趙悅 丁婷婷 張夢麗 馮怡華 王春玲

摘要：該研究采用低鹽固態(tài)醬油發(fā)酵工藝，采用單一菌株（米曲霉3.042）進行制曲，在制曲過程中添加核酸酶來實現(xiàn)酶法輔助發(fā)酵。采用單因素實驗確定核酸酶的最佳添加量和添加時間。通過測定醬醅的總酸、氨基酸態(tài)氮等理化指標(biāo)以及成品醬油中的風(fēng)味成分，最后進行成品醬油的感官評定，探討外源核酸酶在醬油釀造中的作用。結(jié)果表明，核酸酶的最佳添加量為大曲質(zhì)量的0.3%。同時核酸酶的添加提高了大曲的酶活，保證了原料中大分子物質(zhì)的分解和有效利用，從而具有提高醬油原料利用率和改善醬油風(fēng)味的效果。

關(guān)鍵詞：低鹽固態(tài)醬油；核酸酶；酶活；理化特性；風(fēng)味；感官評定

中圖分類號：TS264.21????? 文獻標(biāo)志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2023）08-0006-06

Application of Nuclease in Soy Sauce Brewing

ZHAO Yue， DING Ting-ting， ZHANG Meng-li， FENG Yi-hua， WANG Chun-ling*

（College of Food Science and Engineering， Tianjin University of Science and

Technology， Tianjin 300457， China）

Abstract： In this study， low-salt solid-state soy sauce fermentation process is used， a single strain （Aspergillus oryzae 3.042） is used for koji making， and nuclease is added during the koji making process to achieve enzymatic-assisted fermentation. Single factor experiment is used to determine the optimal addition amount and time of nuclease. The total acid， amino acid nitrogen and other physical and chemical indexes of soy sauce mash as well as the flavor components in the finished soy sauce product are measured， and the sensory evaluation of the finished soy sauce product is carried out， in order to discuss the effect of exogenous nuclease in soy sauce brewing. The results show that the optimal addition amount of nuclease is 0.3% of the mass of Daqu. At the same time， the addition of nuclease improves the enzyme activity of Daqu， ensures the decomposition and effective utilization of macromolecular substances in raw materials， so as to improve the utilization rate of soy sauce raw materials and improve the flavor of soy sauce.

Key words： low-salt solid-state soy sauce; nuclease; enzyme activity; physical and chemical properties; flavor; sensory evaluation

收稿日期：2023-02-20

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2018YFC1604102）;企業(yè)合作課題（FXZL-CYZX-2022-006）

作者簡介：趙悅（1998－），女，碩士，研究方向：生物與醫(yī)藥。

通信作者：王春玲（1977－），女，教授，博士，研究方向：食品營養(yǎng)與安全。

醬油是由大豆（或脫脂大豆）等富含蛋白質(zhì)的原料和面粉（或麥麩）等富含淀粉的原料經(jīng)高溫蒸煮，在曲霉分泌的多種酶系的作用下，經(jīng)過細菌、酵母菌等微生物的長時間發(fā)酵而制成的一種調(diào)味品[1]。低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油是以豆粕和麩皮為原料，經(jīng)過浸泡蒸煮、制備大曲、添加鹽水等步驟制作而成的醬油，其工藝特點是設(shè)備簡單、生產(chǎn)時間短、生產(chǎn)成本較低，大多數(shù)醬油生產(chǎn)企業(yè)將低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝作為傳統(tǒng)特色加以保留，但此類工藝缺點比較明顯，如產(chǎn)品香氣不足[2]，釀造出來的產(chǎn)品品質(zhì)欠佳等。

為了彌補不足，通過添加外源酶制劑達到補充成曲酶系的目的，使后期發(fā)酵原料的利用更徹底，提高出油率和醬油質(zhì)量[3]。本研究通過在大曲制作過程中添加核酸酶來考察其對醬醅理化指標(biāo)和醬油成品指標(biāo)的影響，以探討核酸酶的添加對成品醬油風(fēng)味和感官的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

原料：豆粕、麩皮；菌種：米曲霉滬釀3.042。

1.2 試劑

PDA培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；硼酸、甲醛（均為分析純）：博歐特（天津）化工貿(mào)易有限公司；硫酸、鹽酸（均為分析純）：天津市化學(xué)試劑一廠。

