侯欣宇,劉竹青,張亞南,戴文濤,武 瑞,韓 嵐,3,彭代銀,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012;2.中藥復(fù)方安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012;3.新安醫(yī)學(xué)教育部重點實驗室,安徽 合肥 230012)

腦卒中發(fā)病的機制是腦血管閉塞阻礙大腦局部血流,致使血流供應(yīng)障礙,腦動脈內(nèi)形成血塊,引起腦組織的缺血、低氧,導(dǎo)致一系列級聯(lián)反應(yīng)以及局部腦組織缺血性損傷或壞死［1］。研究表明,缺血區(qū)血液供應(yīng)的恢復(fù),反而致使缺血區(qū)損傷加重,即腦缺血再灌注損傷,出現(xiàn)腦水腫［2］、神經(jīng)功能缺損［3］、血腦屏障破壞［4］和出血性轉(zhuǎn)化［5］,威脅患者的生命健康。

血腦屏障是由單層的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、圍繞在內(nèi)皮細(xì)胞表面的星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞組成［6］,能夠調(diào)節(jié)循環(huán)血液和腦實質(zhì)之間物質(zhì)的轉(zhuǎn)運,維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。研究［7］表明,腦卒中會致使中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管功能變化,引起血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能損傷,導(dǎo)致血腦屏障破壞,而血腦屏障的破壞進一步導(dǎo)致血管源性腦水腫和出血轉(zhuǎn)化［8-9］,從而加劇腦卒中后腦損傷。腦卒中屬于中醫(yī)“中風(fēng)”“偏枯”或“偏風(fēng)”等范疇,病機屬氣虛血瘀。桃紅四物湯最早見于《醫(yī)宗金鑒》,由桃仁、紅花、川芎、當(dāng)歸、熟地黃、白芍6味中藥組成,為補血調(diào)經(jīng)、活血、祛瘀、生新的經(jīng)典名方。課題組前期研究證實,桃紅四物湯對缺血性腦卒中具有保護作用,可降低腦卒中炎癥反應(yīng),保護正常神經(jīng)功能以及促進血管新生,但桃紅四物湯保護神經(jīng)功能的作用是否與改善血腦屏障通透性以及緊密連接蛋白損傷有關(guān)尚不明確。本研究擬復(fù)制大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,觀察桃紅四物湯對腦缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性的影響,探究其保護神經(jīng)功能作用是否與減少緊密連接蛋白損傷,改善腦組織超微結(jié)構(gòu)有關(guān)。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性健康大鼠80只,體質(zhì)量(260±20)g,購于邳州市東方養(yǎng)殖有限公司,動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(蘇)2016-0010。每籠10只,自由活動,飲食飲水,保持室內(nèi)通風(fēng),室溫(25±1)℃,濕度(50±5)%,適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d。所有動物實驗均經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)(倫理編號:AHUCM-rats-202287)。

1.2 藥材及試劑 桃仁(批號1702181)、紅花(批號17072135)、川芎(批號17010335)、熟地黃(批號1705312)、當(dāng)歸(批號1611085)和白芍(批號17110114)藥材均購于安徽普仁中藥飲片有限公司,其有效成分均符合2020年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。尼莫地平:亞寶藥業(yè)太原制藥有限公司;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)、4%多聚甲醛、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)粉末:碧云天生物技術(shù)有限公司;occludin(批號ab224526)、胞質(zhì)附著蛋白(zona occludens, ZO)-1;(批號ab221547)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein 9, MMP-9;批號ab76003):英國Abcam生物技術(shù)有限公司;Triton X-100:上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵:鄭州市儀特儀有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器有限公司;Milli-Q超純水機:上海默克化工技術(shù)有限公司;XB-70制冰機:南京先歐儀器制造有限公司;KD-P組織切片機:金華市科迪儀器設(shè)備有限公司;BHWY-100BC恒溫振蕩培養(yǎng)箱:常州杰博森儀器有限公司;全波長酶標(biāo)儀:美國Thermo公司;低溫冷凍離心機:湖南湘儀實驗儀器開發(fā)有限公司;5417R高速冷凍離心機:德國Eppendorf公司。

