匡云琪，蔡金鳳，姚穎杰，寸金濤，肖彭瑩 綜述 張若鵬，，3 審校

1.大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671000；2.昆明市婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心，云南 昆明 650118；3.大理大學(xué)昆明市婦幼保健院研究生培養(yǎng)基地，云南 昆明 650118

近年來，體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)技術(shù)的發(fā)展速度突飛猛進，成功率在臨床實踐中也是逐步攀升，但是由于患者個體差異等諸多因素的影響，仍有少部分人在多次植入胚胎后存在失敗的現(xiàn)象，稱為反復(fù)種植失敗(RIF)，其在輔助生殖受孕中發(fā)生率約為10%[1]。RIF不僅是導(dǎo)致非自然受孕女性低妊娠率的主要原因，也是輔助生殖領(lǐng)域存在的難題和研究熱點。有關(guān)RIF目前相對統(tǒng)一的定義是Coughlan 等[2]2014 年提出的：年齡在40 歲以下的婦女，經(jīng)歷至少3 次體外受精周期，移植至少4 枚優(yōu)質(zhì)胚胎(新鮮或冷凍胚胎)后仍未實現(xiàn)臨床妊娠。妊娠成功是多因素協(xié)調(diào)作用的結(jié)果，其不僅取決于優(yōu)秀的胚胎質(zhì)量，也依賴于順利的胚胎著床過程以及良好的子宮內(nèi)膜容受性。內(nèi)膜容受性是指在月經(jīng)周期的第20~24 天這一窗口期，子宮內(nèi)膜在雌孕激素作用下?lián)碛性试S胚胎黏附、侵入并誘導(dǎo)內(nèi)膜間質(zhì)發(fā)生一系列變化，從而使胚胎得以順利著床的能力[3]。因此，任何導(dǎo)致胚胎質(zhì)量異常、著床過程受阻、子宮內(nèi)膜容受性降低以及胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步的因素都會促使RIF 的發(fā)生。近年來，隨著對轉(zhuǎn)錄因子NKX2-1 的深入了解，發(fā)現(xiàn)它在涉及胚胎成功著床的各個方面都發(fā)揮了調(diào)控作用，其在生殖過程中的重要性日益凸顯。本文就NKX2-1在胚胎種植過程中的相關(guān)作用機制予以綜述。

1 NKX2-1簡介

1.1 NKX2-1 的基因結(jié)構(gòu) NKX2-1 是NKX2轉(zhuǎn)錄基因家族成員之一，由NKX2.1基因所編碼，位于人類染色體14q13上，是一種同源結(jié)構(gòu)域蛋白。1990年，Guazzi等[4]從小牛的甲狀腺組織中提取并克隆出該基因的cDNA，發(fā)現(xiàn)其能夠與人類甲狀腺過氧化物酶基因中的增強子結(jié)合，也稱為甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1 (thyroid transcription factor-1，TTF-1)或甲狀腺特異性增強結(jié)合蛋白(thyroid specific enhancer-binding protein，T-EBP)。NKX2-1 蛋白是一種相對分子量為38 kb 的序列高度保守的核蛋白，由371個氨基酸編碼組成，編碼區(qū)包括三個外顯子和兩個內(nèi)含子，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長度約為2.3 kb[5-6]。NKX2-1的三級結(jié)構(gòu)包括1個DNA結(jié)合域和2 個轉(zhuǎn)錄活性域。DNA 結(jié)合域是由60 個氨基酸殘基組成的螺旋結(jié)構(gòu)，可識別并結(jié)合活化T細胞核因子(NFAT)、視黃酸受體(RAR)、鋅指GATA轉(zhuǎn)錄因子6(GATA6)等轉(zhuǎn)錄因子中的5'-CAAG-3'核心序列。兩個活性域分別為位于N 端第51~123 個氨基酸殘基之間具有親水性的酸性激活結(jié)構(gòu)域以及位于C 端第295~372 個氨基酸殘基之間起抑制作用的反式激活結(jié)構(gòu)域，可轉(zhuǎn)錄激活環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CBP)、類固醇受體共激活因子-1(SRC-1)、核因子-κB(NF-κB)、STAT3、SMAD3 等[7-9]。此外，NKX2-1 啟動子的活性是由FOXA、Sp1、Sp3、GATA26及HOXB3轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)節(jié)完成的。最近有研究發(fā)現(xiàn)，諸如LMO3、E2F3、cyclinB1、cyclinB2、MUC5A、FGFR1 和MET 等許多潛在靶點也對NKX2-1 的轉(zhuǎn)錄活性起抑制或誘導(dǎo)作用[10]，進一步提示NKX2-1 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性。

