王金多 李瀾瀟 徐慶陽(yáng)

摘要：為了降低賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中“三廢”的排放，減少成分復(fù)雜的玉米漿對(duì)發(fā)酵液的影響，提高分離提取良品率，該研究?jī)?yōu)化了L-賴氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌LS260的發(fā)酵條件，通過(guò)氮源分析，采用近似等效替代法，使用玉米小分子肽替代玉米漿，通過(guò)5 L生物反應(yīng)器發(fā)酵試驗(yàn)探究清潔發(fā)酵工藝的可行性，通過(guò)單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分，結(jié)合營(yíng)養(yǎng)適量流加發(fā)酵控制工藝，確定了最適合LS260的發(fā)酵條件。結(jié)果顯示，通過(guò)氮源等效替代試驗(yàn)，賴氨酸產(chǎn)量為124 g/L，轉(zhuǎn)化率提高至71.5%；通過(guò)營(yíng)養(yǎng)適量流加工藝將產(chǎn)量提高至136 g/L，發(fā)酵上清液透光率提高至84.4%；由單因素試驗(yàn)、響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)可知，生物素、KH2PO4的最適添加量分別為3.2 mg/L、4.11 g/L，最適接種量為25.49%。在試驗(yàn)所得的最適條件下，賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到160.3 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到71.5%。結(jié)果顯示，最終產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率與模型數(shù)值基本相符，發(fā)酵液上清液透明度大幅降低，為提取工藝進(jìn)一步優(yōu)化創(chuàng)造了條件，試驗(yàn)結(jié)果具有較好的工業(yè)應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：L-賴氨酸；玉米小分子肽；清潔發(fā)酵；谷氨酸棒桿菌；響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)：TS211.2????? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A???? 文章編號(hào)：1000-9973（2023）08-0018-06

Application and Process Optimization of Maize Small-Molecule Peptides in Lysine Fermentation

WANG Jin-duo1，2，3， LI Lan-xiao1，2，3， XU Qing-yang1，2，3*

（1.College of Bioengineering， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China;

2.National and Local United Engineering Laboratory of Metabolic Control Fermentation

Technology， Tianjin 300457， China; 3.Tianjin Engineering Laboratory of Efficient

and Green Amino Acid Manufacturing， Tianjin 300457， China）

Abstract： In order to reduce the emission of “three wastes” in the lysine fermentation production， reduce the effect of corn pulp with complex components on the fermentation broth， and improve the separation and extraction rate， in this study， the fermentation conditions of L-lysine producing bacterium Corynebacterium glutamicum LS260 is optimized. Through nitrogen source analysis， the approximate equivalent substitution method is adopted to replace corn pulp with maize small-molecule peptides， and the feasibility of clean fermentation process is explored through 5 L bioreactor fermentation test. The nutrients of the medium are further optimized by single factor test and response surface optimization test， and the optimal fermentation conditions for LS260 are determined by combining the nutrient-appropriate flow-adding fermentation control process. The results show that through the nitrogen source equivalent substitution test， the yield of lysine is 124 g/L and the conversion rate increases to 71.5%. The yield increases to 136 g/L and the light transmittance of fermentation supernatant increases to 84.4% by nutrient-appropriate flow-adding process. According to single factor test and response surface method optimization test， the optimal addition amount of biotin and KH2PO4 is 3.2 mg/L and 4.11 g/L respectively， and the optimal inoculation amount is 25.49%. Under the optimal conditions， the yield of lysine reaches 160.3 g/L and the conversion rate reaches 71.5%. The results show that the final yield and conversion rate are basically consistent with the model values， and the transparency of fermentation broth supernatant is greatly reduced， which has created conditions for further optimization of the extraction process. The test results have a good prospect for industrial application.

