李 琳，丁 順，徐正揚(yáng)，嚴(yán)旌仁，張啟萌，牟忠林

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科頭頸外科，海南 ?？?570102）

變應(yīng)性鼻炎（allergy rhinitis，AR）是耳鼻咽喉科最常見(jiàn)的疾病之一，是一種鼻黏膜癥狀性、炎癥性與免疫性疾?。?］。變應(yīng)性鼻炎可降低患者生活質(zhì)量并導(dǎo)致其他疾病產(chǎn)生，如哮喘、阻塞性睡眠呼吸暫停等［2］，約80%的變應(yīng)性鼻炎的患者臨床癥狀在20 歲之前出現(xiàn)并在20～40 歲達(dá)到高峰，然后逐漸下降［3］。AR 屬于一種多因素的疾病，它的致病機(jī)理復(fù)雜，牽扯了多種炎性細(xì)胞和炎性介質(zhì)［4］。目前AR的治療選擇包括患者教育、避免接觸過(guò)敏原、藥物療法、免疫療法、中醫(yī)針灸、中醫(yī)方劑和手術(shù)等［5］。西醫(yī)藥物治療是目前AR 最主要的治療方式，但這些藥物往往容易引起如疲勞、激素抵抗和鎮(zhèn)靜等副作用［6］。因此目前需要一種有效且安全的藥物來(lái)防治AR［7］。自古以來(lái)，附子是臨床治療AR 的代表中藥，附子具有平喘、提高免疫功能、抗氧化、散寒止痛、抗寒抑菌的作用［8，9］。但是目前附子對(duì)AR 治療的具體作用機(jī)制仍有待確定。傳統(tǒng)基于單一組分的機(jī)制研究無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥藥效的全面、系統(tǒng)的理解，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性、系統(tǒng)性的特征已被廣泛運(yùn)用于中醫(yī)藥的研究，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理研究附子治療AR 的機(jī)制是可行的。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法獲得附子治療AR的主要活性化合物成分及作用靶點(diǎn)基因，通過(guò)富集分析篩選出附子治療AR 潛在的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。在此基礎(chǔ)上，建立AR 小鼠模型，觀察附子對(duì)AR 的治療作用。為進(jìn)一步研究附子治療AR 的藥理機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件分析

通過(guò)中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)以生物活性成分為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥20%和（drug-likeness，DL）≥0.1 作為篩選條件，找到附子相關(guān)的活性化合物成分［10］。藥代動(dòng)力學(xué)（absorption，distribution，metabolism，and eexcretion，ADME）是篩選附子生物活性化合物成分重要的限制因素，是指藥物化合物的吸收、分布、代謝和排泄。在藥代動(dòng)力學(xué)中，口服生物利用度OB 和DL 是最重要的藥代動(dòng)力學(xué)特性。OB 是指口服藥物從胃腸道吸收進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的速率和程度［11］。DL 是藥物設(shè)定的定性概念，可作為中草藥“類藥物”成分選用的依據(jù)。

1.2 附子的作用靶點(diǎn)基因篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出的附子活性化合物，通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)［12］，設(shè)置篩選物種類別，將靶蛋白名稱轉(zhuǎn)為“gene symbol”表示，得到附子主要活性化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因，然后利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化命名［13］，在去除重復(fù)基因后獲得附子活性化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因。

1.3 AR 的靶點(diǎn)基因篩選

GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)是一個(gè)人類基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)［14］，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中，通過(guò)使用“allergic rhinitis”這個(gè)詞來(lái)搜索找到與AR 相關(guān)的靶點(diǎn)基因。

1.4 附子和AR 重疊靶點(diǎn)基因的獲得

通過(guò)在線工具Venny2.1 篩選出附子與AR 的重疊基因［15］，韋恩圖是一種常用的統(tǒng)計(jì)學(xué)圖表，它主要用于顯示元素集合重疊區(qū)域的圖示。附子治療AR 的靶點(diǎn)基因即是這些被篩選出來(lái)的重疊基因通過(guò)使用韋恩圖顯示。

1.5 “化合物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出附子治療AR 的靶點(diǎn)基因，使用Cytoscape 軟件構(gòu)建化合物-基因-疾?。╟ompound-gene-disease，C-G-D）網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化，利用網(wǎng)絡(luò)分析工具得出每個(gè)節(jié)點(diǎn)的連接度，表示于該節(jié)點(diǎn)直接連接的節(jié)點(diǎn)數(shù)目，連接度越大說(shuō)明改節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的作用越重要［16］。