1.2 NKX2-1在不同組織中的表達 NKX2-1在胚胎發(fā)育和分化過程中特異性表達于甲狀腺、肺和大腦的部分區(qū)域，對這些組織的早期發(fā)育十分關(guān)鍵，其表達受到嚴格的調(diào)控。出生后NKX2-1表達于下丘腦神經(jīng)元的部分亞群，包括促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)神經(jīng)元和下丘腦腹外側(cè)核的前腦啡肽能神經(jīng)元，參與對性成熟和生殖內(nèi)分泌的調(diào)控[11]。青春期開始前下丘腦中NKX2-1 mRNA表達水平會短暫升高，在性成熟開始時達到高峰，之后表達降低，提示青春期的啟動機制可能與NKX2-1 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)。后有研究證實，親吻素(Kiss1)基因可能是NKX2-1 的潛在靶點，NKX2-1 通過直接調(diào)節(jié)Kiss1 的表達來促進下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonadal，HPG)軸中GnRH的釋放[12-13]，從而促進青春期的啟動。研究也發(fā)現(xiàn)，NKX2-1表達缺失的小鼠會表現(xiàn)出青春期發(fā)育延遲及生殖能力下降，也與上述理論相符。研究還指出，NKX2-1還可表達于成熟的甲狀腺組織和肺終末呼吸單位中，在參與其組織分化、功能維持及編碼組織蛋白表達等方面發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。文獻報道稱，NKX2-1在女性生殖系統(tǒng)及其病變中也有不同程度的表達。張越等[14]發(fā)現(xiàn)NKX2-1在正常子宮內(nèi)膜中的表達顯著高于子宮內(nèi)膜病變者，提示其表達可能與內(nèi)膜組織的功能維持及病變過程有關(guān)。Fujiwara 等[15]發(fā)現(xiàn)NKX2-1 在卵巢癌早期和晚期的表達率不同，其在卵巢癌中的表達是一個獨立的良好預(yù)后因素。此外，NKX2-1的表達也受到磷酸化、糖基化、乙?；榷喾N共價修飾調(diào)節(jié)及氧化-還原調(diào)控等。

2 NKX2-1與生殖調(diào)控因子

成功妊娠需要子宮內(nèi)膜轉(zhuǎn)變?yōu)榻邮軕B(tài)并擁有允許囊胚定位、黏附和侵入的能力，這一過程的改變涉及到多種細胞因子和黏附分子的調(diào)控，而NKX2-1 可通過作用于這些生殖調(diào)控因子從而影響胚胎著床過程?，F(xiàn)就NKX2-1與一些生殖調(diào)控因子之間的關(guān)系展開綜述，探究其對胚胎植入過程的雙重影響。

2.1 NKX2-1 與上皮型鈣黏附蛋白 上皮型鈣黏附蛋白(E-Cadherin，E-cad)是一種分子量為120~130 kDa的Ca2+依賴的同親型結(jié)合單鏈跨膜糖蛋白，主要在上皮組織中表達，介導(dǎo)上皮組織形態(tài)、功能的維持以及同種細胞之間的黏附，是鈣黏附蛋白家族中研究最為透徹的成員之一。眾所周知，胚胎在著床過程會涉及到子宮上皮細胞外基質(zhì)的廣泛降解、重塑以及滋養(yǎng)層細胞和上皮細胞表型的改變。研究發(fā)現(xiàn)，E-cad可以通過降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、MMP-9 的表達和活性，進而影響著床過程中細胞外基質(zhì)的重塑，以發(fā)揮對胚胎著床的調(diào)控作用[16]，同時E-cad在誘導(dǎo)胚胎的侵襲性和上皮表型的建立中也扮演了非常重要的角色。此外，E-cad在月經(jīng)周期的不同時段表達水平不同。研究顯示，胚胎植入前期也就是分泌中期E-cad高表達于滋養(yǎng)細胞和子宮上皮細胞表面，有利于胚泡的黏附和植入，而在植入后期滋養(yǎng)外胚層表面E-cad 表達降低，導(dǎo)致細胞遷移和浸潤能力增強，有利于絨毛外滋養(yǎng)細胞對子宮肌層的適度浸潤侵襲。Nelson 等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，E-cad 還可通過調(diào)節(jié)β-catenin 的活性間接影響wnt 信號通路，參與著床過程中的胚胎黏附。子宮內(nèi)膜異位癥患者上皮細胞中E-cad 的表達無顯著的周期性變化，可能也是導(dǎo)致不孕的原因之一[18]。研究發(fā)現(xiàn)，NKX2-1作為E-cad的上游調(diào)控因子，其可以通過促進E-Cad的表達來介導(dǎo)胚胎著床過程。