2 方法

2.1 桃紅四物湯的制備 將紅花、當(dāng)歸、白芍、川芎、桃仁、熟地黃按照3∶4∶3∶3∶3∶4比例配制。將稱量的各藥材加入10倍容積的75%的無水乙醇中,濃縮后回流2 h,過濾殘余物。將殘余物與8倍容積的無水乙醇回流2 h,2次提取物合并,濃縮后制成1.8 g/mL的提取液,稀釋至0.9 g/mL備用。

2.2 復(fù)制模型 線栓法復(fù)制MCAO模型,將大鼠麻醉后,仰臥固定。在大鼠頸部中間位置切口,分離左頸總、頸內(nèi)和頸外動脈。在頸總和頸外動脈的靠近心臟一端處進行結(jié)扎,使用動脈夾將頸內(nèi)動脈緊閉。從頸總動脈的遠(yuǎn)心端(距頸內(nèi)和頸外動脈分叉處1 cm處)用剪刀剪一小口,插入過蠟后的魚線(直徑為0.25 mm)。經(jīng)頸總動脈插入頸內(nèi)動脈,進入顱內(nèi)。頸總動脈和魚線共同結(jié)扎,縫合皮膚,碘伏無菌操作。注射慶大霉素,大鼠俯臥保持呼吸通暢。2 h后拔出魚線,再灌注24 h。假手術(shù)組大鼠只結(jié)扎頸外動脈與頸內(nèi)動脈。手術(shù)期間注意給大鼠保暖。

2.3 分組及給藥 將大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、桃紅四物湯組和尼莫地平組,每組15只。桃紅四物湯組按照9 g/kg(根據(jù)人和動物間體表面積折算的等效劑量比值計算,大鼠的劑量相當(dāng)于成人臨床劑量的6.3倍)灌胃桃紅四物湯,尼莫地平組按照20 mg/kg灌胃尼莫地平。假手術(shù)組和模型組大鼠均給予等容積蒸餾水,共7 d,每日1次。

2.4 Longa分級評分評估大鼠神經(jīng)功能 評分標(biāo)準(zhǔn):0級,行為無明顯變化;1級,左前肢屈曲,左后肢伸展;2級,有左側(cè)追尾現(xiàn)象;3級,行走困難,搖擺不定;4級,無自發(fā)性活動,有意識障礙。

2.5 行為學(xué)實驗評估大鼠運動功能

2.5.1 平衡木試驗 術(shù)前3 d進行平衡木行走訓(xùn)練,使每只大鼠都能夠順利通過平衡木,限時1 min。評分標(biāo)準(zhǔn):0分,穩(wěn)定平衡姿勢;1分,緊抱平衡木;2分,其中一個肢體從平衡木上掉落;3分,兩個肢體從平衡木上掉落;4分,無試圖平衡卻跌落(>40 s);5分,試圖平衡卻跌落(>20 s);6分,試圖平衡卻跌落(≤20 s)。

2.5.2 轉(zhuǎn)角試驗 將大鼠置于兩塊亞克力板夾角至尾部垂直線的后1/2～2/3處,使大鼠能夠前進,總共進行10次,記錄小鼠左轉(zhuǎn)或者右轉(zhuǎn)次數(shù)。轉(zhuǎn)角指數(shù)=(總轉(zhuǎn)角次數(shù)-向左轉(zhuǎn)角的次數(shù))/總轉(zhuǎn)角次數(shù)×100%。

2.6 TTC染色法觀察腦缺血大鼠腦梗死面積 腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,取出完整腦組織,去除小腦、嗅球等組織,只保留大腦,置-20 ℃冰箱里0.5 h后切片,放入2% TTC溶液,37 ℃下避光孵育約30 min。染色后置于4%多聚甲醛固定,24 h后濾紙吸干表明殘留溶液。采用Image J軟件計算各組大鼠腦梗死面積。