1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

附子和AR 的重疊基因通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白質(zhì)互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)研究，在0.4 的置信水平下構(gòu)建了PPI 網(wǎng)絡(luò)圖［17］。將基于數(shù)據(jù)庫(kù)信息生成的PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，再使用 Cytoscape 中CytoHubba 插件依據(jù)MCC 算法篩選出最核心的前十位基因，這些基因是附子治療AR 的前10 個(gè)重要樞紐基因［18］。

1.7 富集分析

通過(guò)GO 功能數(shù)據(jù)庫(kù)可以幫助我們更好地理解基因功能，如細(xì)胞成分（cellular components，CC）、生物過(guò)程（biological processes，BP）和分子功能（molecular functions，MF）［19］。KEGG 功能數(shù)據(jù)庫(kù)是可以從中獲得基因及基因組信息的數(shù)據(jù)庫(kù)［20］。DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)是一款在線分析軟件，為了探索靶點(diǎn)蛋白的基因功能以及信號(hào)通路方面的具體作用，使用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)中的功能注釋工具對(duì)附子中的活性化合物成分與AR 交互靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 信號(hào)通路富集分析［21，22］，選取GO 功能富集分析中關(guān)于細(xì)胞成分、生物過(guò)程和分子功能的前十個(gè)關(guān)鍵詞，通過(guò)條形圖將結(jié)果可視化。選取KEGG 前20 個(gè)關(guān)鍵通路，設(shè)置P＜0.05，通過(guò)分析圖將結(jié)果可視化。

1.8 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.8.1 實(shí)驗(yàn)材料和方法 （1）實(shí)驗(yàn)藥物：100 g 附子購(gòu)自?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院，加入10 倍量去離子水浸泡10 min，武火煮沸，文火煎煮2 h，過(guò)濾得一煎液；二煎加入8 倍量去離子水，武火煮沸，文火煎煮1.5 h，過(guò)濾得二煎液，兩次煎煮液合并濃縮至生藥量為1.52 g/mL 的濃縮液，放置在-80 ℃的冰箱中保存。（2）實(shí)驗(yàn)試劑：IL-6 和TNF-α 抗體購(gòu)置于愛(ài)必信（上海）生物科技有限公司。

1.8.2 動(dòng)物模型構(gòu)建 選取購(gòu)自于西安新區(qū)楓東新城實(shí)驗(yàn)動(dòng)物園的4～6 周齡雌性小鼠，體重約在（20±2）g。小鼠被飼養(yǎng)在SPF 級(jí)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中：溫度（22±2）℃、濕度（60±5）%、12 h 光/暗循環(huán)環(huán)境，所有實(shí)驗(yàn)均按照中國(guó)國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南進(jìn)行。該研究獲得了海南醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（動(dòng)物倫理編號(hào)：HYLL-2021-382）。

經(jīng)過(guò)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，將30 只雌性小鼠隨機(jī)平均分為正常對(duì)照組（normal control group，NC group）、變應(yīng)性鼻炎組（allergic rhinitis group，AR group）和附子組（radix aconiti lateralis preparata group，F(xiàn)uzi group）。根據(jù)參考文獻(xiàn)，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)恼{(diào)整創(chuàng)建了以下的AR 的小鼠模型［23］。在前14 d 中，附子組和變應(yīng)性鼻炎組小鼠給予腹腔注射致敏液致敏，致敏液的成分是卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）40 μg 和Al（OH）31.5 mg 溶于生理鹽水，配成共0.2 mL 的致敏液，每2 天1 次，從第15 天到第21天，按每只40 μL 5%的OVA 滴鼻液滴入小鼠雙側(cè)鼻腔激發(fā)，每天1 次。第22 天到30 天，附子組小鼠按給藥劑量為1.56 g/kg 進(jìn)行灌胃，每天1 次，同時(shí)為維持鼻部刺激，變應(yīng)性小鼠組和附子組每隔1 天用OVA 滴鼻液激發(fā)，正常組小鼠用同體積的生理鹽水替代，第31 天，處死所有小鼠。

1.8.3 HE 染色 取各組小鼠的完整鼻腔黏膜，用4%的多聚甲醛水浸泡24 h，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片等處理后，用蘇木精和伊紅法對(duì)石蠟包埋的鼻黏膜組織進(jìn)行染色，用光學(xué)顯微鏡來(lái)評(píng)估和記錄組織病理學(xué)變化。

