王曉晨，陳露，劉暢，陳曉青，李芃，邱文洪

1 江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部免疫學(xué)教研室，武漢 430101；2 江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)中心；3 武漢市中心醫(yī)院皮膚科

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚病，臨床主要特征是濕疹樣病變，并伴有強(qiáng)烈瘙癢，而且是慢性或復(fù)發(fā)性的病程。該疾病影響到所有年齡和種族的人，對(duì)患者和親屬有重大的社會(huì)心理影響，是造成全球皮膚疾病負(fù)擔(dān)的主要原因［1］。免疫浸潤(rùn)是指免疫細(xì)胞在受損或感染的組織中聚集和活化的過(guò)程。研究［2］顯示，AD免疫浸潤(rùn)可能與表皮屏障功能障礙、表皮免疫微環(huán)境中細(xì)胞因子調(diào)節(jié)紊亂等因素有關(guān)，其發(fā)病機(jī)制涉及屏障功能障礙、微生物失調(diào)和免疫失調(diào)之間復(fù)雜的相互作用。角質(zhì)形成細(xì)胞作為皮膚角質(zhì)層的重要組成細(xì)胞，在皮膚屏障、皮膚炎癥以及免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用［3］。轉(zhuǎn)錄組是基因組遺傳信息和生物功能蛋白質(zhì)之間的必然聯(lián)系，轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是最重要的生物調(diào)控方法，也是研究最多的。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的一項(xiàng)高通量測(cè)序技術(shù)?；诘诙鷾y(cè)序技術(shù)的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究，可以挖掘、了解更多的基因結(jié)構(gòu)信息，進(jìn)而為臨床治療提供依據(jù)。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析非編碼RNA的表達(dá)對(duì)疾病的影響機(jī)制，研究AD發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，增加對(duì)AD的了解，并識(shí)別新的治療靶點(diǎn)，以改進(jìn)診斷和治療策略，為臨床治療提供更多更有效的解決方案。miR-155是一種多功能微小RNA，在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中起著重要作用［4-7］。有研究［8］表明，miR-155在AD患者皮損處中高表達(dá)。2022年6月—2022年12月，我們篩選了與AD免疫浸潤(rùn)相關(guān)的miR-155靶基因，并進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取和處理 在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/）按照以下條件檢索基因表達(dá)譜：①疾病為AD；②生物類型為人類；③樣本類型為皮膚組織。最終選取GSE121212和GSE157194兩個(gè)數(shù)據(jù)集作為研究分析對(duì)象，其中GSE121212數(shù)據(jù)集包括21例AD患者的皮損區(qū)和非皮損區(qū)皮膚活檢樣本組織；GSE157194數(shù)據(jù)集包括57例AD患者的皮損區(qū)和其中54例AD患者的非皮損區(qū)皮膚活檢樣本組織。

1.2 AD皮損區(qū)差異表達(dá)基因生物學(xué)功能分析、顯著差異表達(dá)基因的篩選及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）繪制1.2.1 AD皮損區(qū)差異表達(dá)基因的篩選 利用R軟件包limma-voom （version 3.40.6）對(duì)GSE121212、GSE157194數(shù)據(jù)集按照|log2Fc|≥1、P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)的基因，利用VENNY 2.1.0網(wǎng)站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將GSE121212、GSE157194數(shù)據(jù)集篩選出的基因取交集，獲得AD差異表達(dá)基因。

1.2.2 AD皮損區(qū)差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能分析 使用R軟件包org.Hs.eg.db（version 3.1.0）中的基因的GO注釋，以此作為背景，將篩選出的AD差異表達(dá)基因映射到背景集合中，使用R軟件包c(diǎn)lusterProfiler（version 3.14.3）進(jìn)行GO功能富集分析，獲得基因集富集的結(jié)果。對(duì)于基因集KEGG通路富集分析，我們使用KEGG rest API （https：//www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html）獲取了最新的KEGG Pathway的基因注釋，以此作為背景，將篩選出的AD差異表達(dá)基因映射到背景集合中，使用R軟件包c(diǎn)lusterProfiler（version 3.14.3）進(jìn)行KEGG通路富集分析，獲得基因集富集的結(jié)果。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3 AD皮損區(qū)顯著差異表達(dá)基因的篩選、PPI繪制 為了找到作用更明顯的顯著差異基因，我們對(duì)上述獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)一步按照|log2Fc|≥2、P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選出顯著差異表達(dá)基因，將篩選出的顯著差異表達(dá)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cn.string-db.org/）繪制PPI，通過(guò)Cytoscape插件MCODE模塊分析得分最高的3個(gè)模塊。