Key words： L-lysine; maize small-molecule peptide; clean fermentation; Corynebacterium glutamicum; response surface optimization

收稿日期：2023-02-24

基金項(xiàng)目：天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目（TSBICIP-KJGG-005-08）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021ZDSYS10）；天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（21ZYQCSY00050）

作者簡(jiǎn)介：王金多（1997－），男，碩士，研究方向：代謝工程與發(fā)酵過(guò)程控制。

通信作者：徐慶陽(yáng)（1980-），男，研究員，博士生導(dǎo)師，博士，研究方向：代謝工程與發(fā)酵過(guò)程控制。

L-賴氨酸作為人和動(dòng)物的八大必需氨基酸之一，在醫(yī)療、畜牧業(yè)及食品工業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用[1]。在飼料中添加賴氨酸，能夠促進(jìn)牲畜的生長(zhǎng)速度，改善飼料中氨基酸平衡，提高飼料和蛋白質(zhì)資源的利用效率，提高出欄率并減少飼養(yǎng)成本。飼料中添加適量的賴氨酸能夠提高出欄時(shí)牲畜的肉質(zhì)及瘦肉率，亦可增強(qiáng)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的抵抗力。由于分解法和化學(xué)合成法制得的賴氨酸很難達(dá)到獸用標(biāo)準(zhǔn)，不能直接產(chǎn)出，現(xiàn)多通過(guò)發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸，但在發(fā)酵過(guò)程中多采用營(yíng)養(yǎng)豐富但成分復(fù)雜的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物，如：玉米漿、大豆蛋白水解液、糖蜜等，但受季節(jié)、產(chǎn)地、作物品種等變化導(dǎo)致的發(fā)酵培養(yǎng)基成分波動(dòng)在一定程度上影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸[2]，且在產(chǎn)物分離提取過(guò)程中，由于農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物中常含有大量色素、雜蛋白，造成提取過(guò)程中耗水、耗電；產(chǎn)生的固形廢物、含鹽廢水亦會(huì)對(duì)周?chē)恋丶八h(huán)境產(chǎn)生惡劣影響。賴氨酸的發(fā)酵過(guò)程屬于典型的高密度發(fā)酵，菌體在積累賴氨酸的過(guò)程中受到多個(gè)關(guān)鍵酶的共同調(diào)控[3]。在分析玉米漿、糖蜜、大豆蛋白水解液主要組分后，探究使用成分穩(wěn)定且環(huán)境友好的玉米小分子肽做近似等效替代，探究清液發(fā)酵在賴氨酸生產(chǎn)方面的可行性。

1 材料與方法

1.1 菌種

谷氨酸棒桿菌LS260：保藏于天津科技大學(xué)代謝工程研究室。

1.2 培養(yǎng)

1.2.1 種子培養(yǎng)基

葡萄糖80 g/L，玉米漿干粉20 g/L，（NH4）2SO4·7H2O 6 g/L，KH2PO4 1.7 g/L，MgSO4 0.6 g/L，VB1 1.5 mg/L，VB5 1.5 mg/L，VB12 1.5 mg/L，VH 2 mg/L。

1.2.2 對(duì)照發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖60 g/L，玉米漿干粉25 g/L，（NH4）2SO4·7H2O 5 g/L，KH2PO4 4 g/L，MgSO4 1 g/L，VB1 1 mg/L，VB5 1 mg/L，VB12 1 mg/L，VH 1.5 mg/L。

1.2.3 清液發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖60 g/L，玉米小分子肽25 g/L，（NH4）2SO4·7H2O 5 g/L，KH2PO4 4 g/L，MgSO4 1 g/L，VB1 1 mg/L，VB5 1 mg/L，VB12 1 mg/L，VH 1.5 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 50 mg/L，MnSO4·H2O 110 mg/L，CuSO4·5H2O 2 mg/L，ZnSO4 10 mg/L，PLP 5 mg/L。

1.2.4 流加培養(yǎng)基

玉米小分子肽7 g/L，VB1、VB3、VB5、VB12 分別為2.5 mg/L，VH 2 mg/L，甜菜堿 3 g/L，氯化膽堿 4 g/L。

1.2.5 斜面培養(yǎng)基

葡萄糖1 g/L，酵母粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，（NH4）2SO4·7H2O 5 g/L，KH2PO4 4 g/L，MgSO4 1 g/L。