2.2 NKX2-1 與降鈣素 降鈣素(calcitonin，CT)是一種由甲狀腺濾泡旁細胞合成和分泌的多肽類激素,主要生理功能是抑制骨鹽吸收及促進腎臟對Ca2+的排泄，調(diào)節(jié)體內(nèi)血Ca2+水平。研究發(fā)現(xiàn)，降鈣素在子宮內(nèi)膜上皮細胞中也有微量表達，是胚胎著床過程中重要的調(diào)節(jié)因子之一。著床前孕激素會誘導(dǎo)降鈣素的表達，在著床窗口期降鈣素的表達特異性增強，其表達時間與子宮接受窗口重合，提示降鈣素可能是子宮接受胚胎著床的標志。據(jù)報道降鈣素還可以促進滋養(yǎng)層細胞的生長，在著床前階段抑制降鈣素mRNA會使胚胎數(shù)量大大減少。眾所周知，肝素結(jié)合表皮生長因子(heparin-binding epidermal growth factor，HB-EGF)和白細胞抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)的表達對于囊胚附著和侵襲過程來說是必不可少的。最新發(fā)現(xiàn)稱心臟和神經(jīng)嵴衍生物蛋白2(HAND2)對子宮的接受性、蛻膜化改變以及胚胎植入也有積極促進作用。降鈣素不僅通過刺激包括腺苷酸環(huán)化酶和磷脂酶C (AC/PLC)在內(nèi)的多條Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進囊胚的植入和上調(diào)HB-EGF 的表達[19]，還可以通過ERK1/2-mTOR 信號通路過表達HAND2和LIF，下調(diào)miR-223-3p 水平，從而增強子宮內(nèi)膜的容受性[20]。研究發(fā)現(xiàn)，降鈣素還可以促進子宮上皮細胞外Ca2+內(nèi)流，通過升高細胞內(nèi)Ca2+濃度以促進內(nèi)膜蛻膜化改變和胚泡的生長發(fā)育，同時降低宮腔內(nèi)Ca2+水平，使子宮內(nèi)膜維持靜息狀態(tài)，有利于胚胎的成功著床。此外，降鈣素的上調(diào)也會導(dǎo)致E-cad mRNA 水平降低，使子宮上皮細胞重塑,更易于滋養(yǎng)層細胞的侵入與穿透。王偉等[21]還發(fā)現(xiàn)降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-relatedpeptide，CGRP)在蛻膜細胞中表達，通過活化有絲分裂原活化蛋白激酶P38 (P38 mitogen-activatedprotein kinase，P38MAPK) 促進囊胚形成和誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細胞分化。這些研究結(jié)果都表明CT及CGRP 在胚胎著床過程發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。Suzuki 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，NKX2-1 可以與甲狀腺濾泡旁細胞中鈣敏感受體(Ca2+-sensing receptor，CaSR)、鈣調(diào)素和降鈣素基因的5'側(cè)區(qū)域特定結(jié)構(gòu)結(jié)合，調(diào)控CaSR基因、CT 基因以及CT/CGRP 基因的表達。據(jù)此推測，NKX2-1 也可通過作用于子宮細胞中表達的CT 及CGRP，進而發(fā)揮在生殖活動中的有利調(diào)控作用。