2.7 蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察缺血側(cè)腦部皮質(zhì)的組織形態(tài) 腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后,打開胸腔,生理鹽水進行心臟灌注10 min,用4%多聚甲醛固定液再次灌注15 min,取出完整腦組織,去除小腦、嗅球等組織,只保留大腦,浸泡于4%多聚甲醛固定液中,4 ℃保存。脫水處理后石蠟包埋,切片,染色,封片,顯微鏡下觀察缺血側(cè)腦皮質(zhì)的組織形態(tài)并采集圖像。

2.8 大鼠腦組織含水率檢測 腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后取完整大腦,生理鹽水沖洗,將全腦組織分成左、右兩個半球,濾紙吸干表面的生理鹽水,將缺血側(cè)腦組織放在電子天平上稱質(zhì)量,記錄缺血側(cè)腦組織濕質(zhì)量,放入100 ℃烘烤箱烘干24 h。烘干后再次稱質(zhì)量,記錄缺血側(cè)腦組織干質(zhì)量。腦含水率=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量×100%。

2.9 伊文思藍(lán)(Evans blue, EB)染色法觀察腦缺血大鼠血腦屏障通透性 大鼠尾靜脈注射2%的EB染色液(4 mL/kg),體循環(huán)2 h后,腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,經(jīng)心臟灌流,觀察大鼠心臟右心耳滴出無色透明液體后,取腦,稱取腦組織0.5 g。將腦組織放入EP管內(nèi)加入甲酰胺溶液(2 mL/g)浸泡。加入研磨球,放入組織研磨儀中低溫勻漿,勻漿后取出,在60 ℃孵育24 h。放入12 000 r/min的低溫離心機,4 ℃離心30 min,取上清液。吸取上清液20 μL加入96孔板,酶標(biāo)儀620 nm處讀取吸光度OD值。制備EB標(biāo)準(zhǔn)品濃度曲線,計算樣品濃度。

2.10 出血性轉(zhuǎn)化程度測量 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后用PBS進行灌注,觀察右心耳出現(xiàn)無色透明的液體后迅速斷頭取腦,手術(shù)刀分離兩側(cè)大腦半球,收集缺血半球腦組織并稱取腦組織約100 mg。加入1倍PBS快速勻漿,13 000 g離心30 min,取上清。取20 μL上清加入96孔板中,按照血紅蛋白檢測試劑盒說明書測定上清液中血紅蛋白含量。

2.11 透射電子顯微鏡觀察腦缺血大鼠血腦屏障緊密連接超微結(jié)構(gòu) 取小鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)1 mm3大小的腦組織,固定于2.5%戊二醛溶液,4 ℃保存;棄去原有固定液,將樣本裝入瓶中,經(jīng)PBS漂洗過夜;再經(jīng)PBS清洗3次,固定于1%鋨酸,PBS清洗3次。依次按照30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%乙醇進行脫水,每次15 min。棄去無水乙醇后,加入100%丙酮浸透。丙酮與樹脂按照1∶1比例作用1 h,更換為1∶2的比例作用2 h,更換純樹脂包埋過夜。切片,染色,透射電子顯微鏡下觀察血腦屏障緊密連接超微結(jié)構(gòu)并采集圖像。