1.8.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè) 從各組鼻黏膜組織中分離出蛋白，用于鑒定IL-6 和TNF-α 的表達(dá)。將提取的蛋白加入BSA 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定溶液中進(jìn)行蛋白濃度的鑒定，用SDS-PAGE 凝膠電泳對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)隨后被轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)膜濾紙上，然后用5%的脫脂牛奶孵化2 h 后加入一抗并在4 ℃冰箱下孵育過(guò)夜。之后用TBST 洗膜，加入二抗溶液在室溫下孵育2 h。最后通過(guò)顯影儀器顯影并測(cè)量目標(biāo)帶/相應(yīng)的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8.5 免疫組化法檢測(cè) 將脫蠟的石蠟切片用二甲苯和酒精中按梯度脫水。通過(guò)在90 ℃的緩沖液中浸泡6 min 使抗原愈合，然后用3%的H2O2孵化10 min 以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶。然后滴加BSA以封閉組蛋白，在4 ℃下加入TNF-α 和IL-6 的一級(jí)抗體，之后滴加二抗孵育20 min，再加入辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育15 min，加入顯色液和蘇木素溶液。進(jìn)行封片后使用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用描述性統(tǒng)計(jì)分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，兩組間采用t檢驗(yàn)分析，多組間采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad Prism 8 進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 附子作用靶點(diǎn)基因的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中，將OB 和DL 作為靶點(diǎn)基因的篩選條件，找到附子的21 個(gè)活性化合物成分。關(guān)于附子的21 種生物活性化合物成分的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。然后通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)，在剔除64 個(gè)重復(fù)基因后共得到附子的203 個(gè)作用靶點(diǎn)基因。

表1 附子21 種活性化合物的詳細(xì)信息Tab 1 Information on 21 Fuzi compounds in detail

表2 各組小鼠鼻黏膜組織IL-6 蛋白的表達(dá)灰度值統(tǒng)計(jì)表（n=10，±s）Tab 2 Statistical table of grayscale values of IL-6 protein expression in nasal mucosal tissue of mice in each group （n=10，±s）

表2 各組小鼠鼻黏膜組織IL-6 蛋白的表達(dá)灰度值統(tǒng)計(jì)表（n=10，±s）Tab 2 Statistical table of grayscale values of IL-6 protein expression in nasal mucosal tissue of mice in each group （n=10，±s）

組別正常對(duì)照組變應(yīng)性鼻炎組附子組灰度值0.7502±0.0596 1.3355±0.0914 0.8415±0.0247 FP 71.312＜0.001

表3 各組小鼠鼻黏膜組織TNF-α 蛋白的表達(dá)灰度值統(tǒng)計(jì)表（n=10，±s）Tab 3 Statistical table of grayscale values of TNF-α protein expression in nasal mucosal tissue of mice in each group （n=10，±s）

表3 各組小鼠鼻黏膜組織TNF-α 蛋白的表達(dá)灰度值統(tǒng)計(jì)表（n=10，±s）Tab 3 Statistical table of grayscale values of TNF-α protein expression in nasal mucosal tissue of mice in each group （n=10，±s）

組別正常對(duì)照組變應(yīng)性鼻炎組附子組灰度值0.2719±0.0251 0.8658±0.0292 0.5311±0.0369 FP 280.532＜0.001

2.2 AR 靶點(diǎn)基因及重疊靶點(diǎn)基因的篩選

通過(guò)GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)，在去除重復(fù)基因后篩選出AR 相關(guān)的靶點(diǎn)基因1 832 個(gè)，然后使用Venny 2.1 軟件建立附子的203 個(gè)靶點(diǎn)基因和AR 的1 832個(gè)靶點(diǎn)基因的連接，共篩選出68 個(gè)重疊基因，AR 和附子重疊靶點(diǎn)基因的韋恩圖見(jiàn)圖1，這是附子治療AR 的作用靶點(diǎn)基因。

圖1 AR 和附子重疊靶點(diǎn)基因的韋恩圖Fig 1 Allergic Rhinitis and Fuzi targets depicted in a Venny diagram