1.3 主要儀器

儀器與設(shè)備見(jiàn)表1。

1.4 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：一代試管斜面活化2支，恒溫箱32 ℃培養(yǎng)24 h，二代茄形瓶斜面活化2支，恒溫箱32 ℃培養(yǎng)18 h。

種子罐培養(yǎng)：接種量2支茄形瓶，發(fā)酵體積2 L，培養(yǎng)溫度34 ℃，pH 7.0～7.2，溶氧45%以上，轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，種子培養(yǎng)12～15 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：接種量600 mL，發(fā)酵體積3 L，培養(yǎng)溫度34 ℃，pH 7.0～7.2，溶氧30%以上，轉(zhuǎn)速與溶氧聯(lián)動(dòng)，發(fā)酵時(shí)間36 h。

1.5 檢測(cè)方法

1.5.1 pH值測(cè)定

梅特勒pH在線檢測(cè)，精密pH試紙輔助檢測(cè)。

1.5.2 菌體生物量測(cè)定

菌體生物量采用OD600 nm吸光度法測(cè)定，發(fā)酵液用容量瓶稀釋特定倍數(shù)后，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，吸光度×稀釋倍數(shù)得到實(shí)際OD值，可以直接表示菌體生物量[4]。

1.5.3 L-賴氨酸含量測(cè)定

發(fā)酵液中L-賴氨酸及副產(chǎn)物含量采用高效液相色譜法測(cè)定，采用Agilent C18色譜柱（15 mm×4.6 mm，3.5 μm），衍生劑為2，4-二硝基氟苯，柱前衍生[5]，流動(dòng)相為50%的乙腈、4.1 g/L的醋酸鈉溶液，柱溫33 ℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

1.5.4 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

1.6 糖酸轉(zhuǎn)化率計(jì)算方法

糖酸轉(zhuǎn)化率SA計(jì)算公式：

SA（%）=ρ×Vm×100%。

式中：ρ為L(zhǎng)-賴氨酸質(zhì)量濃度，g/L；V為發(fā)酵液總體積，L；m為總耗糖量，g。

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次試驗(yàn)的平均值。單因素方差分析后采用Dunnett-t檢驗(yàn)來(lái)確定數(shù)據(jù)差異的顯著性（P<0.05）[6]。

1.7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Box-Behnken中心組合試驗(yàn)：采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)條件優(yōu)化，以生物素添加量（A）、KH2PO4添加量（B）、接種量（C）為自變量，以L-賴氨酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。

1.8 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米漿與玉米小分子肽滅菌后蛋白含量對(duì)比分析

玉米漿作為賴氨酸發(fā)酵過(guò)程中最重要的氮源之一，對(duì)菌體生長(zhǎng)起著決定性作用。而玉米漿中的雜蛋白是影響發(fā)酵過(guò)程中菌體代謝和后提取過(guò)程中離子交換樹(shù)脂壽命的重要因素，雜蛋白的含量越高，賴氨酸成品的良品率越低。所以，選擇成分穩(wěn)定、蛋白含量低、色素含量少的氮源非常重要。

因生物來(lái)源類(lèi)似，選取玉米小分子肽作為賴氨酸發(fā)酵中玉米漿氮源的替代物質(zhì)。為了對(duì)比玉米小分子肽和玉米漿的蛋白質(zhì)含量，通過(guò)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見(jiàn)圖1。

經(jīng)過(guò)水解處理后的玉米小分子肽蛋白質(zhì)含量更少。一次滅菌后，玉米漿的蛋白質(zhì)含量比玉米小分子肽高129%。玉米漿雜蛋白含量過(guò)高，在發(fā)酵過(guò)程中菌體要代償性分解蛋白質(zhì)以獲取生長(zhǎng)必需的氮源[7]，剩余的蛋白質(zhì)在賴氨酸提取過(guò)程中容易導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量不合格，雜質(zhì)超標(biāo)，故玉米小分子肽作為發(fā)酵原料效果更優(yōu)。