1.3 主要儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；pH計 德國賽多利斯公司；酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司；自動凱氏定氮儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 發(fā)酵工藝

采用低鹽固態(tài)發(fā)酵方法生產(chǎn)醬油，以大曲∶鹽水為1∶1的比例配制12%的鹽水，將其混勻后放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。發(fā)酵條件：在43 ℃的恒溫條件下連續(xù)發(fā)酵10 d，然后將培養(yǎng)箱溫度降至33 ℃再發(fā)酵18 d，總周期為28 d[4]。

1.4.2 酶活的測定

核酸酶活力根據(jù)GB/T 34222－2017的方法進行測定。

1.4.3 理化指標(biāo)的測定

取5 g醬醅，將其充分研磨，用蒸餾水定容至50 mL，然后在3 900 r/min的條件下用離心機離心10 min，之后取出上清液用于后續(xù)理化指標(biāo)的測定。pH值的測定：使用pH計；總酸、氨基酸態(tài)氮、全氮含量的測定：分別參照GB/T 12456－2008、GB 5009.235－2016、GB/T 18186－2000；還原糖含量的測定：使用DNS法。

1.4.4 成品指標(biāo)的測定

1.4.4.1 氨基酸態(tài)氮生成率的計算

氨基酸態(tài)氮生成率（%）=ANTN×100%。

式中：AN表示氨基酸態(tài)氮含量，g/dL；TN表示全氮含量，g/dL。

1.4.4.2 蛋白質(zhì)利用率的計算

蛋白質(zhì)利用率（%）=（m1×TN1d1+m2×TN2d2）×6.25m'×100%。

式中：m1、m2表示醬油頭油、二油的產(chǎn)量，kg；TN1、TN2表示醬油頭油、二油的全氮含量，g/dL；d1、d2表示醬油頭油、二油的相對密度；m'表示混合原料蛋白質(zhì)總量，kg；6.25表示全氮折算蛋白質(zhì)的系數(shù)[5]。

1.4.5 風(fēng)味物質(zhì)的測定

利用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用（SPME-GC-MS）技術(shù)探究醬油中的風(fēng)味物質(zhì)。

1.4.6 感官評定方法

將頭油和二油按1∶1進行配兌，沉降數(shù)天后，于65 ℃巴氏殺菌30 min。采用七點線性標(biāo)度來反映醬油感官特征（顏色、氣味、味道、體態(tài)）的強度。表1中，1～7代表醬油的感官特征強度逐步提高[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸酶添加時間點的確定

采用低鹽固態(tài)方法發(fā)酵，總發(fā)酵時長為28 d，并分別于第0，7，14，21，28天取樣。選取大曲制作過程中的0，12，24，36 h為添加時間點，探究核酸酶的最佳添加時間。

2.1.1 pH值的測定

隨著發(fā)酵的進行，微生物將蛋白質(zhì)分解為氨基酸，由于有機酸的生成，醬醅中的酸類物質(zhì)不斷累積，使其pH值發(fā)生改變。發(fā)酵過程中pH值的變化見圖1。

由圖1可知，空白組與實驗組的pH值都隨著時間的增加而降低，前7 d下降迅速，發(fā)酵后期下降緩慢，終端pH在5.0左右。

2.1.2 總酸含量的測定

酸類物質(zhì)對醬油的風(fēng)味有一定的貢獻。發(fā)酵期間總酸含量的變化見圖2。

由圖2可知，發(fā)酵前7 d，總酸含量快速增長，而發(fā)酵7 d后，總酸含量增長速度明顯降低。發(fā)酵結(jié)束時，24 h添加核酸酶組的總酸含量高于其他組，為1.79 g/dL；而空白組的總酸含量低于其他組，為1.67 g/dL。

2.1.3 氨基酸態(tài)氮含量的測定

氨基酸態(tài)氮是影響醬油品質(zhì)的一個關(guān)鍵因素。醬油品質(zhì)的優(yōu)劣往往依據(jù)氨基酸態(tài)氮的水平來判定。發(fā)酵期間氨基酸態(tài)氮含量的總體變化情況見圖3。