2.3 “化合物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

化合物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖是研究中藥治療疾病基本過(guò)程的有價(jià)值的工具。利用Cytoscape 軟件構(gòu)建AR 和附子的“化合物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖如圖2 所示，中間紅色多邊形節(jié)點(diǎn)表示疾病，淺綠色長(zhǎng)方形節(jié)點(diǎn)表示附子主要活性化合物包括去氧穿心蓮內(nèi)酯（deoxyandrographolide）、谷甾醇（sitosterol）、水黃皮素（karanjin）和次烏頭堿（hypaconitine）等，深綠色長(zhǎng)方形節(jié)點(diǎn)表示附子和AR 的重疊基因，如PTGS2、TNF、ALB、CXCL8、IL6、VEGFA、JUN等。每種活性成化合物連接多個(gè)靶點(diǎn)，多個(gè)靶點(diǎn)也連接多種成分，通過(guò)該網(wǎng)絡(luò)圖可以表明附子能通過(guò)其中的多種化合物成分作用于多個(gè)靶點(diǎn)，從而對(duì)AR 起治療作用。

圖2 “化合物-基因-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 "Compound-Gene-Disease" network diagram

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

使用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)建立一個(gè)附子和AR 重疊基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖3，該網(wǎng)絡(luò)包括68 個(gè)節(jié)點(diǎn)和860 個(gè)連接，然后利用CytoHubba 插件中MCC 算法方法篩選出附子治療AR 的前10 個(gè)重疊樞紐基因主要為PTGS2、TNF、IL6、AKT1、AL8、STAT3、CCL2、CXCL8、VEGFA、JUN，并構(gòu)建前10 位重疊樞紐基因網(wǎng)絡(luò)圖見(jiàn)圖4，這些基因是附子治療AR 的關(guān)鍵基因。

圖3 重疊基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 PPI network diagram of overlapping genes

圖4 MCC 算法分析附子治療AR 的前10 位樞紐重疊基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 The top 10 hub gene network of Fuzi therapy in response to Allergic Rhinitis were analyzed using MCC

2.5 GO 功能富集分析

將68 個(gè)重疊靶點(diǎn)基因輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO 功能富集分析，從而可以說(shuō)明附子治療AR 存在多種潛在靶點(diǎn)的生物學(xué)功能。GO 功能富集分析圖見(jiàn)圖5 所示，在GO 功能富集分析中，其中GO 功能富集在BP 方面，選取排位前10 位相關(guān)條目，主要涉及轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、一氧化氮生物合成過(guò)程正調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖、腫瘤壞死因子產(chǎn)生的正調(diào)控等。在CC 中，選取排位前10 位相關(guān)條目，主要是細(xì)胞表面、質(zhì)膜、蛋白復(fù)合物和頂端質(zhì)膜參與主要的細(xì)胞成分。在MF 中，選取排位前10 位相關(guān)條目，主要包括與轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的DNA 結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、核心啟動(dòng)子近端區(qū)的序列特異性的DNA 結(jié)合、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合等。

圖5 GO 功能富集分析圖Fig 5 Evaluation of targets based on the GO

2.6 KEGG 功能富集分析

為了探索附子的活性化合物成分通過(guò)靶點(diǎn)基因治療AR 的作用途徑，將附子治療AR 的共同靶點(diǎn)主要富集在20 條通路上（P＜0.05），進(jìn)一步構(gòu)建KEGG 功能富集分析圖，見(jiàn)圖6 所示，包括TNF 信號(hào)通路、T 細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等信號(hào)通路。選取Toll 樣受體信號(hào)通路圖進(jìn)行展示，見(jiàn)圖7，其中綠色代表共同基因，結(jié)合PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中核心靶點(diǎn)基因包含了Toll 樣受體信號(hào)通絡(luò)中IL-6 和TNF-α 樞紐基因，因此選擇該通路進(jìn)行后續(xù)研究。

圖6 KEGG 功能富集分析圖Fig 6 KEGG functional enrichment analysis diagram

圖7 Toll 樣受體信號(hào)通路圖Fig 7 Toll-like receptor signaling pathway

2.7 附子對(duì)AR 小鼠鼻黏膜組織病理變化的影響

采用HE 染色法來(lái)觀察各組小鼠鼻黏膜組織組織學(xué)變化結(jié)果見(jiàn)圖8。正常小鼠組細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。與正常組小鼠相比，變應(yīng)性鼻炎組的鼻黏膜組織表現(xiàn)出不同程度的黏膜完整性的破壞和塌陷，纖維組織增生和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的特征。對(duì)比變應(yīng)性鼻炎組，附子組小鼠明顯減少了上述的病理改變。