1.3 AD皮損區(qū)與非皮損區(qū)皮膚免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況分析 基于CIBERSORT算法，按照P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算22種免疫細(xì)胞在GSE157194數(shù)據(jù)集樣本中的占比情況，對(duì)AD皮損區(qū)與非皮損區(qū)皮膚免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行差異分析。

1.4 miR-155靶基因的預(yù)測(cè)及其與AD免疫浸潤(rùn)相關(guān)基因的篩選 利用miRNet網(wǎng)站（https：//www.mirnet.ca/miRNet/home.xhtml）對(duì)miR-155靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并利用VENNY 2.1.0網(wǎng)站對(duì)miR-155靶基因和AD顯著差異表達(dá)基因取交集，利用The Human Protein Atlas網(wǎng)站，查找交集基因在人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞上的轉(zhuǎn)錄水平，并根據(jù)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況、AD皮損區(qū)差異表達(dá)基因GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果，選擇與AD免疫浸潤(rùn)相關(guān)性較高的基因進(jìn)行細(xì)胞驗(yàn)證。

1.5 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)、分組及炎癥模型構(gòu)建 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HaCaT細(xì)胞按8×105/孔細(xì)胞密度接種于6孔板中，將細(xì)胞置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，等到細(xì)胞貼壁牢固后分為control組和TI組。TI組細(xì)胞棄去舊培養(yǎng)基，加入2 mL無(wú)菌PBS清洗2次，然后進(jìn)行HaCaT細(xì)胞炎癥模型的構(gòu)建：每孔加入含5 ng/mL的TNF-α和5 ng/mL的IFN-γ新鮮培養(yǎng)基刺激6 h后，棄去含藥物的培養(yǎng)基，加上10%完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。control組常規(guī)培養(yǎng)。

1.6 TI組、control組細(xì)胞中miR-155檢測(cè) 采用qRT-PCR法。取TI組、control組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以U6為參照，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。qPCR反應(yīng)體系為：cDNA 5 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，SYBR Green 10 μL， Nucleasefree water 3 μL。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 30 s；95 ℃5 s，60 ℃ 30 s，44個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示細(xì)胞中目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 TI組HaCaT細(xì)胞亞組設(shè)置、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及CXCL1、CXCL8 mRNA檢測(cè) 取TI組HaCaT細(xì)胞分成2個(gè)亞組：TI + miR-155 mimics組、TI + mimics NC組。TI + miR-155 mimics組轉(zhuǎn)染miR-155過(guò)表達(dá)質(zhì)粒miR-155 mimics，TI + mimics NC組轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒mimics NC，轉(zhuǎn)染過(guò)程均按照l(shuí)ipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行，轉(zhuǎn)染完成后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以GAPDH為內(nèi)參，參照“1.6”方法檢測(cè)TI+ miR-155 mimics組、TI + mimics NC組細(xì)胞中CXCL1、CXCL8 mRNA。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料呈正態(tài)分布時(shí)以±s表示，比較用t檢驗(yàn)或單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD皮損區(qū)差異表達(dá)基因生物學(xué)功能分析及顯著差異表達(dá)基因的篩選結(jié)果 從GSE121212數(shù)據(jù)集中篩選出1547個(gè)差異表達(dá)基因，其中920個(gè)上調(diào)基因、627個(gè)下調(diào)基因。從GSE157194數(shù)據(jù)集中篩選出1031個(gè)差異表達(dá)基因，其中731個(gè)上調(diào)基因、300個(gè)下調(diào)基因。取交集后，共篩選得到519個(gè)AD差異表達(dá)基因。

GO功能富集分析結(jié)果顯示，這些差異表達(dá)基因在參與生物過(guò)程（BP）方面主要富集在免疫系統(tǒng)過(guò)程、免疫反應(yīng)、防御反應(yīng)、白細(xì)胞的激活等；在細(xì)胞組分（CC）方面主要富集于細(xì)胞外區(qū)域、質(zhì)膜的固有成分、質(zhì)膜部分、質(zhì)膜的組成部分、細(xì)胞表面等；在分子功能（MF）方面主要富集在趨化因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、信號(hào)受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體活性等方面。GO功能富集分析結(jié)果提示，這些差異表達(dá)基因在表皮免疫微環(huán)境中主要通過(guò)免疫分子相互作用，參與免疫應(yīng)答過(guò)程，引起炎癥反應(yīng)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，通路主要富集在細(xì)胞因子—細(xì)胞因子受體相互作用、病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用、趨化因子信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Th1和Th2細(xì)胞分化、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等炎癥相關(guān)信號(hào)通路。KEGG通路富集分析結(jié)果提示，這些差異表達(dá)基因在表皮免疫微環(huán)境中主要通過(guò)趨化因子等相關(guān)炎癥分子信號(hào)通路參與免疫應(yīng)答過(guò)程，引起炎癥反應(yīng)。

