曾偉蘭 汪艷

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)。根據(jù)組織學特征,NAFLD分為非酒精性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(NASH),部分可進展為肝硬化、肝癌。NAFLD是一種復雜的多因素疾病,涉及遺傳、表觀遺傳和環(huán)境等多種因素,其發(fā)病機制仍未完全闡明。

肝細胞富含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。ER是真核細胞內(nèi)區(qū)間體積最大的細胞器之一。蛋白翻譯折疊、鈣離子穩(wěn)態(tài)、類固醇和脂質(zhì)生物合成、囊泡運輸?shù)纫幌盗猩飳W過程在ER發(fā)生。生理性或病理性刺激,如B細胞成熟、葡萄糖誘導胰島素分泌、營養(yǎng)素剝奪、氧化應激、缺氧,以及遺傳突變等都可能影響ER穩(wěn)態(tài),引起ER應激。一旦發(fā)生ER應激,細胞將啟動未折疊蛋白反應(UPR),恢復ER穩(wěn)態(tài)或執(zhí)行細胞死亡。UPR可分為兩種類型:當發(fā)生輕度或中度ER應激時,UPR清除未折疊或錯誤折疊的蛋白,恢復ER穩(wěn)態(tài),該過程稱為“適應性”或“細胞保護性”UPR;當發(fā)生強烈或持續(xù)ER應激時,UPR過度激活,細胞內(nèi)部凋亡機制啟動,該過程稱為“適應不良的/不受限的/終末的”UPR。此外,經(jīng)典UPR是未折疊或錯誤折疊蛋白形成所引起3種UPR感受器活化。盡管游離飽和脂肪酸等刺激對蛋白折疊反應沒有直接影響,但也可激活UPR感受器,這種情況稱為非經(jīng)典UPR[1]。

肝臟脂質(zhì)異常累積為NAFLD主要起因。肝脂質(zhì)累積通常與胰島素抵抗(IR)同時發(fā)生,與肝細胞中ER相關(guān)的蛋白平衡紊亂有關(guān)。ER應激是NAFLD的主要觸發(fā)因素之一。研究表明,ER功能障礙可以激活I(lǐng)R和炎癥反應等一系列細胞內(nèi)在應激途徑,引起肝損傷或肝細胞死亡。因此,了解ER應激和UPR在NAFLD疾病發(fā)生中的作用將有助于發(fā)現(xiàn)NAFLD的新治療策略。

哺乳動物細胞UPR由3種信號通路[也稱為UPR分支(UPR branches)或UPR感受器)]組成,包括肌醇需要酶1(IRE1)、蛋白激酶R(PKR)樣ER激酶(PERK)和激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78,也稱為BiP)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(GRP94)是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)量控制和降解的分子伴侶。在生理狀態(tài)下,3種UPR感受器與GRP78結(jié)合而處于非活性狀態(tài);當ER腔內(nèi)聚集未折疊或錯誤折疊蛋白時,這些異常蛋白會競爭性結(jié)合GRP78,將其從UPR感受器分子結(jié)構(gòu)域上解離,引起這些感受器分子活化并級聯(lián)激活下游信號通路。另外,ER腔內(nèi)聚集的未折疊或錯誤折疊蛋白也會直接與UPR感受器結(jié)合,引起UPR感受器活化[1-2]。

研究表明在NASH患者肝活檢樣本、遺傳和飲食誘導NAFLD小鼠模型中,均發(fā)現(xiàn)NAFLD發(fā)生與3種UPR感受器激活有關(guān)[3-5]。IRE1是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的跨膜蛋白,同時具有蛋白激酶活性與核糖核酸內(nèi)切酶(RNase)活性。在哺乳動物基因組中具有IRE1a和IRE1β兩種亞型。IRE1a表達廣泛,IRE1β僅在腸上皮細胞表達[6]。ER應激時,BiP從IRE1a脫離后,IRE1a發(fā)生寡聚化和自磷酸化(p-IRE1α)。p-IRE1α經(jīng)自身RNase結(jié)構(gòu)域的催化作用,使X-box 結(jié)合蛋白-1(XBP1)mRNA發(fā)生剪切作用,生成短XBP1 mRNA,短XBP1 mRNA翻譯為有活性的XBP1s蛋白。XBP1s蛋白進入胞核激活一系列基因轉(zhuǎn)錄[如ER分子伴侶、ER分泌基因和ER相關(guān)蛋白降解系統(tǒng)(ERAD)作用的分子等)],促進未折疊或錯誤折疊蛋白運出ER,從而維持ER穩(wěn)態(tài)。另外,IRE1a的RNase還可通過一個被稱為RIDD(regulated IRE1-dependent decay)的過程降解特定的microRNA(miRNA)和mRNA,參與細胞的代謝、生存和死亡等過程[7-8]。

