guī)?；B(yǎng)殖場的檢測，便于在現(xiàn)場監(jiān)控球蟲病的流行情況，為制定球蟲病的防治措施提供了一定參考。

目前，使用抗球蟲藥物是控制球蟲病的主要手段，但球蟲耐藥是一個動態(tài)過程[13-14]。本研究選用雞體試驗方法，檢測了張家口地區(qū)分離到的柔嫩艾美耳球蟲對抗球蟲藥物磺胺氯吡嗪鈉和地克珠利的耐藥性，以RLS、POAA、ROP 和ACI等4項指標進行球蟲耐藥性評價?？傮w來看，張家口地區(qū)雞球蟲對本試驗所選取的磺胺氯吡嗪鈉和地克珠利兩種藥物表現(xiàn)不同程度的耐藥，分離蟲株對磺胺氯吡嗪鈉輕度耐藥，對地克珠利完全耐藥。鑒于這一檢測結(jié)果，建議該地區(qū)停用地克珠利，使用磺胺氯吡嗪鈉。但產(chǎn)蛋期禁用磺胺氯吡嗪鈉，且肉雞需要保證休藥期。所以，蛋雞在產(chǎn)蛋期必須選用其他抗球蟲藥，同時定期進行耐藥性的監(jiān)測。使用抗球蟲藥物時應進行交替用藥或聯(lián)合用藥，以延長藥物的使用壽命，同時還必須做好飼養(yǎng)管理等綜合性防治措施[15]。

4 結(jié)論

由于養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展以及抗球蟲藥物長期使用，張家口地區(qū)雞球蟲均已出現(xiàn)不同程度的耐藥性。本研究雖然能夠為張家口地區(qū)的雞球蟲病防治提供一些參考，但若要徹底解決球蟲對當?shù)仞B(yǎng)雞業(yè)的阻礙還需從多方面努力。養(yǎng)雞企業(yè)在搞好日常管理的同時，有條件的雞場最好進行球蟲耐藥性測定，根據(jù)測定結(jié)果制定適合本場的預防和治療用藥方案，將球蟲病的威脅降至最低，以減少經(jīng)濟損失、提高養(yǎng)殖效益。