2.12 免疫組織化學(xué)染色法觀察腦組織緊密連接蛋白occludin、ZO-1和MMP-9表達水平 將大鼠麻醉、取腦,4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片。烘烤3 h,二甲苯浸洗。依次在100%、95%、85%、70%乙醇中浸洗5 min,PBS清洗。放入枸櫞酸鹽中處理,PBS清洗。放入3% H2O2-甲醇溶液處理,PBS清洗。加入一抗,放4 ℃冰箱里孵育過夜。取出切片,PBS清洗。于增強劑孵育0.5 h后PBS清洗。加入二抗,孵育30 min,PBS清洗。加入顯色劑和蘇木精染液。依次在70%、85%、95%和100%乙醇中浸洗,二甲苯浸洗,封片。顯微鏡下觀察occludin、ZO-1和MMP-9表達水平。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠神經(jīng)及運動功能比較 假手術(shù)組大鼠神經(jīng)及運動功能無明顯損害。與假手術(shù)組大鼠比較,模型組大鼠神經(jīng)功能嚴(yán)重受損,行為出現(xiàn)明顯障礙(P<0.05),表明模型建立成功;桃紅四物湯組和尼莫地平組大鼠神經(jīng)和運動功能明顯改善(P<0.05)。見圖1。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.桃紅四物湯組;D.尼莫地平組;與假手術(shù)組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.2 各組大鼠腦梗死面積比較 假手術(shù)組大鼠腦部可見鮮艷的紅色,無蒼白色區(qū)域,未見腦組織損傷;與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦部蒼白色區(qū)域顯著增加(P<0.05)。與模型組比較,桃紅四物湯組和尼莫地平組蒼白色區(qū)域顯著減少(P<0.05)。見圖2。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.桃紅四物湯組;D.尼莫地平組;與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.3 各組大鼠腦皮質(zhì)的組織形態(tài)比較 假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整、輪廓清晰,無明顯病理變化;模型組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)大量神經(jīng)元出現(xiàn)結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞質(zhì)濃縮,細(xì)胞核固縮、分裂甚至溶解的狀態(tài)。并且神經(jīng)元之間的排列雜亂、層次不清晰、間質(zhì)水腫,病理損傷嚴(yán)重。桃紅四物湯和尼莫地平組大鼠腦皮質(zhì)的病理損傷均有所改善。見圖3。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.桃紅四物湯組;D.尼莫地平組

3.4 各組大鼠腦組織含水率及出血性轉(zhuǎn)化程度比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織含水率、出血性轉(zhuǎn)化程度明顯增加(P<0.05)。與模型組比較,桃紅四物湯組和尼莫地平組大鼠腦組織含水率與出血性轉(zhuǎn)化程度明顯下降(P<0.05)。水腫與出血均有所改善。見圖4。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.桃紅四物湯組;D.尼莫地平組;與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.5 各組大鼠血腦屏障通透性比較 假手術(shù)組EB滲出量較低,模型組的EB滲出量明顯增加(P<0.05),即血腦屏障通透性增加。與模型組比較,桃紅四物湯組和尼莫地平組大鼠腦內(nèi)EB滲出含量明顯降低(P<0.05)。見圖5。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.桃紅四物湯組;D.尼莫地平組;與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

3.6 各組大鼠血腦屏障緊密連接超微結(jié)構(gòu)變化比較 假手術(shù)組大鼠內(nèi)皮細(xì)胞之間相鄰的緊密連接呈現(xiàn)一條單獨且明顯的暗線,內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接數(shù)量較多,細(xì)胞間隙狹窄,大鼠無血腦屏障的破壞。模型組大鼠的緊密連接數(shù)量減少,蛋白層變薄且不連續(xù),細(xì)胞間出現(xiàn)間隙,內(nèi)皮細(xì)胞水腫。桃紅四物湯組和尼莫地平組細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)的異常變化明顯減弱。見圖6。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.桃紅四物湯組;D.尼莫地平組

3.7 各組大鼠緊密連接相關(guān)蛋白表達水平比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦梗死區(qū)occludin、ZO-1蛋白表達水平降低(P<0.05),MMP-9表達水平升高(P<0.05)。給予桃紅四物湯和尼莫地平后occludin、ZO-1的表達水平顯著升高(P<0.05),MMP-9表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖7、圖8。

圖7 各組大鼠occludin、ZO-1、MMP-9表達水平比較(免疫組織化學(xué)染色,10×40倍)

注:與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4 討論

腦卒中屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇,腦卒中病理過程中產(chǎn)生的許多物質(zhì),如凝血酶、細(xì)胞因子等都可歸納為中醫(yī)理論“瘀”的范疇,這些物質(zhì)可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、血腦屏障結(jié)構(gòu)等,影響腦組織正常功能,并與腦卒中的不良預(yù)后密切相關(guān)。故在治療、用藥方面以祛瘀血、生新血、暢氣機等法互相配合,辨證應(yīng)用,祛除瘀阻,通暢氣機。