IRE1α-XBP1信號軸在NAFLD進程中激活,促進肝脂肪變性和炎癥反應發(fā)生。Bax抑制劑-1(BI-1)是一種保守的ER駐留蛋白,可以抑制細胞死亡。有研究發(fā)現(xiàn)NAFLD小鼠在BI-1基因敲除后,可通過激活I(lǐng)RE1α RNase活性來促進肝脂肪變性,并且這一作用可被IRE1α核酸內(nèi)切酶抑制劑STF-083010阻斷[3]。在肥胖和糖尿病小鼠模型中,肝臟中BI-1 mRNA表達降低40%以上,而IRE1α的表達水平和IRE1α介導的XBP1剪切活性增加。使用腺病毒基因轉(zhuǎn)移技術(shù)特異性恢復BI-1基因敲除的肥胖和糖尿病小鼠肝臟的BI-1水平,發(fā)現(xiàn)BI-1可與IRE1α形成復合物并嚴重鈍化XBP1 mRNA的剪切活性,顯著改善小鼠的葡萄糖耐受不良[9]。此外,活化的IRE1α可通過XBP1促進絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶基因(SPT)的轉(zhuǎn)錄,刺激肝細胞釋放富含神經(jīng)酰胺的炎性細胞外囊泡(EVs),增加肝臟中巨噬細胞的募集,EVs將肝細胞ER應激傳遞給巨噬細胞,進一步加重高脂肪、高果糖和高膽固醇(FFC)飲食誘導的NASH小鼠發(fā)生炎癥反應和肝損傷。相反,抑制肝細胞IRE1α表達,可減少FFC誘導NASH小鼠EVs釋放和巨噬細胞聚集,減輕炎癥和肝損傷[10]。這些結(jié)果提示,開發(fā)阻斷IRE1α信號通路的抑制劑或靶向抑制EVs釋放也許是NASH的潛在治療策略。

然而,有研究發(fā)現(xiàn),雖然肥胖小鼠肝臟中IRE1α磷酸化水平、c-Jun N端激酶(JNK)活性和UPR靶基因表達均增加,但是XBP1剪切活性仍然受損。Yang等[11]發(fā)現(xiàn),一氧化氮合酶(iNOS)刺激瘦素缺陷型(ob/ob)肥胖小鼠和HFD飲食誘導NAFLD小鼠肝組織IRE1α發(fā)生S-亞硝基化(S-Nitrosylation)引起IRE1α RNase活性下降,導致IRE1a介導的XBP1剪接活性降低,并促進JNK活性增加。相反,通過抑制IRE1α的S-亞硝基化可以重新恢復肝臟中IRE1α表達以及XBP1剪接活性,降低JNK活性,改善NAFLD小鼠的葡萄糖穩(wěn)態(tài)。這提示NAFLD疾病進程中,UPR感受器上游信號分子(如iNOS)激活也會影響IRE1α活性,可能導致ER功能受損和ER應激延長。

此外,在慢性ER應激中IRE1α可能對NAFLD疾病具有保護作用。Wang等[12]發(fā)現(xiàn),HFD誘導的NAFLD小鼠和肝脂肪變性患者的肝組織中IRE1α發(fā)生S-亞硝基化誘導IRE1α RNase活性失活,同時參與肝臟脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵miRNA亞群水平上調(diào),特別是miR-34和miR-200家族降解減少。與野生型HFD組小鼠相比,在肝細胞特異性敲除IRE1a基因(IRE1a-/-)的NAFLD小鼠肝組織,以及油酸或棕櫚酸刺激的由IRE1a-/-小鼠分離的原代肝細胞中發(fā)現(xiàn),肝細胞缺乏IRE1α可顯著增加miR-34和miR-200家族的豐度,并且積累更多的中性脂質(zhì)。因此猜測NAFLD時IRE1α RNase活性受損可能是由于S-亞硝基化的修飾。miRNA豐度的增加可能是IRE1α的RNase活性受損導致對miRNA降解減少。因此,IRE1α在NASH中的作用差異可能與IRE1α的RNase活性調(diào)節(jié)XBP1剪接水平和RIDD過程二者之間的平衡有關(guān),但也不排除存在類似于BI-1等其他分子參與調(diào)控的可能性。值得注意的是,在營養(yǎng)限制或補充氧化劑的代謝飲食,如蛋氨酸和膽堿缺乏飲食(MCD),和致動脈粥樣硬化飲食誘導小鼠的肝組織發(fā)生的急性ER應激,可能激活經(jīng)典IRE1α-XBP1 UPR途徑。相反,長期HFD飲食誘導的慢性ER應激可能導致NAFLD疾病小鼠肝組織發(fā)生IRE1α亞硝基化并抑制IRE1α RNase活性[12]。