從GSE121212數(shù)據(jù)集中篩選出210個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中158個(gè)上調(diào)基因、52個(gè)下調(diào)基因；從GSE157194數(shù)據(jù)集中篩選出122個(gè)顯著差異表達(dá)基因，其中106個(gè)上調(diào)基因、16個(gè)下調(diào)基因。取交集后，共篩選得到73個(gè)AD顯著差異表達(dá)基因。成功構(gòu)建出由67個(gè)節(jié)點(diǎn)、146條邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，其中得分最高的模塊得分10分，模塊中包括PI3、SPRR2B、LCE3C、LCE3E、SPRR3、LCE3A、SPRR2A、SPRR2F、LCE3D、LCE5A等基因，其中LCE5A基因是表達(dá)下調(diào)基因，其余均為表達(dá)上調(diào)基因；得分第二高的模塊得分5分，模塊中包括KRT16、KRT6A、KRT6C、KRT6B、DEFB4A、S100A7、SERPINB4、SERPINB3等基因，全部為表達(dá)上調(diào)基因；得分第三高的模塊得分4.5分，模塊中包括CXCL1、CXCL10、CCL17、MMP1、SELE等基因，全部為表達(dá)上調(diào)基因。

2.2 AD皮損區(qū)與非皮損區(qū)皮膚免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況分析結(jié)果 樹(shù)突狀細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞在表皮免疫微環(huán)境中占比最高，免疫浸潤(rùn)最明顯?；罨挠洃汣D4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、未活化的自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、活化的樹(shù)突狀細(xì)胞等在AD患者的皮損區(qū)有不同程度的升高，而未活化的肥大細(xì)胞在AD患者的皮損區(qū)明顯減少。

2.3 miR-155靶基因及其與AD免疫浸潤(rùn)相關(guān)基因的篩選結(jié)果 預(yù)測(cè)得到4724個(gè)miR-155靶基因。取交集后，篩選得到13個(gè)基因，包括CXCL8、KRT6B、SELE、PI3、CHAC1、TCN1、OASL、CXCL1、C6orf223、IGFL1、MMP1、AKR1B10、FOSL1。在這13個(gè)基因中，在HaCaT細(xì)胞上的轉(zhuǎn)錄水平較高的基因?yàn)镻I3、FOSL1、CXCL8和CXCL1，其中與AD免疫浸潤(rùn)相關(guān)性比較高的基因?yàn)镃XCL1、CXCL8。

2.4 TI組、control組細(xì)胞中miR-155相對(duì)表達(dá)量比較 TI組、control組細(xì)胞中miR-155相對(duì)表達(dá)量分別為24.606 ± 3.060、1.156 ± 0.214，兩組相比，P＜0.05，說(shuō)明TNF-α和IFN-γ可提高HaCaT細(xì)胞中miR-155的相對(duì)表達(dá)量。

2.5 TI + miR-155 mimics組、TI + mimics NC組細(xì)胞中CXCL1、CXCL8 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 TI+ miR-155 mimics組細(xì)胞中CXCL1、CXCL8 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為6.032 ± 0.216、22.561 ± 0.566，TI + mimics NC組細(xì)胞中CXCL1、CXCL8 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為4.159 ± 0.351、12.778 ± 0.761，兩組相比，P均＜0.05，說(shuō)明miR-155可顯著提高炎癥時(shí)HaCaT細(xì)胞中CXCL1、CXCL8基因的表達(dá)水平。

3 討論

AD的病理生理機(jī)制主要包括皮膚屏障功能受損、免疫系統(tǒng)功能的失調(diào)以及環(huán)境因素的影響［9］。皮膚屏障的破壞會(huì)導(dǎo)致皮膚屏障功能障礙，改變表皮微環(huán)境中免疫分子水平以及免疫細(xì)胞功能和數(shù)量，進(jìn)而引發(fā)AD患者的皮膚炎癥，造成AD患者的免疫失調(diào)。而角質(zhì)形成細(xì)胞作為皮膚的重要組成成分，起著皮膚屏障的作用，還可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［3］?；罨慕琴|(zhì)形成細(xì)胞可分泌IL-1、IL-6、TNF-α、TSLP等多種細(xì)胞因子和趨化因子等，在調(diào)節(jié)表皮免疫微環(huán)境和皮膚屏障功能等方面發(fā)揮作用［10］。

miR-155是一種多功能miRNA，參與免疫細(xì)胞的分化、發(fā)育以及免疫應(yīng)答的調(diào)控［4，11］，以及介導(dǎo)炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用［6］。SONKOLY等［8］研究表明，在AD患者皮損處miR-155的表達(dá)量高于非皮損處，并且miR-155在AD患者皮損處的高表達(dá)最為顯著。但miR-155在表皮免疫微環(huán)境中的作用機(jī)制還不清楚。