2.2 玉米漿與玉米小分子肽滅菌后不同氨基酸含量對(duì)比分析

賴氨酸發(fā)酵是典型的生長(zhǎng)偶聯(lián)型，相對(duì)于成分復(fù)雜且需要主動(dòng)分解的蛋白質(zhì)而言，單分子氨基酸更容易被菌體利用，發(fā)酵接種后更容易適應(yīng)發(fā)酵培養(yǎng)基，延滯期更短，對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)速率更快，產(chǎn)酸速率更快，能夠有效提高菌體活力。

通過(guò)氨基酸分析儀對(duì)比玉米漿和玉米小分子肽中各種游離氨基酸含量，結(jié)果見(jiàn)圖2。

通過(guò)氨基酸分析儀對(duì)比分析，玉米漿與玉米小分子肽的氨基酸含量有較大區(qū)別[8-9]，玉米小分子肽大部分氨基酸含量比玉米漿高，主要是天冬氨酸高41.7%，蘇氨酸高7.3%，絲氨酸高58.4%，甘氨酸高28.6%，苯丙氨酸高69.3%，組氨酸高21.7%，丙氨酸高23.7%，纈氨酸高6.3%，異亮氨酸高8.6%，亮氨酸高11.5%；玉米小分子肽中的谷氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、賴氨酸相較于玉米漿含量稍低。

2.3 清潔發(fā)酵培養(yǎng)基與傳統(tǒng)培養(yǎng)基發(fā)酵對(duì)比探究

為了確定玉米小分子肽在賴氨酸發(fā)酵過(guò)程中的效果和對(duì)主要發(fā)酵參數(shù)的影響，從菌體量、產(chǎn)酸量、轉(zhuǎn)化率、色素含量幾個(gè)角度與傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行對(duì)比，從而確定進(jìn)一步優(yōu)化的可行性。

以傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照組，清潔發(fā)酵培養(yǎng)基為試驗(yàn)組。由圖3可知，從菌體的生長(zhǎng)曲線看，采用傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)基的對(duì)照組的生長(zhǎng)速率和最高菌體量明顯高于試驗(yàn)組，對(duì)照組的最高OD600 nm為141.6，相較試驗(yàn)組的107.2高24.29%，在生長(zhǎng)穩(wěn)定期后，試驗(yàn)組的生物量下降速率比對(duì)照組高50%；L-賴氨酸的產(chǎn)量與菌體生長(zhǎng)曲線走勢(shì)相似，產(chǎn)酸速率隨著菌體生長(zhǎng)速率的變化而變化，發(fā)酵前期，試驗(yàn)組的生長(zhǎng)速率明顯高于對(duì)照組，發(fā)酵10 h后，對(duì)照組的生長(zhǎng)速率明顯高于試驗(yàn)組，對(duì)照組最終產(chǎn)量為159 g/L，試驗(yàn)組最終產(chǎn)量為124 g/L，相較于對(duì)照組下降22.01%。對(duì)照組培養(yǎng)基天然成分豐富，且培養(yǎng)基中維生素[10]、微量元素、生長(zhǎng)因子等高于試驗(yàn)組[11]。從產(chǎn)酸曲線可以看出，在發(fā)酵前期，試驗(yàn)組的產(chǎn)酸速率明顯高于對(duì)照組，且整體產(chǎn)酸速率相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明發(fā)酵接種后，菌體能更好、更快地適應(yīng)組分穩(wěn)定、均一清潔培養(yǎng)基。賴氨酸的發(fā)酵過(guò)程是嚴(yán)格的生長(zhǎng)偶聯(lián)型，且生長(zhǎng)速率的下降勢(shì)必引起產(chǎn)酸速率下降，發(fā)酵前期，試驗(yàn)組的生長(zhǎng)速率與對(duì)照組相比相差無(wú)幾，但在中后期的生長(zhǎng)維持上低于對(duì)照組，所以解決試驗(yàn)組發(fā)酵中后期的菌體活力維持是主要問(wèn)題。

