古 捷，楊 舉，魯佳佳，蘇麗嬌，陶 欣，張郡童，釧永明，楊麗娟

(云南民族大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南省高校智能超分子化學(xué)重點實驗室，生物基材料綠色制備技術(shù)國家地方聯(lián)合工程中心，云南 昆明 650500)

桔皮素(Tangeretin，TAN)是一種化學(xué)骨架上含有2 個以上甲氧基的黃酮類化合物，TAN 幾乎只存在于柑橘類水果中，尤其是其果皮中含量豐富[1-3].據(jù)報道，TAN 具有抗炎、抗真菌、抗癌、抗糖尿病和神經(jīng)保護等作用[4-8].近年來，TAN 已被應(yīng)用于臨床研究，例如TAN 能通過Nrf2/NF-κB 和MAPK/NF-κB 介導(dǎo)抑制細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解來消除骨關(guān)節(jié)炎(OA)[9]，對于高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)的小鼠，長期補充TAN 可通過改善脂肪產(chǎn)熱、減少全身炎癥和腸道菌群失調(diào)以改善肥胖表型[10].但由于TAN 的溶解性、生物利用度、穩(wěn)定性較低[11-12]，導(dǎo)致TAN 在食品和保健品領(lǐng)域的應(yīng)用有限，因此選擇一種疏水載體包合TAN 十分有意義.

環(huán)糊精(Cyclodextrin，CD)作為一種具有疏水空腔的多糖，本身不具有毒性且生物相容性好，常被選作疏水藥物的載體，目前尚未見CDs 對TAN的包合作用研究報道.因此本文選擇了β-CD、HPβ-CD 以及TM-β-CD 與TAN 構(gòu)筑了3 種新型主客體包合物（CDs 與TAN 的結(jié)構(gòu)及包合物TAN/CDs形成示意圖如圖1），通過紫外?可見吸收光譜（UVVis）、核磁共振（1H NMR、2D NMR）、X 射線粉末衍射（XRD）、傅里葉紅外光譜(FT-IR)、掃描電鏡（SEM）和分子對接對3 種包合物進行了表征，研究了β-環(huán)糊精及其衍生物對TAN 水溶性和穩(wěn)定性的改善情況.結(jié)果表明，包合后，TAN 的水溶性和穩(wěn)定均顯著提高，這為以β-CD 及其衍生物作為藥物載體，制備TAN 的藥物制劑提供了理論依據(jù).

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑Aglient 8453 紫外?可見分光光度計（美國安捷倫公司）；Quanta200 掃描電子顯微鏡（美國 FEI 公司）；TTR 18 kW 銅靶轉(zhuǎn)靶 X 射線衍射儀（日本理學(xué)公司）；Avance DRX 500（瑞士Bruker 公司）；NICOLET iS10 傅里葉紅外光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）.

TAN（寶雞辰光生物科技有限公司）；β-CD、HP-β-CD、TM-β-CD（德國J&K TANientific 公司）；所有試劑均為分析純，實驗用水均為去離子水.

1.2 實驗方法

1.2.1 TAN/CDs 物理混合物和包合物 的制備首先，按照CDs 和TAN 摩爾比為1∶1.5 準(zhǔn)確稱取CDs 0.02 mmol 于50 mL 圓底燒瓶中，加入16 mL超純水，然后在50 ℃下攪拌，再稱取TAN 0.03 mmol 于50 mL 燒杯中，加入16 mL 乙醇，超聲輔助使TAN 充分溶解，然后將TAN 溶液緩慢加入CDs 溶液中，加完后在50 ℃下反應(yīng)2 d，反應(yīng)結(jié)束后用0.45 μm 過濾器過濾，旋干溶劑后加入32 mL超純水超聲輔助下使其溶解，經(jīng)過濾后再次旋干溶劑，真空干燥24 h，即得TAN/CDs 包合物(均為淡黃色固體粉末).

1.2.2 TAN 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用乙醇配制濃度分別為0.010,0.012,0.014,0.016,0.018,0.020,0.022,0.024,0.026 mmol/L 的TAN 溶液，并在λmax=323 nm處測定各溶液的吸光度值，以TAN 的濃度(c)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=28.364 1c?0.046 4，R2=0.999 5(n=9).

