達麗雋，王遵林，劉雅婷，劉進進，宋飛雪

1 蘭州大學第二醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，蘭州 730030；2 蘭州大學第二臨床醫(yī)學院；3 蘭州大學第一醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科

據(jù)統(tǒng)計，肺癌是引起全球癌癥死亡的第一大病因［1］。由于缺乏典型癥狀及特異性篩查手段，絕大部分肺癌患者確診時已屬晚期，5年生存率不足20%［2］。肺癌患者中約有85%為非小細胞肺癌（nonsmall-cell lung cancer， NSCLC），雖然針對驅(qū)動基因的靶向藥物的應用顯著提高了肺腺癌的臨床療效，但隨之而來的耐藥問題使患者的獲益時間也僅能維持1年左右。因此，含順鉑的聯(lián)合化療仍然是晚期NSCLC的治療基石。近年來，順鉑耐藥已成為普遍現(xiàn)象，大大限制了肺癌的化療療效，如何有效逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥性是目前肺癌領域研究熱點。Hedgehog（Hh）信號通路在胚胎發(fā)育階段發(fā)揮至關重要的作用［3］。隨著研究深入，越來越多的證據(jù)［4］表明，Hh信號通路在肺癌中被異常激活，參與腫瘤增殖、分化、遷徙、轉(zhuǎn)移、凋亡、耐藥等過程。Smo作為Hh通路中重要的跨膜蛋白，負責細胞內(nèi)信號傳導和靶基因的激活，Smo抑制劑環(huán)杷明也常常作為Hh通路的阻斷劑應用于多種研究，而通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子Gli1則被認為是該通路過度激活的重要標志［5］。此外，研究［6］發(fā)現(xiàn)，Gli1基因的過表達除了受Hh信號通路調(diào)控外，還與磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphonoinositol 3 kinase/protein kinase B， PI3K/AKT）信號通路異常激活相關，這表明Hh信號通路與PI3K/AKT信號通路之間可能通過Gli1存在“串話”現(xiàn)象。信號通路間“串話”作用是指某一信號通路與其他信號通路在生物活動中相互聯(lián)系，產(chǎn)生一系列復雜的生理效應，“串話”不僅表現(xiàn)在細胞信號強弱的調(diào)節(jié)、功能上的協(xié)同或拮抗，也可引起與原細胞信號通路完全不同的生物反應。2022年1月—2023年1月，我們觀察了抑制核轉(zhuǎn)錄因子Gli1表達對人肺腺癌耐順鉑細胞株的順鉑耐藥性逆轉(zhuǎn)作用，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物及試劑 人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP購自上海瑞鹿生物公司；試驗用藥順鉑、環(huán)杷明（Smo抑制劑）、LY294002（PI3K抑制劑）、GANT61（Gli1抑制劑）購自美國Santa Cruz公司；RNAiso Plus（Total RNA提取試劑盒）、熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生物公司；Gli1、β-actin引物由上海生物工程公司合成；Gli1、Bcl-2、Bax、MRP1、β-actin抗體購自美國Abcam公司；MTT細胞毒性檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇碧云天公司。

1.2 細胞分組及藥物給與 將A549/DDP細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、青-鏈霉素各10 μg/mL的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次。取對數(shù)生長期細胞，接種于6孔培養(yǎng)板上，待細胞融合達70%～80%時，將培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基，并隨機分為四組，分別為GANT61組、環(huán)杷明組、LY294002組、對照組，GANT61組加入10 μmol/L的GANT61，環(huán)杷明組加入10 μmol/L的環(huán)杷明，LY294002組加入20 μmol/L的LY294002，對照組加入培養(yǎng)基。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 各組細胞中Gli1 mRNA和蛋白檢測

1.3.1 各組細胞中Gli1 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。取各組細胞，采用RNA提取試劑盒，提取細胞總RNA，參照試劑盒說明書進行cDNA逆轉(zhuǎn)錄，以SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，dH2O 8.5 μL的反應體系擴增Gli1基因，β-actin為內(nèi)參照。Gli1上游引物：5'-CTGGACCTGCAGACGGTTATC-3'，下游引物：5'-AGCCTCCTGGAGATGTGCAT-3'；β-actin上游引物：5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物：5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。擴增條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s（40個循環(huán)），65 ℃延伸10 min。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。