在整個發(fā)酵周期內(nèi)，氨基酸態(tài)氮含量隨著時間的增加而增加。由圖3可知，將實驗組與空白組相比較，氨基酸態(tài)氮含量最高的一組是0 h添加核酸酶組，為0.922 g/dL，較氨基酸態(tài)氮含量為0.857 g/dL的空白組提高了7.6%。

2.1.4 全氮含量的測定

全氮是衡量醬油品質(zhì)的另一個關(guān)鍵因素。全氮含量越高，意味著醬油中所含的蛋白質(zhì)、氨基酸、肽等物質(zhì)的含量越高。發(fā)酵期間全氮含量的變化情況見圖4。

由圖4可知，在發(fā)酵0～7 d內(nèi)，全氮含量以較快的速度不斷增長，之后增長速度逐漸放緩，但在21 d后又出現(xiàn)小幅上升趨勢。其中0 h添加核酸酶組的全氮含量在發(fā)酵過程中普遍高于其他組，在發(fā)酵終端28 d時，全氮含量為1.824 g/dL，所以確定大曲制作過程中的0 h為核酸酶的最佳添加時間。

2.2 添加核酸酶制曲對酶活力的影響

酶活力的高低關(guān)乎原料的分解利用程度。酶活力過低，原料分解利用不充分，影響原料的利用率和醬油的風(fēng)味。因此，適當(dāng)提高酶活力有助于改善醬油的質(zhì)量?；诖笄泻怂崦傅谋镜酌富?、外源核酸酶的酶活以及核酸酶的溶解性考慮[7]，最終將核酸酶的添加量定為0.05%、0.3%和0.5%。在大曲制作過程中的24，36，42，48 h分別取樣，測定空白組與分別添加大曲質(zhì)量0.05%、0.3%和0.5%核酸酶實驗組的酶活力變化情況，見圖5。

由圖5可知，對于核酸酶而言，空白組與實驗組均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在42 h達到最高。其中空白組酶活力最高值為656 U/mg；0.05%實驗組酶活力最高值為711 U/mg，較空白組提高了8%；0.3%實驗組酶活力最高值為788 U/mg，較空白組提高了20%；0.5%實驗組酶活力最高值為845 U/mg，較空白組提高了29%。

2.3 添加核酸酶制曲對理化指標(biāo)的影響

核酸酶不僅可使RNA水解，而且能夠?qū)NA中所含有的磷酸二酯鍵水解，從而獲得5'-核苷酸。鮮味的增強往往與呈味核苷酸含量的提高密切相關(guān)[8]。以核酸酶為研究對象，添加量分別為大曲原料質(zhì)量的0.05%、0.3%和0.5%，探究不同組別之間的理化差異。

2.3.1 pH值的測定

由圖6可知，空白組與實驗組的pH值都隨著時間的增加而降低，前7 d下降迅速，發(fā)酵后期下降緩慢，終端pH在5.20左右。

2.3.2 總酸含量的測定

由圖7可知，總酸呈現(xiàn)先快速上升后緩慢上升的趨勢，發(fā)酵過程中，添加0.05%核酸酶組的總酸含量較其他組高，在發(fā)酵終端其總酸含量為1.759 g/dL，較總酸含量為1.69 g/dL的空白組提升了4%。

2.3.3 氨基酸態(tài)氮含量的測定

由圖8可知，發(fā)酵過程中，氨基酸態(tài)氮含量隨著時間的增加先急速增加后緩慢增加。在28 d時，添加0.3%核酸酶組的氨基酸態(tài)氮含量最高，為0.830 3 g/dL，較氨基酸態(tài)氮含量為0.787 2 g/dL的空白組提升了5%。由此可見，添加核酸酶能夠在一定程度上提高氨基酸態(tài)氮含量。

2.3.4 全氮含量的測定

由圖9可知，全氮含量隨著時間的延長而增加。發(fā)酵前7 d，全氮含量上升較快，后期增加緩慢。發(fā)酵終端空白組與實驗組并無明顯差異。

2.3.5 還原糖含量的測定

由圖10可知，發(fā)酵前14 d，還原糖含量隨著時間的增加而增加；14 d后，還原糖含量有所下降。發(fā)酵過程中，實驗組的還原糖含量均較空白組有所提升，其中添加0.5%核酸酶組的還原糖含量較高于其他組，在14 d時含量最高，為2.895 g/dL，高于空白組16%。而添加0.05%核酸酶組的還原糖含量較空白組提升了8%；添加0.3%核酸酶組的還原糖含量較空白組提升了12%。