1.2.3 紫外?可見吸收光譜(UV-Vis)測定 保持TAN 的濃度為0.015 mmol/L，按照表S1（見電子版支撐材料）分別配制不同濃度梯度的β-CD、TMβ-CD、HP-β-CD 溶液，并分別采用Na2HPO4-檸檬酸和NaHCO3-Na2CO3緩沖體系控制溶液的pH 為3.0 和10.5，用緩沖溶液與乙醇混合液(體積比4∶1)定容，然后在λmax=330 nm 處測定各組溶液的紫外?可見吸收光譜.

1.2.4 Job 曲線 采用Job 法[13]測定TAN 與CDs的包合比.使用Na2HPO4?檸檬酸緩沖溶液（pH=3.0）配制系列濃度的TAN 與CDs 的混合液，保持混合液的總濃度為0.015 mmol/L，使TAN 與CDs 的摩爾比在0～1 范圍內(nèi)變化，在λmax=330 nm 處測定各溶液的吸光度值.

1.2.5 TAN/CDs 包合物的水溶性實驗 采用飽和溶液法[14]測定包合物在水中的溶解度.將過量的TAN/CDs 分別溶于去離子水中，超聲使其充分溶解，并達到飽和狀態(tài).用0.45 μm 微孔濾膜過濾除去不溶物，移取0.05 mL 濾液至5 mL 容量瓶中，用乙醇定容，搖勻后，在λmax=330 nm 處測量各溶液的吸光度.

1.2.6 TAN/CDs 包合物的穩(wěn)定性實驗 取兩組各6 個25 mL 的棕色容量瓶，分別加入0.015 mmol/L TAN 溶液，在兩組中的5 個容量瓶中分別加入4 mmol/L 的β-CD、HP-β-CD 及TM-β-CD，并分別采用KCl-HCl 和Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液控制pH 值為1.5（模擬胃液環(huán)境）和7.6（模擬腸液環(huán)境），用乙醇?緩沖溶液(體積比1∶4)定容，37 ℃水浴孵育1 h 后，每隔(12±2) h 在λmax=330 nm 處測定一次各溶液的吸光度.

1.2.7 理論計算 本研究采用分子對接程序模擬了TAN 與β-CD、HP-β-CD 和TM-β-CD 的包合模式.使用Gaussian View 構(gòu)建TAN 的結(jié)構(gòu)，并運用B3LYP/6-31G(d)對TAN 的結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化.β-CD 的結(jié)構(gòu)來源于劍橋晶體數(shù)據(jù)庫，HP-β-CD 及TM-β-CD 的結(jié)構(gòu)通過修飾β-CD 得到，3 種環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)由PM3 半經(jīng)驗法進行優(yōu)化.將TAN 分別對接到3 種環(huán)糊精的空腔中，選擇半柔性對接法，設(shè)置CDs 為剛性受體，TAN 為配體，并允許TAN 分子柔性扭轉(zhuǎn).然后使用遺傳算法，執(zhí)行100 次構(gòu)象搜索.最后通過聚類分析得到一系列TAN 與3 種環(huán)糊精的包合模式.分子對接及計算采用AutoDock 4 (AutoDock4.2.3)程序[15]完成.

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外?可見吸收光譜(UV-Vis)測定按照1.2.3的方法分別測定TAN 與β-CD、HP-β-CD 及TM-β-CD 在pH=3.0 和pH=10.5 的緩沖溶液中的紫外?可見吸收光譜(見電子版支撐材料圖S1)，并記錄各溶液在λmax=330 nm 處的吸光度.通過非線性最小二乘法[16]對pH=3.0 和pH=10.5 條件下TAN與β-CD、HP-β-CD、TM-β-CD 的紫外光譜進行擬合，可得3 種包合物的穩(wěn)定常數(shù)、Gibbs 自由能變化如表1 所示.由表1 可知3 種包合物在pH=3.0條件下的穩(wěn)定常數(shù)均大于pH=10.5 條件下的穩(wěn)定常數(shù)，這表明TAN 與β-CD 及其衍生物在pH=3.0條件下更易形成配合物，且形成的配合物更穩(wěn)定.由圖S1 中的插圖可知，TAN 與β-CD、HP-β-CD 及TM-β-CD 的實驗值與理論值之間存在良好的線性關(guān)系，證明假設(shè)是成立的，因此TAN 與β-CD、HPβ-CD 及TM-β-CD 都以1∶1(摩爾比)形成配合物.