由表3可知，試驗(yàn)組的糖酸轉(zhuǎn)化率較對(duì)照組高3.6%；試驗(yàn)組發(fā)酵上清液透光率較對(duì)照組提高了25.6%。盡管選用清潔發(fā)酵培養(yǎng)基的產(chǎn)量不及傳統(tǒng)培養(yǎng)基，但是糖酸轉(zhuǎn)化率有一定的提高，考慮原因可能是用于菌體生長(zhǎng)的碳代謝流向產(chǎn)賴氨酸；對(duì)照組發(fā)酵培養(yǎng)基中含有較多的生物素，生物素的添加量與菌體的合成速度及厚度呈正相關(guān)。試驗(yàn)組發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素含量較低，有利于賴氨酸的外排，減小胞內(nèi)反饋抑制，促進(jìn)碳代謝流向有益于賴氨酸合成方向。試驗(yàn)組發(fā)酵上清液透光率較對(duì)照組提高了25.6%，后提取過(guò)程中，活性炭和水的用量可大大降低。

2.4 營(yíng)養(yǎng)流加對(duì)賴氨酸清潔發(fā)酵的影響

為解決使用玉米小分子肽進(jìn)行賴氨酸發(fā)酵菌體量不足、發(fā)酵后期菌體活力不足的問(wèn)題，采用營(yíng)養(yǎng)流加的策略進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化。試驗(yàn)組從發(fā)酵10 h開(kāi)始進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)流加，流加速度為100 mL/h，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，以清潔發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照組，清潔發(fā)酵培養(yǎng)基配合營(yíng)養(yǎng)流加為試驗(yàn)組。試驗(yàn)組在2.3的基礎(chǔ)上，于發(fā)酵10 h開(kāi)始流加1.2.4中的流加培養(yǎng)基，以解決發(fā)酵中后期營(yíng)養(yǎng)不足引起的菌體生長(zhǎng)停滯及活力下降問(wèn)題。在發(fā)酵0～10 h，試驗(yàn)組與對(duì)照組菌體的生長(zhǎng)速率、產(chǎn)酸水平近似相同，開(kāi)始流加后，試驗(yàn)組最高OD600 nm為129，試驗(yàn)組的最終產(chǎn)量為136 g/L，產(chǎn)量較對(duì)照組提高9.68%。菌體生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期延長(zhǎng)約4 h左右，在14 h后，菌體處于低速生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，雖產(chǎn)酸速率有所降低，但整體的產(chǎn)酸速率和產(chǎn)量相較于對(duì)照組有大幅提高。

2.5 賴氨酸清潔發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

影響谷氨酸棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸過(guò)程中，菌體的生長(zhǎng)周期及生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)賴氨酸產(chǎn)量及產(chǎn)率的影響極為重要，除了碳源、氮源外，影響發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)周期及狀態(tài)的主要因素為生物素、KH2PO4的添加量和接種量[12]。

圖5中A、B、C、D、E 5個(gè)水平分別對(duì)應(yīng)表3中1，2，3，4，5 5個(gè)水平。由圖5可知，添加適量的生物素有益于菌體生長(zhǎng)，當(dāng)生物素添加量過(guò)高時(shí)，可能導(dǎo)致細(xì)胞膜生長(zhǎng)更致密，不利于賴氨酸外排。生物素添加量為3 mg/L時(shí)，賴氨酸產(chǎn)量最優(yōu)，為127 g/L；KH2PO4能夠?yàn)榫w生長(zhǎng)提供必需的鉀離子和磷酸根，對(duì)菌體滲透壓的維持及細(xì)胞膜的合成有重要作用，當(dāng)磷酸鹽添加量為4 g/L時(shí)，賴氨酸產(chǎn)量達(dá)到126 g/L；接種量在發(fā)酵控制過(guò)程中是除溫度、pH、溶氧外最重要的控制參數(shù)之一[13-15]，合適的接種量對(duì)發(fā)酵各階段的影響較顯著，是調(diào)節(jié)發(fā)酵各階段所需時(shí)間、縮短菌體延滯期、延長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的重要策略，對(duì)緩解菌體早衰、延長(zhǎng)產(chǎn)酸期、提高糖酸轉(zhuǎn)化率有一定效果，試驗(yàn)選取5個(gè)接種量水平，接種量25%為最優(yōu)，此時(shí)賴氨酸產(chǎn)量為137 g/L。