2.4 添加核酸酶制曲對成品指標(biāo)的影響

2.4.1 氨氮轉(zhuǎn)化率的計算

氨氮轉(zhuǎn)化率為氨基酸態(tài)氮含量與全氮含量的比值。氨氮轉(zhuǎn)化率越高，意味著原料中的蛋白質(zhì)水解越充分，所生成的氨基酸態(tài)氮含量越高。4組成品醬油的氨氮轉(zhuǎn)化率見圖11。

由圖11可知，對于氨氮轉(zhuǎn)化率而言，添加0.3%核酸酶組的氨氮轉(zhuǎn)化率最高，達到65%，較空白組提高了10%。由此可見，添加適量的核酸酶可以顯著促進原料分解，保證原料中大分子物質(zhì)的有效利用。

2.4.2 蛋白質(zhì)利用率的計算

蛋白質(zhì)利用率是衡量成品醬油中蛋白質(zhì)被分解利用生成其他物質(zhì)多少的一個重要參數(shù)。蛋白質(zhì)利用率高，意味著原料在酶的作用下被充分分解利用。對于企業(yè)而言，成品醬油的蛋白質(zhì)利用率越高，往往代表著公司的經(jīng)濟效益越好。4組成品醬油的蛋白質(zhì)利用率見圖12。

由圖12可知，4組醬油的蛋白質(zhì)利用率分別為79.08%、85.97%、88.03%、83.64%。4組醬油中蛋白質(zhì)利用率最高的為添加0.3%核酸酶的實驗組，較空白組提高了8.95%。由此可見，核酸酶的添加對于醬油蛋白質(zhì)利用率的提高有促進作用，這表示添加核酸酶有助于充分發(fā)揮酶系作用，促進原料在微生物的作用下被進一步分解利用。以上述分析為基礎(chǔ)，確定核酸酶的最佳添加量為0.3%。

2.5 添加核酸酶制曲對醬油風(fēng)味的影響

固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用儀分析表明，空白組共有59種風(fēng)味物質(zhì)，包括10種醇類、16種醛類、5種酸類、5種酯類、11種酮類、2種酚類、6種吡嗪類、3種烴類、1種其他類物質(zhì)。而添加0.3%核酸酶組共發(fā)現(xiàn)57種風(fēng)味物質(zhì)，包括12種醇類、15種醛類、5種酸類、4種酯類、9種酮類、2種酚類、7種吡嗪類、2種烴類、1種其他類物質(zhì)。

由圖13可知，添加0.3%核酸酶組風(fēng)味物質(zhì)的相對含量較空白組而言，醇類、醛類、酸類、酚類物質(zhì)的相對含量均有較大提升，同時酯類、酮類、吡嗪類等物質(zhì)的相對含量與空白組相差不大。由此可見，添加核酸酶制曲后，雖然風(fēng)味物質(zhì)數(shù)目與空白組相差不大，但是大部分風(fēng)味物質(zhì)的相對含量較空白組有了顯著增加。

由圖14中a可知，空白組主要分布在二、三象限，添加0.3%核酸酶組主要分布在一、四象限，兩類樣本得到了很好的分離。為了更清楚地找到引起差異的典型風(fēng)味物質(zhì)，采用S-plots分析，共找到了12種符合條件的差異性物質(zhì)。對差異性風(fēng)味物質(zhì)進行聚類分析，其中包含4種醇類物質(zhì)，分別為苯乙醇、1-辛烯-3-醇、異戊醇、2-甲基丁醇；4種醛類物質(zhì)，分別為2-甲基丁醛、異戊醛、苯乙醛、反-2-辛烯醛；3種酸類物質(zhì)，分別為醋酸、2-甲基丁酸、異戊酸；酚類物質(zhì)為愈創(chuàng)木酚。其中，添加0.3%核酸酶組中相對含量較高的苯乙醇是對醬油風(fēng)味有重要作用的醇類化合物，它能賦予醬油花香[9]；具有蘑菇香的1-辛烯-3-醇是醬油中較重要的風(fēng)味物質(zhì)[10]；2-甲基丁酸源于氨基酸的降解，具有奶酪香，是醬油中主要的香氣活性物質(zhì)[11]；異戊醛可以為醬油帶來少許的水果香[12]；愈創(chuàng)木酚可以賦予醬油獨特的煙熏味，從而達到減少其咸味的作用[13]。由此可見，添加適量的核酸酶有助于增加醬油中的花香、水果香等香氣成分。這是由于核酸酶可以水解核酸中的磷酸二酯鍵，從而生成5'-核苷酸，而5'-GMP和5'-AMP作為相應(yīng)的產(chǎn)物，具有明顯改善風(fēng)味特性的作用[14]。