1.3.2 各組細胞中Gli1蛋白檢測 采用Western Boltting法。取各組細胞，用PBS洗滌細胞后，提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每組取40 μg蛋白，于Mini-PROTEAN TGX預制膠中行蛋白上樣，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，再經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h，加入相應一抗，一抗工作濃度分別為Gli1（1：1000）、β-actin（1：5000），4 ℃孵育過夜，次日洗膜后，以辣根過氧化酶標記的二抗（1：20000）37 ℃孵育1 h，再洗膜3次，按照ECL發(fā)光試劑盒說明書進行檢測，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，使用Image J軟件掃描灰度值，以灰度值表示各組細胞中Gli1蛋白的相對表達量。

1.4 各組細胞的順鉑耐藥性觀察

1.4.1 順鉑對各組細胞的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitoryconcentration， IC50）測算 采用MTT法。取各組細胞，將細胞接種于96孔板上，每孔4×103個細胞，加入不同濃度順鉑（終濃度分別為1、2、4、8、16 μg/mL），設三個復孔，同時設置陰性對照孔和空白對照孔。作用48 h后，每孔加入5 mg/mL四甲基偶氮唑藍（MTT）20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加DMSO 150 μL/孔，震蕩10 min，酶標儀570 nm處測定各孔的吸光度值，以時間為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制細胞生長曲線，計算順鉑對各組細胞的IC50值。

1.4.2 各組細胞中多藥耐藥相關蛋白（multidrug resistance-associated protein 1， MRP1）檢測 參照方法“1.3.2”檢測MRP1蛋白，其中一抗工作濃度為1：1000，以灰度值表示各組細胞中MRP1蛋白的相對表達量。

1.4.3 各組細胞凋亡率測算 采用Annexin V-FITC法。取各組細胞，向各組細胞加入順鉑（5 μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用0.25%胰蛋白酶消化收集細胞，加入PBS緩沖液輕輕震蕩，將細胞重懸于200 μL的Binding Buffer，加入5 μL的Annexin V-FITC輕輕混勻，避光室溫反應15 min，再加入5 μL的PI染色，室溫避光孵育20 min后，使用流式細胞儀檢測，使用Flowjo軟件計算各組細胞凋亡率。

1.4.4 各組細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax檢測參照方法“1.3.2”檢測Bcl-2、Bax蛋白，其中一抗工作濃度為Bcl-2（1∶2000）、Bax（1∶1000），以灰度值表示各組細胞中Bcl-2、Bax蛋白的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料呈正態(tài)分布時以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞中Gli1 mRNA和Gli1蛋白相對表達量比較 GANT61組、環(huán)杷明組、LY294002組、對照組細胞中Gli1 mRNA相對表達量分別為0.30 ±0.08、0.62 ± 0.12、0.68 ± 0.11、1.05 ± 0.10，其中環(huán)杷明組與LY294002組相比，P＞0.05；其余組間兩兩相比，P均＜0.05。GANT61組、環(huán)杷明組、LY294002組、對照組細胞中Gli1蛋白相對表達量分別為0.28 ± 0.12、0.59 ± 0.07、0.55 ± 0.13、0.97 ± 0.06，其中環(huán)杷明組與LY294002組相比，P＞0.05；其余組間兩兩相比，P均＜0.05。

2.2 各組細胞的順鉑耐藥性比較

2.2.1 順鉑對各組細胞的IC50值比較 順鉑對GANT61組、環(huán)杷明組、LY294002組、對照組細胞的IC50值分別為（7.35 ± 1.03）、（9.86 ± 0.71）、（10.23 ± 1.02）、（14.26 ± 2.10）μg/mL，其中環(huán)杷明組與LY294002組相比，P＞0.05；其余組間兩兩相比，P均＜0.05。