2.6 發(fā)酵條件響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以生物素添加量（A）、KH2PO4添加量（B）、接種量（C）為自變量，以L-賴氨酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4。

以L-賴氨酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，生物素添加量（A）、KH2PO4添加量（B）、接種量（C）為自變量，建立回歸方程Y（賴氨酸）=157.40+5.63A+3.00B+2.63C－4.50AB－4.75AC+2.00BC－11.83A2－10.08B2－9.82C2。

由表5可知，此模型的P值＜0.000 1，說(shuō)明通過(guò)該回歸模型的設(shè)計(jì)所得試驗(yàn)結(jié)果均影響極顯著，失擬項(xiàng)的P值=0.541 3＞0.05，說(shuō)明該回歸曲線的擬合度良好，具有較高的可信度。回歸方程的決定系數(shù)R2為0.984 271，回歸方程的校正決定系數(shù)RAdj2為0.964 048。由P值可知，該模型的一次項(xiàng)A、B，二次項(xiàng)A2、B2、C2，交互項(xiàng)AB、AC對(duì)結(jié)果的影響極顯著；一次項(xiàng)C對(duì)結(jié)果的影響顯著；交互項(xiàng)BC對(duì)結(jié)果的影響不顯著。由F值可以確定3個(gè)因素對(duì)賴氨酸產(chǎn)量的影響大小順序?yàn)樯锼靥砑恿浚綤H2PO4添加量＞接種量。測(cè)量信噪比為20.585，信號(hào)充足，表明該模型可以應(yīng)用于試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

各因素交互作用對(duì)賴氨酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖6。

由圖6可知，賴氨酸的產(chǎn)量隨著各自變量數(shù)值的不斷增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明兩因素間存在一定交互作用，其中AB曲面彎曲程度最大，等高線更接近橢圓形，說(shuō)明AB交互作用的影響極顯著。

通過(guò)響應(yīng)面軟件對(duì)方程求解，得到最佳發(fā)酵條件為生物素添加量（A）3.20 mg/L、KH2PO4添加量（B）4.11 g/L、接種量（C）25.49%。結(jié)合分批補(bǔ)料發(fā)酵操作過(guò)程中的特殊性，接種量調(diào)整為25%。在此發(fā)酵條件下，賴氨酸的實(shí)際產(chǎn)量為160.3 g/L，與優(yōu)化所得理論值相近，說(shuō)明該方案具有可行性。

3 結(jié)論

通過(guò)不同碳源的成分對(duì)比分析，采用近似等效替代的方法得到一種效果相近的清潔發(fā)酵培養(yǎng)基，通過(guò)5 L生物反應(yīng)器發(fā)酵試驗(yàn)探究清潔發(fā)酵培養(yǎng)基的可行性，最終產(chǎn)量為124 g/L，轉(zhuǎn)化率提高至71.5%；通過(guò)營(yíng)養(yǎng)流加進(jìn)一步提高產(chǎn)量至136 g/L。

利用單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化對(duì)賴氨酸清潔發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)酸影響顯著的成分添加量進(jìn)行優(yōu)化，得到了最優(yōu)發(fā)酵條件：生物素添加量3.20 mg/L、KH2PO4添加量4.11 g/L、接種量25.49%。結(jié)合營(yíng)養(yǎng)流加工藝，賴氨酸的實(shí)際產(chǎn)量為160.3 g/L。