2.6 添加核酸酶制曲對醬油感官的影響

由表2可知，添加0.3%核酸酶組的總分最高，在麥芽香、醬香、鮮味等方面較空白組有較大提升，這與核酸酶添加后醬油風(fēng)味的改善密切相關(guān)[15]。

上述結(jié)果在圖15中也有所體現(xiàn)。這與分析的理化結(jié)果相一致，因此確定核酸酶的最佳添加量為0.3%。

3 結(jié)論

本文研究了在低鹽固態(tài)發(fā)酵工藝下，在大曲制備時不同添加量的核酸酶對大曲酶活、醬醅理化指標(biāo)及醬油成品指標(biāo)的影響，最終確定核酸酶的最佳添加量為大曲質(zhì)量的0.3%。添加0.3%核酸酶組較空白組而言，氨基酸態(tài)氮含量和還原糖含量均有所提升，氨氮轉(zhuǎn)化率提高了10%，蛋白質(zhì)利用率提高了8.95%，同時醇類、醛類、酚類等風(fēng)味物質(zhì)的相對含量有所提高，在感官上麥芽香和醬香等方面得分略高。因此，在醬油釀造過程中添加核酸酶具有一定的推廣應(yīng)用價值。

參考文獻：

[1]郭琳.不同醬油發(fā)酵工藝的比較研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2017.

[2]田子薇.固稀發(fā)酵法醬油釀造工藝的優(yōu)化研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2019.

[3]蔡坤華，戎文文，蔣永杰，等.釀造醬油專用酶制劑在醬油生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國調(diào)味品，2002（3）：10-12，37.

[4]牛亞冰.三株米曲霉菌種發(fā)酵性能的比較[D].天津：天津科技大學(xué)，2018.

[5]徐歡歡.α-淀粉酶在醬油制曲與發(fā)酵工藝中的應(yīng)用研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2012.

[6]魏永義，周偉，郭明月，等.醬油分級感官評價研究[J].中國調(diào)味品，2014，39（6）：36-37，42.

[7]LIU M P， HOU P， WANG X Y， et al. Characterization of one new non-S-RNase of Armeniaca cathayana[J].Czech Journal of Genetics and Plant Breeding，2019，55（1）：39-41.

[8]田淑芳.核酸酶P1的分離純化及作為工具酶的研究[D].武漢：武漢科技大學(xué)，2020.

[9]張怡潔.醬油的風(fēng)味及其生理活性的研究[D].杭州：浙江工商大學(xué)，2012.

[10]HUSSON F， BOMPAS D， KERMASHA S， et al. Biogeneration of 1-octen-3-ol by lipoxygenase and hydroperoxide lyase activities of Agaricus bisporus[J].Process Biochemistry，2001，37（2）：177-182.

[11]KANEKO S， KUMAZAWA K， NISHIMURA O. Comparison of key aroma compounds in five different types of Japanese soy sauces by aroma extract dilution analysis （AEDA）[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2012，60（15）：3831-3836.

[12]高國歡.零添加醬油的研究與開發(fā)[D].天津：天津科技大學(xué)，2020.

[13]劉蕊.新型低鹽固態(tài)醬油發(fā)酵工藝的研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2020.

[14]李明，余華順，喻晨，等.桔青霉產(chǎn)核酸酶P1酶分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)[J].食品工業(yè)科技，2021，42（7）：89-94.

[15]FENG J， ZHAN X B， ZHENG Z Y， et al. New model for flavour quality evaluation of soy sauce[J].Czech Journal of Food Sciences，2013，31（3）：292-305.