血腦屏障在維持大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特殊微環(huán)境及與全身多臟器交流中發(fā)揮著重要作用。血腦屏障破壞是早期缺血性腦卒中的特征之一,血腦屏障受到破壞致使腦部損傷和后續(xù)的神經(jīng)功能損傷［10］。此外,其生化特征包括減少緊密連接所組成的蛋白表達,改變緊密連接組織結(jié)構(gòu),調(diào)節(jié)內(nèi)源性血腦屏障轉(zhuǎn)運蛋白的功能［11］。

越來越多的研究表明,血腦屏障的破壞與腦血管疾病密切相關(guān),如腦出血、腦梗死、癲癇、動脈粥樣硬化［12］和神經(jīng)退化。研究［13］表明,動物腦卒中模型的出血性轉(zhuǎn)化和腦水腫的發(fā)病機制可能由于血腦屏障的破壞而重疊。在內(nèi)皮功能障礙的過程中,組織腫脹首先是血管內(nèi)液的滲透,經(jīng)毛細(xì)血管運動進入細(xì)胞外間隙(離子性水腫),隨后進行血腦屏障的破壞,即緊密連接受損和血漿蛋白滲漏(血管源性水腫),最后是毛細(xì)血管完整性的損壞和外滲到腦實質(zhì)。研究［14］發(fā)現(xiàn),在MCAO后24 h,血管旁實質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重的組織水腫,微血管和基底膜的內(nèi)膜結(jié)構(gòu)模糊。同時,大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損、腦水腫、梗死體積擴大等情況。此外,腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞具有高度特征化的表型,其特征是細(xì)胞間緊密連接,緊密連接主要由細(xì)胞跨膜蛋白(occludin、claudin)、細(xì)胞胞質(zhì)附著蛋白和連接黏附分子組成。這些緊密連接限制了分子在血液和腦之間的移動與擴散,在內(nèi)皮層形成一道屏障,即相鄰的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)緊密相連。occludin、claudin-5和ZO-1是反映血腦屏障功能的關(guān)鍵指標(biāo)。ZO將claudin和occludin的細(xì)胞質(zhì)尾端連接到肌動蛋白細(xì)胞骨架,以維持緊密連接結(jié)構(gòu)［15］。研究［16］表明,大腦中動脈閉塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion-reperfusion,MCAO/R)大鼠缺血區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞端足不同程度腫脹。大鼠毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接結(jié)構(gòu)變形,出現(xiàn)間隙裂隙?？梢?血腦屏障在腦缺血后呈現(xiàn)明顯的病理變化,與腦缺血疾病的進展及預(yù)后密切相關(guān)。

桃紅四物湯是祛瘀生新的經(jīng)典方劑,具有活血化瘀功效。桃紅四物湯組成成分復(fù)雜,這也決定了其具有多種藥理作用。目前,桃紅四物湯的主要研究都是圍繞著治療血瘀相關(guān)疾病展開,包括活血化瘀、抗炎鎮(zhèn)痛、神經(jīng)保護等。研究［17］發(fā)現(xiàn),桃紅四物湯能夠降低血瘀證缺血性腦卒中患者血壓和毛細(xì)血管通透性,擴張梗死的腦血管,增加腦部血流量,從而改善腦部的微循環(huán)。課題組以往研究也表明,桃紅四物湯可以減少氧化,緩解損傷,改善學(xué)習(xí)和記憶功能［18］,促進缺血性腦卒中血管生成［19-20］,抑制炎癥與細(xì)胞焦亡［21-22］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),桃紅四物湯能夠改善缺血再灌注大鼠神經(jīng)及運動功能,縮小MCAO/R大鼠缺血側(cè)腦梗死面積,改善大鼠梗死區(qū)腦皮質(zhì)病理損傷,減輕MCAO/R大鼠腦水腫,調(diào)節(jié)血腦屏障通透性,修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu),提高occludin、ZO-1表達水平,降低MMP-9蛋白的表達水平,改善出血性轉(zhuǎn)化程度及恢復(fù)腦血流量,調(diào)節(jié)血腦屏障通透性,對腦缺血再灌注損傷具有良好的保護作用。