試驗(yàn)得到的賴氨酸的清潔發(fā)酵方法在賴氨酸發(fā)酵工業(yè)有一定的應(yīng)用前景，不僅能提高獸用賴氨酸的品質(zhì)，主要優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在后提取過(guò)程中能大量節(jié)省活性炭和水，而且能提高離子交換樹(shù)脂的使用壽命及成品的良品率，符合發(fā)酵工業(yè)的未來(lái)發(fā)展方向和“雙碳”發(fā)展理念。

參考文獻(xiàn)：

[1]XU J Z， WU Z H， GAO S J， et al. Rational modification of tricarboxylic acid cycle for improving L-lysine production in Corynebacterium glutamicum[J].Microbial Cell Factories，2018，17（1）：105.

[2]劉景陽(yáng)，余子辰，徐慶陽(yáng).NH4+雙階段發(fā)酵控制谷氨酸工藝研究[J].中國(guó)調(diào)味品，2022，47（9）：7-14.

[3]Alpha-hydroxy-gamma-methylmercaptobutyric-acid/alpha-ketoisocaproic-acid/alpha-ketoisovalerate/calcium/histidine/lysine-hydrochloride/nitrogen/phenylpyruvic-acid/threonine/tryptophan/tyrosine[J].Reactions Weekly，2022，1922（1）：22319-22327.

[4]NAGY A， MAGYAR T， JUHSZ C， et al. Phytoremediation of acid mine drainage using by-product of lysine fermentation[J].Water Science and Technology，2020，81（7）：1507-1517.

[5]SUVACHAN A， LAL R， NAMPOOTHIRI K M， et al. Valorization of paper industry rejects by combined thermo-chemical pretreatment and biological conversion to L-lysine[J].Environmental Technology & Innovation，2021，24：101882.

[6]熊海波，陳志超，曹華杰，等.全營(yíng)養(yǎng)流加對(duì)谷氨酸棒桿菌發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2021，47（6）：11-17.

[7]李萬(wàn)軍.優(yōu)化L-賴氨酸發(fā)酵工藝提高糖酸轉(zhuǎn)化率[D].銀川：寧夏大學(xué)，2021.

[8]曹衛(wèi)，徐陽(yáng)鑫，賀婷，等.發(fā)酵食品中羧甲基賴氨酸的研究進(jìn)展[J].中國(guó)調(diào)味品，2019，44（1）：164-168.

[9]于玲紅，李巖，敬雙怡，等.特異性移動(dòng)床生物膜反應(yīng)器處理賴氨酸發(fā)酵廢水[J].環(huán)境污染與防治，2018，40（7）：770-773.

[10]洪銘，李巖，張?zhí)K龍，等.利用甜菜堿提升賴氨酸發(fā)酵及其代謝通量分析[J].發(fā)酵科技通訊，2019，48（3）：125-131.

[11]KENTO T， YOSHIKI S， TAKAHIRO T， et al. Data science-based modeling of the lysine fermentation process[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2020，130（4）：409-415.

[12]張東.等離子體誘變選育L-賴氨酸產(chǎn)生菌及發(fā)酵優(yōu)化研究[D].鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

[13]楊帆，王琳琳，時(shí)德通，等.響應(yīng)面法優(yōu)化賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)條件的研究[J].食品工業(yè)，2019，40（2）：200-203.

[14]BASHIR S， BASHIR R， PERVAIZ M， et al. RSM-based optimization of fermentation conditions and kinetic studies of glutamic acid and lysine production by Corynebacterium glutamicum[J].Journal of Nanomaterials，2022，2022：1-6.

[15]XU Y Q， ZHOU D， LUO R S， et al.Metabolic engineering of Escherichia coli for polyamides monomer δ-valerolactam production from feedstock lysine[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2020，104：10939-10946.