PERK是真核翻譯起始因子2α(eIF2α)激酶家族的成員之一。在ER應激中,PERK激活使eIF2α的Ser51位點發(fā)生磷酸化并降低蛋白翻譯速度,限制新生蛋白向ER腔內(nèi)轉(zhuǎn)運,減少ER蛋白折疊負荷,起到保護細胞的作用。同時,PERK介導的eIF2α磷酸化可選擇性允許某些mRNA(如激活轉(zhuǎn)錄因子4(ATF4))翻譯。ATF4可通過激活編碼抗氧化反應、氨基酸合成和轉(zhuǎn)運必需的蛋白質(zhì)等過程的UPR靶基因來促進細胞對ER應激的適應能力,導致細胞的死亡或生存。此外,CCAAT增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP,也被稱為DDIT3)可被ATF4轉(zhuǎn)錄激活,在ER應激促進細胞凋亡的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

PERK-eIF2α-ATF4信號通路調(diào)節(jié)NAFLD肝脂肪變性。Novoa等[13]發(fā)現(xiàn),DNA損傷誘導蛋白34(GADD34,eIF2α特異性磷酸酶)可與蛋白磷酸酶1催化亞基結(jié)合,導致eIF2α去磷酸化,使DDIT3和ATF4水平降低,抑制UPR。Li等發(fā)現(xiàn)HFD誘導NAFLD小鼠、油酸刺激的HepG2細胞或妥布霉素(ER應激誘導劑)處理的3T3-L1細胞,在分別給予Salubrinal(eIF2α去磷酸化的選擇性抑制劑)后,可以通過增加p-eIF2α和ATF4的表達,降低CHOP水平,抑制ER應激,同時增加LC3II/I(自噬標志物)和抑制p62(自噬底物)表達來促進自噬,最終起到緩解NAFLD肝脂肪變性的作用。然而在該研究中,ATF4水平升高的同時,CHOP表達卻受到抑制[4],提示CHOP在NASH中作用的復雜性。與正常飲食野生型小鼠相比,Chop-/-小鼠在HFD飲食16周和MCD飲食3周的NASH模型中均出現(xiàn)更嚴重的肝損傷、炎癥和脂肪變性。并且HFD組Chop-/-小鼠導致肝細胞凋亡數(shù)量和巨噬細胞活化數(shù)量顯著增加[14]。由此推測,在脂毒性期間,CHOP可能依賴于促進巨噬細胞凋亡來減輕NASH小鼠的肝損傷。

ATF6是具有胞質(zhì)bZIP(basic-leucine zipper)轉(zhuǎn)錄因子二聚化結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白。在哺乳動物中具有ATF6a和ATF6β兩種剪切體。在生理條件下,BiP與ATF6a結(jié)合并在ER駐留;當ER應激發(fā)生時,ATF6a從ER釋放轉(zhuǎn)運至高爾基體,并被高爾基體兩種常駐加工酶(MBTP/S1P和MBTP/S2P)切割成具有轉(zhuǎn)錄活性片段的ATF6p50;ATF6p50再進入胞核激活UPR靶基因(如ER伴侶和其它參與蛋白質(zhì)折疊的基因),增強細胞對ER應激的耐受能力和對未折疊蛋白的處理能力。ATF6p50還可與XBP1s結(jié)合形成異二聚體,促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解過程(ERAD)基因的上調(diào)。

ATF6α信號通路激活可能對NAFLD肝脂肪變性具有保護作用。ATF6p50可通過促進CHOP對CCAAT增強子結(jié)合蛋白(C/EBPα)的負調(diào)控,來抑制脂質(zhì)生成相關(guān)基因的表達,最終減少脂肪酸氧化和脂蛋白分泌。同時,ATF6p50過表達可抑制固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1(SREBP1)的蛋白裂解[1]。有研究報道使用妥布霉素刺激小鼠(48 h)發(fā)生ER應激,發(fā)現(xiàn)野生型小鼠肝損傷能夠自動恢復正常,ATF6α基因敲除小鼠表現(xiàn)出明顯肝功能障礙和肝脂肪變性;并且顯著抑制編碼β-氧化(Cpt1a,Acadm)、過氧化物酶體(Acox1,Ppara)和微粒體氧化(Cyp4a10)關(guān)鍵步驟基因的表達[15]。ATF6α在NASH小鼠肝臟過表達可促進胰島素信號傳導[16]。然而,ATF6在妥布霉素誘導急性或慢性ER應激的NAFLD斑馬魚模型中作用有相反表現(xiàn)。當斑馬魚發(fā)生慢性ER應激時,ATF6可促進肝脂肪變性;相反,在急性ER應激時,ATF6可降低斑馬魚的脂肪變性[5]。因此,ATF6α在NAFLD肝脂肪變性的保護作用可能與ER應激的時長有關(guān)。