圖8 HE 染色法觀察各組小鼠鼻黏膜組織學(xué)變化（×40）Fig 8 Histological changes of tissues in different experimental mice groups as determined by HE staining（×40）

2.8 蛋白免疫印跡法檢測(cè)IL-6 和TNF-a 的蛋白表達(dá)水平

通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組小鼠鼻黏膜中IL-6 和TNF-α 的表達(dá)灰度值統(tǒng)計(jì)表分別見(jiàn)表2-3。各組小鼠鼻黏膜IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平的WB 檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖9。結(jié)果顯示變應(yīng)性鼻炎組小鼠鼻黏膜的IL-6 和TNF-α 蛋白的表達(dá)和正常對(duì)照組小鼠相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。變應(yīng)性鼻炎組小鼠鼻黏膜的IL-6 和TNF-α 蛋白表達(dá)量高于附子組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 2；P＜0.000 1）。附子組小鼠鼻黏膜中的IL-6 表達(dá)與正常對(duì)照組相比，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.269 7）；附子組小鼠鼻黏膜中TNF-α 的表達(dá)與正常對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.000 1）。以上結(jié)果表明，IL-6 和TNF-α 在小鼠鼻黏膜組織中存在并表達(dá)，附子可以通過(guò)調(diào)節(jié)IL-6 和TNF-α 的表達(dá)來(lái)減少炎癥反應(yīng)，這反過(guò)來(lái)又證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的結(jié)果。

圖9 各組小鼠鼻黏膜IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平的WB 檢測(cè)結(jié)果Fig 9 WB results of IL-6 and TNF-α expression levels in the nasal mucosa of mice in each group

2.9 免疫組化法檢測(cè)IL-6 和TNF-a 的蛋白表達(dá)水平

為了證實(shí)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)的有效性，對(duì)各小組小鼠鼻黏膜進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，各組小鼠鼻黏膜組織IL-6 的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)表分別見(jiàn)表4、5。各組小鼠鼻黏膜IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平的免疫組化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖10。IL-6 和TNF-α 蛋白陽(yáng)性顆粒大部分存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中，呈棕褐色或棕黃色。正常組小鼠鼻黏膜上皮未受損，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而變應(yīng)性鼻炎組小鼠腺體和黏膜上皮染色較深，鼻黏膜上皮受損，附子組小鼠鼻黏膜損傷明顯較輕，腺體增生程度較少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)量較少。結(jié)果顯示變應(yīng)性鼻炎組小鼠鼻黏膜IL-6 和TNF-α 陽(yáng)性表達(dá)高于正常對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001；P＜0.001）。附子組小鼠鼻黏膜IL-6 和TNF-α 陽(yáng)性表達(dá)高于正常對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05；P＜0.05）。附子組IL-6 和TNF-α 表達(dá)低于變應(yīng)性鼻炎組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001；P＜0.05）。結(jié)果表明，附子改善小鼠鼻黏膜的炎癥反應(yīng)。

圖10 各組小鼠鼻黏膜IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平的免疫組化檢測(cè)結(jié)果Fig 10 Immunohistochemical detection of IL-6 and TNF-α expression levels in the nasal mucosa of mice in various groups

表5 各組小鼠鼻黏膜組織TNF-α 的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)表（n=10，±s）Tab 4 Statistical table of the expression level of TNF-α in the nasal mucosa tissue of mice in each group（n=10，±s）

表5 各組小鼠鼻黏膜組織TNF-α 的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)表（n=10，±s）Tab 4 Statistical table of the expression level of TNF-α in the nasal mucosa tissue of mice in each group（n=10，±s）

組別正常對(duì)照組變應(yīng)性鼻炎組附子組TNF-α 0.24±0.08 0.59±0.08 0.32±0.10 FP 43.732＜0.001

表4 各組小鼠鼻黏膜組織IL-6的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)表（n=10，±s）Tab 4 Statistical table of the expression level of IL-6 in the nasal mucosa tissue of mice in each group （n=10，±s）

表4 各組小鼠鼻黏膜組織IL-6的表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)表（n=10，±s）Tab 4 Statistical table of the expression level of IL-6 in the nasal mucosa tissue of mice in each group （n=10，±s）