表1 桔皮素與環(huán)糊精形成包合物時的熱力學(xué)參數(shù)Tab.1 Thermodynamic parameters when tangeretin and cyclodextrins form inclusion complexes

2.2 Job 曲線按照1.2.4 節(jié)的方法測定TAN 與CDs 的紫外?可見光譜.以TAN 的摩爾分?jǐn)?shù)（xGuest）為橫坐標(biāo)，0.015 mmol/L TAN 溶液的吸光度和0.015 mmol/L TAN 與不同濃度CDs 的混合液的吸光度之差（ΔA）乘以TAN 的摩爾分?jǐn)?shù)（xGuest）為縱坐標(biāo)，繪制Job 曲線.如圖2 所示，曲線的最高點對應(yīng)的橫坐標(biāo)值均為0.5，可以判斷出TAN 與CDs的包合比均為1∶1.該結(jié)論與紫外?可見光譜的結(jié)論相互驗證.

圖2 桔皮素與β-環(huán)糊精(a)、2-羥丙基-β-環(huán)糊精(b)、1,3,6-三甲基-β-環(huán)糊精(c)在pH=3.0 時的Job曲線Fig.2 Job plots for tangeretin with β-cyclodextrin(a),2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin(b),2,3,6-trimethyl-β-cyclodextrin(c) at pH=3.0

2.3 粉末衍射分析TAN、CD、TAN 與CDs 物理混合物以及TAN/CDs 包合物的XRD 圖如圖3 所示，TAN、β-CD 及TAN 與β-CD 物理混合物均為晶型結(jié)構(gòu)，HP-β-CD 及TM-β-CD 為非晶形結(jié)構(gòu).TAN 在12.48°、14.79°及19.36°～25.5°、28.42°～29.77°范圍內(nèi)均出現(xiàn)了尖銳的特征峰.β-CD、HP-β-CD 及TM-β-CD 的特征峰主要出現(xiàn)在15.49°、7.58°～37.72°及7.13°～38.58°.TAN 與CDs 的物理混合物均出現(xiàn)TAN 及CDs 的峰.此外，TAN/β-CD 包合物在12.54°處出現(xiàn)了TAN 的特征峰，在12.99°～37.87°范圍內(nèi)出現(xiàn)了一個較寬的新特征峰；TAN/HP-β-CD 包合物在6.86°～38.17°范圍內(nèi)顯示出2 個較寬的特征峰；TAN/TM-β-CD 包合物出現(xiàn)了TAN 與TM-β-CD 的特征峰，但峰的位置發(fā)生了藍(lán)移，且強度大大降低.綜上所述，3 種包合物的XRD 圖均與TAN 和CDs 存在差別，且不是簡單的物理堆積，證明3 種包合物制備成功.

圖3 桔皮素(a)、環(huán)糊精(b)、桔皮素與環(huán)糊精物理混合物(c)桔皮素/環(huán)糊精包合物(d)的XRD 圖Fig.3 XRD patterns of tangeretin (a);CDs (b);physical mixture of tangeretin and CDs (c);tangeretin/CDs inclusion complexes (d)(A: β-cyclodextrin,B: 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin,C: 2,3,6-trimethyl-β-cyclodextrin)