2.3 NKX2-1 與胞間緊密連接蛋白 子宮內(nèi)膜上皮細胞達到容受狀態(tài)需要經(jīng)歷特殊的結(jié)構(gòu)與功能改變，這一過程涉及到緊密連接蛋白的變化。緊密連接(tight junction，TJ)是位于子宮內(nèi)膜上皮細胞最頂端的連接復(fù)合體，具有屏障和柵欄特性，不僅負責(zé)調(diào)控細胞旁物質(zhì)的跨膜運輸及維持細胞極性狀態(tài)，還與妊娠期內(nèi)膜容受性的形成有關(guān)。Occludin、Claudin-1 都屬于緊密連接蛋白成員。Occludin的表達水平下調(diào)使子宮上皮細胞極性下降，細胞黏附分子在膜上的分布被改變，減少胚泡著床的機械屏障，促進胚泡的黏附與子宮內(nèi)膜容受性的建立[23]。植入過程中，Occludin、Claudin-1 等緊密連接蛋白還與上皮型鈣黏附蛋白等一起構(gòu)成復(fù)雜的纖維網(wǎng)絡(luò)復(fù)合體，介導(dǎo)胚胎定位黏附以及滋養(yǎng)層細胞對子宮的侵入。研究發(fā)現(xiàn)，NKX2-1通過直接作用于Occludin 和Claudin-1 的啟動子并對其進行轉(zhuǎn)錄激活，進而間接調(diào)控胚胎種植過程[24-25]。

2.4 NKX2-1 與叉頭框蛋白O1 叉頭框蛋白O1(forkhead box-O1，F(xiàn)OXO1)是FOXO轉(zhuǎn)錄家族中的一員，其可作為阻遏劑或激活劑在細胞增殖、分化和凋亡等多種細胞過程發(fā)揮重要作用。Vasquez 等[26]實驗發(fā)現(xiàn)在Cre 小鼠模型中子宮內(nèi)膜Foxo1 的消融，會導(dǎo)致參與細胞侵襲、凋亡、分子轉(zhuǎn)運和β-連環(huán)蛋白信號通路激活的子宮轉(zhuǎn)錄本基因表達發(fā)生改變，促使子宮上皮細胞極性改變和凋亡，不利于胚胎穿透管腔上皮，進而導(dǎo)致不孕。由此證明Foxo1 可能是體內(nèi)調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性的關(guān)鍵因子。Zhong 等[27]研究發(fā)現(xiàn)Foxo1通過直接結(jié)合NKX2-1基因，在介導(dǎo)肺泡上皮細胞分化及維持細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮了核心作用。故此可以推測，NKX2-1也能通過作用于靶點Foxo1來影響子宮上皮細胞的極性，使子宮轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合胚胎植入的可接受狀態(tài)，但具體作用機制還需有待進一步探究。

2.5 NKX2-1 與瘦素 瘦素是由脂肪組織分泌的一種分子量為16 kDa的多肽類激素，主要通過與靶細胞膜上的瘦素受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜上也存在瘦素及其受體的表達，并且通過多種途徑對生殖功能發(fā)揮著調(diào)控作用。最近一些研究顯示，瘦素可以上調(diào)LIF、整合素αvβ3 以及白介素-1(interleukin-1，IL-1)等細胞因子的表達水平，在子宮內(nèi)膜容受性的建立中發(fā)揮有利作用。更有研究表明，瘦素通過激活MAPK 和PI3K 信號級聯(lián)來誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞人白細胞抗原-G (human leucocyte antigen-G，HLA-G)的表達，參與滋養(yǎng)層細胞對母體的先天性和適應(yīng)性免疫。Ding 等[28]實驗證明瘦素siRNA 可通過抑制JAK2/STAT3 的激活及上調(diào)神經(jīng)肽Y2 受體的表達促進卵巢顆粒細胞凋亡并影響雌、孕激素合成，而雌、孕激素水平會直接影響子宮內(nèi)膜的形態(tài)和胞飲突的表達水平。Santos等[29]在研究中指出不明原因的RIF患者子宮內(nèi)膜中的瘦素表達明顯低于對照組(正常生育組)，相反其受體表達高于對照組。研究結(jié)果顯示，瘦素不但可以上調(diào)其受體的表達，而且瘦素及其受體表達譜的變化也參與了子宮容受性的發(fā)展，未來可能成為預(yù)測著床失敗的新標志物。除了影響子宮內(nèi)膜容受性以外，瘦素也會影響胚胎植入。研究表明，瘦素可以通過激活JAK2/STAT3信號通路，使子宮內(nèi)膜表面γ型上皮組織鈉通道(γ-epithelial Na+channel，γ-ENaC)表達下降，影響子宮液的吸收以及子宮的“閉合”，從而損害胚泡著床[30]。子宮內(nèi)膜中NKX2-1 與瘦素的相互作用目前尚無明確報道。但Chen 等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，在Ⅱ型肺泡上皮細胞中，瘦素不僅通過NKX2-1依賴機制提高胎兒肺成熟度并上調(diào)肺表面活性蛋白A(SP-A)的表達，同時也參與了對NKX2-1 表達的調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)，提示瘦素與NKX2-1 之間關(guān)系密切，其可能是NKX2-1 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的潛在靶點。NKX2-1也可能通過瘦素途徑來發(fā)揮對子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)控作用。