組別正常對(duì)照組變應(yīng)性鼻炎組附子組IL-6 0.20±0.05 0.53±0.12 0.28±0.17 FP 41.683＜0.001

3 討論

AR 主要是由特應(yīng)性個(gè)體接觸過(guò)敏原后由IgE介導(dǎo)的炎癥性鼻?。?4］。在特應(yīng)性個(gè)體中，暴露于室內(nèi)和室外過(guò)敏原（包括花粉、霉菌、塵螨和動(dòng)物皮屑）可能會(huì)促進(jìn)抗原特異性IgE 的產(chǎn)生。過(guò)敏原的重新引入會(huì)觸發(fā)早期和晚期反應(yīng)，導(dǎo)致AR 的臨床表現(xiàn)［25］。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)和多作用途徑的特性，并且中醫(yī)治療具有高治愈率和成本低等特點(diǎn)［26］，因此越來(lái)越多的人選擇使用中醫(yī)藥療法治療AR［27］。從中醫(yī)角度來(lái)看，中醫(yī)認(rèn)為鼻子可以反映肺的生理和病理表現(xiàn)。由于外邪（中醫(yī)認(rèn)為是致病因素）經(jīng)口、鼻侵入人體，侵入鼻腔，損害肺的宣降功能，導(dǎo)致津液失調(diào)，導(dǎo)致體液變成痰和黏液。這最終導(dǎo)致AR 的形成［28］。AR 多源于正氣不足，在治療上，一直以益氣溫陽(yáng)為主要原則，附子自古是臨床治療虛弱冷綜合征AR 的典型中藥［29，30］，附子辛熱溫里，助少陰陽(yáng)氣［31］，具有提高免疫力和抗炎抗氧化等功能［32］。另一方面，附子治療AR 的作用機(jī)制尚不清楚，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以研究草藥或草藥處方的成分、目標(biāo)、途徑和作用模式的復(fù)雜性［33］，更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)附子治療AR 的靶點(diǎn)基因和主要作用信號(hào)通路。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來(lái)闡明附子在AR 治療中的潛在生理過(guò)程。以O(shè)B≥20%和DL≥0.1 的篩選條件下，共篩選出附子的21 種生物活性化合物成分和203 個(gè)靶點(diǎn)基因，生物活性化合物成分包括去氧穿心蓮內(nèi)酯、水黃皮素和次烏頭堿等，這是附子治療AR 的主要活性化合物。去氧穿心蓮內(nèi)酯含有二萜內(nèi)酯、黃酮和多酚［34］，在許多研究中，它已被證明具有抗炎特性［35］，去氧穿心蓮內(nèi)酯具有二萜內(nèi)酯和五元內(nèi)酯環(huán)的基本結(jié)構(gòu)發(fā)揮抗炎作用［36］。水黃皮素是一種活性呋喃類黃酮，黃酮類化合物是一種抗炎因子。在大鼠模型的研究表明，水黃皮素通過(guò)阻斷H+和K+ATP 酶而具有抗炎的特性［37］。次烏頭堿可以保護(hù)上皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激［38］。在小鼠中，次烏頭堿已被證明具有有效的抗炎作用，能夠抑制環(huán)氧合酶-2、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-1 和前列腺素E2 的產(chǎn)生［39］。

根據(jù)各靶點(diǎn)基因的重要程度，我們選擇了前10個(gè)重要樞紐基因PTGS2、TNF、IL6、AKT1、ALB、STAT3、CCL2、CXCL8、VEGFA、JUN。PTGS2是產(chǎn)生前列腺素家族的關(guān)鍵酶，是非甾體類藥物的作用靶點(diǎn)，目前已知可參與細(xì)胞炎癥、細(xì)胞凋亡等生理活動(dòng)，PTGS2 轉(zhuǎn)錄由多個(gè)與炎癥信號(hào)通路相關(guān)的細(xì)胞因子觸發(fā)，包括核因子B、激活蛋白1 和CCAAT 增強(qiáng)子結(jié)合蛋白［40］。TNF-α 是TNF 家族的成員，可調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡，促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)膜破裂導(dǎo)致炎癥因子的釋放［41］。IL-6 限制了中性粒細(xì)胞的產(chǎn)生，并增加了粒細(xì)胞的死亡。在AR 中，從快速的宿主防御到適應(yīng)性持續(xù)的全身炎癥的變化均與IL-6的促炎作用有關(guān)。AKT1 是P13K 信號(hào)通路的重要組成部分，促進(jìn)鼻黏膜細(xì)胞存活和增殖［42］。CCL2刺激損傷部位的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移和黏附，當(dāng)CCL2 與其受體接觸時(shí)會(huì)觸發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。CXCL8 參與組織愈合和血管過(guò)程，并通過(guò)與白細(xì)胞受體結(jié)合［43］，招募白細(xì)胞到炎癥和損傷部位。VEGFA 是一種內(nèi)皮成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，作為血管生成的調(diào)節(jié)器，可通過(guò)控制內(nèi)皮細(xì)胞的完整性和活性，從而產(chǎn)生最佳的血管形態(tài)和功能，并刺激動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞［44］，VEGFA 在AR 中具有抗凋亡和血管完整性的功能。