2.4 紅外分析TAN、CDs、物理混合物(TANCDs)及TAN/CDs 包合物的FT-IR 圖見電子版支撐材料圖S2.如圖S2A 所示，TAN/β-CD 包合物的紅外吸收光譜由于受到TAN 在1 511 cm?1處的不飽和碳上的C—H 伸縮振動峰(苯環(huán)及C＝ C)的影響，導(dǎo)致β-CD 在1 598 cm?1處的吸收峰紅移至1 673 cm?1及1 633 cm?1處，且TAN/β-CD 包合物在1 368 cm?1處出現(xiàn)了TAN 在1 362 cm?1處CH3上的C—H 伸縮振動峰.由圖S2B 可知，TAN 與HP-β-CD 形成包合物后，使得HP-β-CD 在1 599 cm?1處的吸收峰紅移至1 633 cm?1處且峰的強度顯著增強，并且TAN/β-CD 包合物的紅外吸收光譜出現(xiàn)了TAN 在2 844 cm?1處CH3上的C—H 不對稱伸縮振動峰及1 362 cm?1處CH3上的C—H 對稱伸縮振動峰.由圖S2C 可知，TAN 與TM-β-CD 結(jié)合后，TM-β-CD 在1 610 cm?1處的吸收峰強度顯著增強，且在1 073 cm?1處出現(xiàn)了TAN 結(jié)構(gòu)中苯環(huán)上的—C—O—C—的伸縮振動峰.此外，3 種包合物的紅外吸收峰與各自的物理混合物的紅外吸收峰都存在峰位置以及峰強度的差異.綜上所述，3 種包合物均制備成功，且不是以簡單的物理混合方式進行包合.

2.5 電鏡分析TAN、CDs、物理混合物(TANCDs)及TAN/CDs 包合物的SEM 圖見電子版支撐材料圖S3.由圖S3 可知，TAN 為類似長方體的晶型結(jié)構(gòu)，β-CD、HP-β-CD 及TM-β-CD 分別呈塊狀、中空且表面帶孔的球狀結(jié)構(gòu)及表面有孔隙的無定型結(jié)構(gòu)，TAN 與CDs 的物理混合物則為二者結(jié)構(gòu)的簡單堆積，而TAN/β-CD、TAN/HP-β-CD 及TAN/TM-β-CD 包合物的結(jié)構(gòu)分別呈由小碎塊組成的無定型結(jié)構(gòu)、表面平整的塊狀結(jié)構(gòu)以及不規(guī)則的塊狀結(jié)構(gòu).綜上所述，包合物的結(jié)構(gòu)與TAN、CDs 及物理混合物的結(jié)構(gòu)存在明顯的差異，表明TAN 與CDs 成功地形成了包合物.

2.6 核磁共振分析測定了CDs 及TAN/CDs 包合物在D2O 中的1H NMR（見電子版支撐材料圖S4）和2D NMR 譜圖(見電子版支撐材料圖S5).從圖S4 可觀察到，TAN/CDs 包合物在δ7.38～7.53 范圍內(nèi)出現(xiàn)了TAN 的H3、H3'及H5'的峰，表明TAN/CDs 包合物制備成功.

表S2(見電子版支撐材料)為CDs 與TAN 包合前后的化學(xué)位移.由表S2 可知，β-CD、HP-β-CD以及TM-β-CD 包合TAN 后，所有質(zhì)子的化學(xué)位移均發(fā)生了變化，其中β-CD、HP-β-CD 及TM-β-CD H3 的化學(xué)位移分別移動了：0.02，0.06，0.05；H5 的化學(xué)位移分別移動了：0.01，0.03，0.04.3 種包合物中環(huán)糊精H3 的化學(xué)變化均大于H5 的化學(xué)位移變化，而H3 位于CDs 的大口端，H5 位于CDs 的小口端，因此可推斷出TAN 均從CDs 的大口端進入空腔.

為了推斷TAN 與β-CD、HP-β-CD 及TM-β-CD的結(jié)合模式，測定了3 種包合物的ROESY 譜(電子版支撐材料圖S5).圖S5 顯示，TAN 的H3 與β-CD 的H3 相關(guān)，H3'、H5'和H3 與β-CD 的H5 相關(guān)；TAN 的H3'、H5'與HP-β-CD 的H3 相關(guān)，H3 與HPβ-CD 的H3 相關(guān)；TAN 的H3'、H5'和H3 與TM-β-CD 的H5 相關(guān).可推斷出，TAN 的A 環(huán)均從CDs的大口端進入空腔，并且整個藥物分子貫穿在CDs 空腔中，其可能的絡(luò)合模式如圖S6(電子版支撐材料)所示.

2.7 水溶性分析通過1.2.5 中的方法，將所測吸光度帶入TAN 的線性方程(A=28.364 1c?0.046 4),計算得到TAN、TAN/β-CD、TAN/HP-β-CD 及TAN/TM-β-CD 的溶解度分別為0.108、0.156、0.219 mg/mL及0.517 mg/mL(具體數(shù)據(jù)見表S3)，表明TAN 經(jīng)CDs 包合之后溶解度得到改善.