2.6 NKX2-1 與環(huán)氧合酶-2 環(huán)氧合酶-2 (cyclooxygenase-2，COX-2)是前列腺素生物合成的限速酶。據(jù)報道女性生殖系統(tǒng)中也存在COX-2的表達，主要參與調(diào)節(jié)女性排卵、胚胎著床和子宮蛻膜化等生殖過程。研究發(fā)現(xiàn)，在促性腺激素誘導(dǎo)的排卵峰作用下，卵巢顆粒細胞上會出現(xiàn)COX-2 的特異性表達，提示其表達水平與排卵過程密切相關(guān)。COX-2 合成的前列腺素(PGs)也與排卵過程中卵丘形成有關(guān)。張慧雅等[32]實驗證明卵巢顆粒細胞中COX-2 的表達與卵細胞受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率和妊娠率相關(guān)。研究顯示，COX-2可以通過促進前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的合成來上調(diào)整合素αvβ3 及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)的表達，參與著床部位子宮內(nèi)膜血管網(wǎng)的建立和子宮內(nèi)膜蛻膜化的發(fā)生，提高胚胎的種植率。Achache 等[33]發(fā)現(xiàn)在IVF-ET輔助受孕患者中，反復(fù)胚胎植入失敗者的磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)和COX-2 表達水平很低，提示前列腺素合成過程受阻會降低子宮內(nèi)膜容受性，進而使胚胎的種植率下降。Chang等[34]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠下丘腦非神經(jīng)元細胞中，NKX2-1 可與COX-2啟動子中的特定區(qū)域結(jié)合并抑制COX-2 的轉(zhuǎn)錄。由此推測在子宮內(nèi)膜細胞中，NKX2-1 也可能通過下調(diào)COX-2 mRNA 的表達水平，降低內(nèi)膜容受性，導(dǎo)致胚胎植入失敗的發(fā)生。

3 NKX2-1與母胎免疫

良好的妊娠結(jié)局依賴于母體免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定，而NKX2-1 異常表達會影響甲狀腺的功能進而引起機體免疫紊亂。在甲狀腺組織中，促甲狀腺激素(TSH)、促甲狀腺素受體(TSHR)、甲狀腺球蛋白(TG)及主要組織相容性復(fù)合物1 (MHC-1)等多種分子的表達都受到NKX2-1 的調(diào)節(jié)。研究表明，TTF-1 可直接或通過TG、TSH/TSHR-cAMP信號途徑方式間接上調(diào)MHC-1 及TSHR 的表達，過度呈遞自身抗原，導(dǎo)致甲狀腺自身免疫功能紊亂。而甲狀腺免疫功能紊亂會激活T淋巴細胞，導(dǎo)致外周血中CD4+T 細胞之間的平衡被打破，進一步導(dǎo)致子宮內(nèi)膜界面的免疫狀態(tài)受損，影響胚胎植入[35]。Safarian 等[36]的研究指出甲狀腺抗體的產(chǎn)生也對胚胎有毒性作用，主要表現(xiàn)為限制滋養(yǎng)層細胞的侵襲和阻礙胎兒的正常發(fā)育，進而導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生。

4 展望

雖然已有研究表明，轉(zhuǎn)錄因子NKX2-1 可以通過調(diào)控子宮內(nèi)膜表面與胚胎黏附、侵入及著床相關(guān)的多種細胞因子和黏附分子的表達，以及通過影響自身免疫的平衡，在妊娠過程中發(fā)揮雙重作用。但是由于NKX2-1 轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的復(fù)雜性，它是否還通過其他多種信號通路作用于生殖過程從而導(dǎo)致反復(fù)種植失敗的發(fā)生，這一過程仍未完全探究清楚。未來需要對NKX2-1的下游進行更加深入的研究，明確NKX2-1復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其在胚胎植入失敗中的具體作用機制，以期能夠提高輔助生殖受孕患者的臨床妊娠率。