本研究使用生物信息學(xué)方法篩選AD患者皮損區(qū)與非皮損的差異表達(dá)基因，并對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO功能富集分析顯示差異表達(dá)基因的分子功能主要富集在趨化因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、信號(hào)受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體活性等方面，主要參與和免疫細(xì)胞因子及其通路相關(guān)的生物過(guò)程。KEGG功能富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因富集到了細(xì)胞因子—細(xì)胞因子受體相互作用、病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用、趨化因子信號(hào)通路等與細(xì)胞因子相關(guān)的多條信號(hào)通路。GO和KEGG功能富集分析結(jié)果提示，這些差異表達(dá)基因在表皮免疫微環(huán)境主要通過(guò)免疫分子相互作用，影響趨化因子等相關(guān)炎癥分子信號(hào)通路，參與免疫應(yīng)答過(guò)程，引起炎癥反應(yīng)，在AD的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。

免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析結(jié)果顯示，樹(shù)突狀細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞在表皮免疫微環(huán)境中占比最高，免疫浸潤(rùn)明顯。這些免疫細(xì)胞可分泌多種細(xì)胞因子，如IL-31、IL-17、IL-23、IL-33，這些細(xì)胞因子會(huì)引起宿主的免疫反應(yīng)，加強(qiáng)炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)的刺激又進(jìn)一步損傷皮膚屏障，造成皮膚屏障功能障礙［12-14］。

本研究進(jìn)一步篩選出13個(gè)顯著差異基因，可能為miR-155的靶基因?；诨蛟贖aCaT細(xì)胞上的轉(zhuǎn)錄水平，以及免疫浸潤(rùn)分析和功能富集分析的結(jié)果，我們篩選出趨化因子CXCL1和CXCL8來(lái)驗(yàn)證miR-155對(duì)HaCaT細(xì)胞的影響，為進(jìn)一步探索miR-155在AD免疫浸潤(rùn)中的作用機(jī)制，明確特應(yīng)性皮炎發(fā)病機(jī)制打基礎(chǔ)。

CXCL1是中性粒細(xì)胞的化學(xué)引誘劑，在炎癥中起作用［15-17］。CXCL8又稱IL-8，是由巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞等分泌的細(xì)胞因子，是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，可以與其他細(xì)胞因子一起參與促炎信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并在全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）中發(fā)揮作用［18-21］。CXCL1與CXCL8都可與G蛋白偶聯(lián)受體CXC受體2（CXCR2）結(jié)合增加血管的通透性［22］。從本研究做出的PPI網(wǎng)絡(luò)也可以看出，CXCL1和CXCL8可以相互作用，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

HaCaT細(xì)胞是人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞，目前常用于皮膚的體外研究。TNF-α和IFN-γ可促進(jìn)炎癥細(xì)胞的活化與浸潤(rùn)，是目前公認(rèn)的誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞炎癥模型的細(xì)胞因子［23］。本研究結(jié)果表明，在炎癥細(xì)胞模型中，高水平的miR-155可以促進(jìn)趨化因子CXCL1和CXCL8的分泌，參與皮膚炎癥反應(yīng)發(fā)生。

綜上，通過(guò)生物信息學(xué)挖掘技術(shù)，對(duì)AD的皮損區(qū)與非皮損區(qū)皮膚進(jìn)行基因差異分析、功能富集分析以及免疫浸潤(rùn)分析，篩選出miR-155靶基因趨化因子CXCL1和CXCL8。miR-155可以促進(jìn)HaCaT細(xì)胞趨化因子CXCL1和CXCL8的分泌，可能通過(guò)CXCL1和CXCL8改變表皮微環(huán)境中免疫分子水平，進(jìn)而導(dǎo)致免疫細(xì)胞浸潤(rùn)增加，造成AD患者的免疫調(diào)節(jié)功能失衡，引發(fā)AD患者的皮膚炎癥。但miR-155是如何調(diào)控CXCL1和CXCL8表達(dá)，并影響特應(yīng)性皮炎患者皮損區(qū)表皮免疫微環(huán)境中免疫分子水平以及免疫細(xì)胞數(shù)量和功能，有待進(jìn)一步研究。