2.2.2 各組細胞中MRP1蛋白相對表達量比較GANT61組、環(huán)杷明組、LY294002組、對照組MRP1蛋白的相對表達量分別為0.18 ± 0.09、0.38 ±0.17、0.58 ± 0.19、0.83 ± 0.24，組間相比，P均＜0.05。

2.2.3 各組細胞凋亡率比較 GANT61組、環(huán)杷明組、LY294002組、對照組細胞凋亡率分別為27.27 % ± 0.99%、15.45% ± 1.01%、12.35% ±1.80%、6.25% ± 0.38%，其中環(huán)杷明組與LY294002組相比，P＞0.05；其余組間兩兩相比，P均＜0.05。

2.2.4 各組細胞中Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較 GANT61組、環(huán)杷明組、LY294002組、對照組細胞中Bcl-2蛋白的相對表達量分別為0.15 ± 0.08、0.33 ± 0.15、0.63 ± 0.13、0.91 ± 0.19，組間相比，P均＜0.05。GANT61組、環(huán)杷明組、LY294002組、對照組細胞中Bax蛋白的相對表達量分別為1.88 ±0.38、1.34 ± 0.25、1.27 ± 0.39、0.64 ± 0.18，其中環(huán)杷明組與LY294002組相比，P＞0.05；其余組間兩兩相比，P均＜0.05。

3 討論

Hh信號通路在1980年由NUSSLLEIN-VOLHARD和WIESCHAUS首次發(fā)現(xiàn)，它被證實參與調(diào)控果蠅幼蟲身體節(jié)段的發(fā)育過程［7］。Hh信號通路主要由三種同源配體（IHh、DHh、SHh）、跨膜蛋白受體（Ptch、Smo）、核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Gli家族及下游靶基因共同組成［8］。當通路激活時，Hh配體與其受體Ptch相結合，使Ptch對Smo的抑制作用得以解除，活化的Smo通過一系列信號傳導過程激活核轉(zhuǎn)錄因子Gli家族。Gli蛋白家族有Gli1、Gli2、Gli3三個成員，三者均含有5個高度保守的鋅指DNA結合結構域。由于Gli2和Gli3同時含有活化結構域和阻遏結構域，故二者既能激活下游靶基因，也可在一定程度上抑制靶基因的表達，而Gli1因缺乏阻遏結構域，在通路中僅發(fā)揮正向作用來調(diào)節(jié)靶基因的表達［9］。因此，學者們普遍將Gli1的上調(diào)視為Hh信號通路活化的標志。

順鉑是肺癌化療中應用最廣泛的細胞毒藥物，除了能直接殺傷腫瘤細胞外，它還可以有效誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。然而由于腫瘤耐藥性的產(chǎn)生，使其療效不盡人意。常見的腫瘤耐藥機制學說有腫瘤微環(huán)境、腫瘤上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、免疫逃逸、表觀遺傳以及腫瘤耐藥信號通路代償?shù)?。由于上述學說中均有Hh信號通路的參與，所以該通路已成為研究腫瘤耐藥機制的重要靶點。KONG等［10］研究證實，Hh信號通路通過調(diào)控EMT因子的表達來參與人類髓性白血病細胞耐藥性的產(chǎn)生。GIROUX等［11］在對36例NSCLC患者的研究中發(fā)現(xiàn)，12例化療耐藥患者中Gli1的表達水平顯著高于非耐藥組。將Hh信號通路抑制劑維莫德吉作用于順鉑耐藥小細胞肺癌中，可顯著提高癌細胞對順鉑的敏感性，增加細胞凋亡比例［12］。因此，我們推斷通過抑制Hh信號通路可能會逆轉(zhuǎn)NSCLC耐順鉑細胞株A549/DDP的耐藥性，為順鉑耐藥患者提供新的治療靶點。