通過(guò)KEGG 富集分析，在HIF-1、Toll 樣受體、T 細(xì)胞受體和TNF 信號(hào)通路中發(fā)現(xiàn)了附子治療AR 相關(guān)的樞紐靶點(diǎn)基因。HIF-1 受體信號(hào)通路介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是對(duì)抗缺氧相關(guān)細(xì)胞應(yīng)激的重要組成部分，機(jī)體在抗感染時(shí)，血液循環(huán)減慢，促炎性細(xì)胞因子和抗原消耗更多的氧氣，導(dǎo)致局部缺氧和HIF 的激活。HIF 可以無(wú)限期地存在，并參與核轉(zhuǎn)錄因子的激活代謝反應(yīng)，然后可以激活I(lǐng)L-4 產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)NLRP3 炎性小體的激活，增強(qiáng)IL-1、IL-6 等炎癥細(xì)胞因子的釋放［45］。在AR 小鼠中，由于HIF-1 信號(hào)通路的激活，炎癥細(xì)胞可從鼻黏膜浸潤(rùn)到氣道的細(xì)胞外環(huán)境中［46］。TNF 信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)的重要通路，雖然它可以導(dǎo)致某些被病毒感染細(xì)胞的死亡，但它對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有影響，甚至可以刺激它們的發(fā)育。T 細(xì)胞受體通路是免疫應(yīng)答的重要組成部分，它們結(jié)合外源性肽導(dǎo)致T 細(xì)胞的活化，當(dāng)遞質(zhì)被激活時(shí)，CD4+向T 細(xì)胞發(fā)出信號(hào)［47］，而CD4+細(xì)胞又在AR 的調(diào)控中起著重要作用，因此T 細(xì)胞受體信號(hào)通路在AR 的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Toll 樣受體是Ⅰ型跨膜蛋白天然免疫模式識(shí)別受體，可識(shí)別自然界中的病原體相關(guān)分子模式，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，激活先天免疫反應(yīng)［48］，TLR 信號(hào)通路基因的遺傳變異會(huì)推動(dòng)炎癥和過(guò)敏性疾病的進(jìn)展［49］。從Toll 樣信號(hào)通路圖中顯示：IL-6 和TNF-α 是與Toll 樣受體信號(hào)通路相連的兩個(gè)樞紐基因，IL-6 和TNF-α 是重要的炎癥細(xì)胞因子，經(jīng)常出現(xiàn)在身體炎癥反應(yīng)的各個(gè)部位，它們會(huì)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，并已被證明與AR 相關(guān)［50］。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)及MCC 算法分析附子治療AR 的前10 個(gè)樞紐重疊基因網(wǎng)絡(luò)圖中主要有IL-6 及TNFα?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，在后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，對(duì)主要靶點(diǎn)基因IL-6 和TNF-α 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，附子主要可以通過(guò)抑制小鼠鼻黏膜中Toll 樣信號(hào)通路的活化，降低IL-6 和TNF-α 的表達(dá)活性，從而改善了AR 小鼠的炎癥改變。本研究首次探討了Toll 樣受體信號(hào)通路（IL-6 和TNF-α）在AR 中的功能和作用，為后續(xù)附子治療AR 研究提供扎實(shí)的基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究初步探討了附子治療AR 的主要作用機(jī)制。從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基礎(chǔ)上探索附子治療AR 的可能治療靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為附子精準(zhǔn)治療AR 提供科學(xué)依據(jù)，為附子的傳承和創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

牟忠林：構(gòu)思并設(shè)計(jì)了該研究和實(shí)驗(yàn)；李琳：負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集處理及文章撰寫；丁順、徐正楊、嚴(yán)旌仁、張啟萌：負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)思路及最終文章的修改。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。