值得注意的是,除了每個UPR傳感器都在NAFLD起作用外,脂毒性誘導ER應激反應,刺激其他下游分子的激活可加劇NAFLD脂質(zhì)累積。溶酶體膜蛋白SID1跨膜家族成員2(SIDT2)基因敲除的小鼠肝組織不僅發(fā)生脂肪變性、肝小葉和匯管區(qū)炎癥浸潤,還發(fā)生ER應激和UPR激活,并伴有ER損傷。同時脂肪酸合成相關(guān)調(diào)控分子SREBP1蛋白和甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子1(SREBF1)mRNA水平顯著升高[17]。Kim等在NASH患者和HFD飼喂MUP-uPA轉(zhuǎn)基因小鼠誘導NASH模型發(fā)現(xiàn),肝組織中ER應激誘導半胱天冬酶2(Casp2)表達上調(diào),并與位點1蛋白酶(S1P)共定位,通過S1P的切割作用促進SREBP1/2轉(zhuǎn)錄因子激活,導致肝細胞中甘油三酯和游離膽固醇的蓄積更顯著。相反,使用Casp2抑制劑(Ac-VDVAD-CHO)或基因敲除Casp2基因抑制NASH小鼠肝臟Casp2的表達可逆轉(zhuǎn)ER應激誘導NASH的結(jié)局[18]。卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(LCAT)缺乏不僅會影響脂蛋白組成和水平,而且會破壞細胞膽固醇穩(wěn)態(tài)。與正常飲食小鼠相比,使用高脂高蔗糖(含36%脂肪不含膽固醇)依次誘導C57BL/6野生型、低密度脂蛋白(LDL)受體敲除(Ldlr-/-xLcat+/+,SKO)和LDL受體/LCAT雙重敲除(Ldlr-/-xLcat-/-,DKO)NASH小鼠模型發(fā)現(xiàn),野生型和SKO小鼠肝組織中不僅出現(xiàn)膽固醇生物合成基因,以及ER應激標志物CHOP和XBP1s的表達水平表達增加,還出現(xiàn)炎癥小體活化;但在DKO小鼠中均無這些變化。然而,高膽固醇(2%)喂養(yǎng)DKO小鼠可以誘導小鼠肝組織發(fā)生脂肪變性和炎癥小體活化[19]。這些結(jié)果提示NASH中,膽固醇的積累與ER應激和炎癥小體激活相關(guān)。

另外,長壽因子(Sirtuins)參與調(diào)控細胞壽命進程、糖脂代謝、應激反應以及炎癥反應等生理過程。Shin等[20]發(fā)現(xiàn)在ER應激發(fā)生時,SIRT7特異性靶向核糖體蛋白的啟動子,可直接抑制Myc轉(zhuǎn)錄因子活性,沉默UPR相關(guān)基因表達,緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。與野生型小鼠相比,SIRT7基因敲除小鼠會加速NAFLD疾病進程;相反,抑制ER應激或MYC失活可減輕ER應激并改善NAFLD小鼠肝脂肪變性[20]。這一發(fā)現(xiàn)表明,靶向SIRT7-MYC信號通路可能逆轉(zhuǎn)ER應激,預防NAFLD疾病。

綜上所述,ER應激和UPR在NAFLD/NASH疾病進展中具有重要作用。ER應激反應并非總是朝著NASH病變方向進行;輕度和中度ER應激觸發(fā)“適應性UPR”,可作為藥物靶點減輕NAFLD疾病病理表現(xiàn),恢復ER正常穩(wěn)態(tài);嚴重或持續(xù)的ER應激可導致UPR激活超負荷,并通過炎癥、細胞死亡和EVs分泌等方式導致NASH肝損傷加重;但可能作為藥物靶點來消除NAFLD進程中出現(xiàn)的癌變細胞。盡管目前已發(fā)現(xiàn)許多用于緩解輕度或中度ER應激或誘導嚴重ER應激的工具化合物[1],但是實現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化應用仍存在一定距離。未來研究還需考慮如何基于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向遞藥系統(tǒng),利用當前的工具化合物開發(fā)出符合NAFLD臨床安全給藥的藥物。此外,關(guān)于UPR感受器在NAFLD疾病進程中的作用研究仍比較缺乏,尚不能完全解釋其錯綜復雜的關(guān)系網(wǎng)絡對NAFLD進程的影響,還需進一步研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。