2.8 穩(wěn)定性分析電子版支撐材料中圖S7 為TAN 及TAN/CDs(β-CD、HP-β-CD 及TM-β-CD)包合物在模擬人體胃液(pH=1.5)和模擬人體腸液(pH=7.6)中的穩(wěn)定性測定結(jié)果.由圖S7A 可明顯觀察到，在pH=1.5 的環(huán)境中，TAN 在0～24 h 內(nèi)的相對吸光度值急劇下降，24～48 h 緩慢升高，48 h后又開始下降，60～72 h 內(nèi)下降更為明顯，直到72 h 時共下降了18.11%，而TAN/CDs 包合物的相對吸光度值波動趨勢均比TAN 緩慢，TAN/β-CD、TAN/HP-β-CD 及TAN/TM-β-CD 包合物最終分別變化了7.66%、1%以及2.93%.由圖S7B 可知，在pH=7.6 的環(huán)境中，TAN 在0～72 h 內(nèi)相對吸光度值一直呈下降趨勢，到72 h 時共下降了14.33%，而TAN/CDs 包合物的相對吸光度值呈緩慢下降的趨勢，TAN/β-CD、TAN/HP-β-CD 及TAN/TM-β-CD包合物最終分別下降了3.09%、5.14%以及6.34%.綜上所述，TAN 經(jīng)CDs 包合之后穩(wěn)定性均得到了顯著提高，且包合物在酸性環(huán)境中更穩(wěn)定.

2.9 分子對接分析程序?qū)⒕礁钕嘟臉?gòu)象進行聚類分析，通過對接結(jié)果圖4 可以發(fā)現(xiàn)：TAN 貫穿在3 種環(huán)糊精的空腔中，說明TAN 與CDs 成功形成了主客體包合物.對3 種包合物的最優(yōu)構(gòu)象進行分析可得：TAN 均以A 環(huán)從CDs 的大口端進入空腔中，均能與核磁共振結(jié)果相對應(yīng).此外，TAN 與CDs 之間形成了氫鍵：TAN7 號位的羥基與β-CD2 號位上的氧形成了一條2.855 nm 的氫鍵，與HP-β-CD2 號位上的氧形成了一條2.957 nm的氫鍵，以及與TM-β-CD2 號位上的氧形成了一條2.027 nm 的氫鍵，表明TAN 與CDs 之間通過氫鍵作用和疏水作用形成包合物.

圖4 桔皮素與環(huán)糊精分子對接最穩(wěn)定的包合模式Fig.4 The most stable inclusion mode of docking between TAN and cyclodextrins molecules (β-cyclodextrin(a);2-hydroxypropyl-βcyclodextrin(b);2,3,6-trimethyl-β-cyclodextrin(c))

3 結(jié)語

本文采用飽和溶液法成功制備了TAN 與β-CD、HP-β-CD 和TM-β-CD 的包合物，通過Job 曲線推斷出了TAN 與CDs 的主?客體包合比為1∶1.利用非線性最小二乘法對紫外?可見滴定數(shù)據(jù)擬合后，發(fā)現(xiàn)TAN 于CDs 在pH=3.0 的溶液中的穩(wěn)定常數(shù)比pH=10.5 溶液中的穩(wěn)定常數(shù)大，說明TAN 與3 種環(huán)糊精在pH=3.0 的條件下更易形成包合物.此外，還采用了XRD、FT-IR、SEM、和NMR 等手段對包合物進行了表征.實驗結(jié)果表明TAN/CDs 包合物制備成功，而NMR 的測試結(jié)果顯示TAN 以A 環(huán)從CDs 的大口端進入空腔，且整個藥物分子貫穿在環(huán)糊精的空腔中，這與分子對接結(jié)果相吻合.最后，通過飽和溶液法對TAN 包合前后在水中的溶解度進行了考察；還探究了包合物在pH=1.5(模擬人體腸液)和pH=7.6 (模擬人體胃液)環(huán)境中的穩(wěn)定性，結(jié)果表明TAN 經(jīng)CDs 包合后溶解度和穩(wěn)定均得到改善，這為制備TAN 的藥物制劑提供了理論基礎(chǔ).