PI3K/AKT信號通路在機體生長發(fā)育過程中同樣發(fā)揮重要作用。PI3K是一類特異性催化磷脂酰肌醇物質(zhì)的激酶，活化的PI3K可促進AKT磷酸化，使AKT從胞膜轉(zhuǎn)移至胞核，進一步激活下游分子如mTOR、Bcl-2家族、S6蛋白激酶等，進而參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、分化及凋亡等［13］。目前多項研究表明PI3K/AKT信號通路在促進腫瘤耐藥性方面同樣扮演重要角色。MRP是一種跨膜藥泵，它可通過多種方式將化療藥物泵出細胞，從而降低癌細胞對化療藥物的敏感性。有研究［14］證實，在前列腺癌和急性粒細胞白血病中MRP1的表達依賴于P13K/AKT信號通路的異常激活。張勁遠等［15］發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路能上調(diào)人大腸癌細胞hct-8/FU中P-GP蛋白的表達，提高細胞對氟尿嘧啶的耐藥性。WANG等［16］將PI3K抑制劑作用于肺癌細胞，發(fā)現(xiàn)細胞對順鉑的敏感性顯著增強，提示PI3K/AKT信號通路與肺癌順鉑耐藥性之間可能存在密切聯(lián)系。最新研究發(fā)現(xiàn)，Hh信號通路可與PI3K/AKT信號通路通過交叉調(diào)控現(xiàn)象促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。在基底細胞癌中，PI3K下游分子S6K1和aPKC通過磷酸化Gli1來激活其轉(zhuǎn)錄活性，進而調(diào)控靶基因的表達，參與腫瘤多種生物學活動［17］。所以轉(zhuǎn)錄因子Gli1可視為這兩條通路的關鍵交叉點。那么在肺腺癌中是否也存在這種相互關系？目前鮮有報道，并且其參與調(diào)控肺癌耐藥性的具體機制也有待進一步闡明。

本研究中，我們以人肺腺癌耐順鉑細胞株A549/DDP為細胞模型，分別采用Smo抑制劑環(huán)杷明、PI3K抑制劑LY294002以及Gli1特異性抑制劑GANT61，觀察比較這三種藥物對Gli1的影響。結果顯示三種抑制劑均能不同程度下調(diào)Gli1的表達，其中應用GANT61使Gli1的表達量下降最為顯著。這證實了在肺腺癌中Gli1不但是Hh信號通路下游的核轉(zhuǎn)錄因子，受Hh信號通路直接調(diào)控，同時Gli1也受PI3K/AKT信號通路的調(diào)控，即Hh通路與PI3K/AKT通路之間存在“串話”關系。近年來，許多研究表明Bcl-2家族可通過拮抗腫瘤藥物誘導的細胞凋亡效應參與腫瘤耐藥性的產(chǎn)生［18］。此外，MRP1是目前公認的介導化療藥物外排導致多藥耐藥產(chǎn)生的主要蛋白之一［19］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)隨著Gli1被抑制，Bcl-2、MRP1的蛋白表達量明顯下降，而Bax的蛋白表達量顯著上調(diào)；MTT結果顯示抑制Gli1可以顯著提高順鉑對肺腺癌細胞的抑制率，最后，Annexin V-FITC凋亡實驗進一步闡明了Gli1與肺癌順鉑耐藥之間的關系，即抑制Gli1能提高順鉑誘導的細胞凋亡率，使A549/DDP細胞對順鉑的敏感性增強，從而逆轉(zhuǎn)肺癌的順鉑耐藥性。

綜上所述，Smo抑制劑環(huán)杷明、PI3K抑制劑LY294002、Gli1抑制劑GANT61均可抑制A549/DDP細胞中Gli1的表達；抑制Gli1表達可通過降低順鉑對A549/DDP細胞的IC50、促進A549/DDP細胞凋亡，逆轉(zhuǎn)A549/DDP細胞對順鉑的耐藥性。與環(huán)杷明和LY294002相比，GANT61具有更高的拮抗效率，因此，GANT61有望成為肺癌靶點治療領域的新策略之一。當然，肺癌細胞耐藥性的產(chǎn)生是一系列極其復雜的過程，具體作用機理尚待進一步闡明，并且，針對Gli1靶點的抑制劑在臨床中的進一步應用仍需進行大量更深入的研究。