鄧夢雪， 楊秀怡， 龍?jiān)品澹?劉若蘭， 劉行輝， 蘇延停

（湖北科技學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100）

糖基化修飾是一種最普遍的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一，調(diào)控蛋白質(zhì)的諸多功能，例如蛋白質(zhì)折疊、蛋白質(zhì)的識別等[1]。 在近幾十年，研究者已經(jīng)在脊椎動物中發(fā)現(xiàn)了幾百種糖基轉(zhuǎn)移酶， 合成了7 000 多種糖結(jié)構(gòu)[2]。 不同的糖鏈組成和連接方式使糖結(jié)構(gòu)變得十分復(fù)雜，這給分析糖基化修飾造成了很大的困難[3]。

蛋白質(zhì)的糖基化修飾根據(jù)連接的基團(tuán)和氨基酸分為N-連接糖基化修飾和O-連接糖基化修飾。N-連接糖基化修飾過程起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，成熟于高爾基體，共價(jià)連接在天冬酰胺的氨基上。 而O-連接糖基化修飾主要發(fā)生在高爾基體，共價(jià)連接在絲氨酸或蘇氨酸等的羥基上。O-連接糖基化修飾一般是以GalNAc 為第一個單糖直接結(jié)合氨基酸上，隨后其他的單糖繼續(xù)添加到GalNAc 后延伸。 縮短的O-連接糖鏈特別是只含有一個單糖即O-GalNAc 修飾在很多腫瘤細(xì)胞里出現(xiàn)了高表達(dá)，所以O(shè)-GalNAc 修飾又被稱為腫瘤相關(guān)抗原即Tn 抗原[4]。 目前仍然不是很清楚Tn 抗原在腫瘤發(fā)展過程中到底扮演著什么樣的角色。 在結(jié)腸直腸癌中，Tn 抗原可以結(jié)合樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面的半乳糖凝集素即MGL，導(dǎo)致這些細(xì)胞活性受到抑制，最終腫瘤細(xì)胞發(fā)生逃逸[4]。 在乳腺癌中，高表達(dá)的Tn 抗原可以通過招募Galectin-3 和MUC1 使腫瘤細(xì)胞能夠吸附在內(nèi)皮細(xì)胞上，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[5]。

目前識別O-GalNAc 修飾的工具很有限， 有很多文獻(xiàn)報(bào)道能夠識別O-GalNAc 修飾的單克隆抗體， 但是大部分抗體對O-GalNAc 修飾的識別依賴于2 個以上連續(xù)的O-GalNAc 修飾， 有些單克隆抗體還會對氨基酸序列有一定的依賴性，這樣就導(dǎo)致了這類單克隆抗體可能對很多O-GalNAc 修飾的蛋白質(zhì)的識別不敏感， 不適用于O-GalNAc 修飾的大規(guī)模鑒定[6-7]。 而凝集素仍然是廣泛應(yīng)用于識別這種修飾的有力工具，這些凝集素大多來源于植物和真菌。 目前發(fā)現(xiàn)了有很多凝集素可以識別O-GalNAc修飾，例如凝集素VVL、TL2、MPL、DBA 和Ricin 等[8]。這些報(bào)道識別O-GalNAc 修飾的凝集素都是由二聚體或者四聚體通過非共價(jià)連接， 特異性不專一，會結(jié)合其他的單糖例如galactose 末端糖結(jié)構(gòu)。 綜合而言， 目前并沒有一個對O-GalNAc 修飾十分特異的凝集素，識別工具的缺乏也導(dǎo)致了對O-GalNAc 修飾的研究十分困難。

CgtB 是來源于空腸彎曲菌的β1,3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，CgtB 已經(jīng)廣泛用于體外合成O-連接糖基化修飾， 例如應(yīng)用多操縱子原核表達(dá)元件同時表達(dá)CgtB、ppGalNAc-T2 糖基轉(zhuǎn)移酶和目的蛋白質(zhì)，成功表達(dá)出含有O-連接糖基化修飾的目的蛋白質(zhì)[9]。對CgtB 的結(jié)構(gòu)研究表明，不同菌株的CgtB 的N 端前108 個氨基酸高度保守， 可能是供體UDP-半乳糖的結(jié)合位點(diǎn)，而C 端則是受體糖蛋白（O-GalNAc修飾蛋白質(zhì)）的結(jié)合位點(diǎn)，同時C 端去除30 個氨基酸后偶聯(lián)MBP 標(biāo)簽會提高酶的效率[10]。對于糖基轉(zhuǎn)移酶的改造有很多嘗試，目前已有用來源于產(chǎn)氣莢膜梭菌的糖苷水解酶的突變 （突變了活性位點(diǎn)，保留了糖結(jié)合活性）來識別相應(yīng)糖基化修飾[11-12]。 對N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶I(hGnT-I)的突變（截除N 端跨膜域）仍然能催化特異性糖基化[13]。作者所在團(tuán)隊(duì)對CgtB 進(jìn)行基因改造， 將其N 端部分序列和C 端末尾30 個氨基酸刪除， 從而只保留CgtB 對OGalNAc 修飾的結(jié)合活性。 通過原核表達(dá)，成功純化出突變體CgtB 蛋白質(zhì)即Cgt1， 通過糖蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)證明了Cgt1 保持了結(jié)合O-GalNAc 的活性，并且可以作為識別腫瘤細(xì)胞中O-GalNAc 修飾的工具，這為進(jìn)一步研究O-GalNAc 修飾打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 pMal-c5x 質(zhì)粒、克隆菌DH5α 和表達(dá)菌BL21（DE3）：購于武漢擎科生物公司，引物合成及基因測序由武漢擎科生物公司完成；LB 培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L；LA 培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L， 瓊脂粉20 g/L，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min 后備用。

1.1.2 主要試劑和抗體 Taq DNA 聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶Nde I 和EcoRⅠ、DNA Ligation Kit、氨芐青霉素、MBP 層析柱及填料、麗春紅染料：購于碧云天生物技術(shù)公司；考馬斯亮藍(lán)R-250 染料：購于Biosharp； 免疫印跡檢測及ELISA 所用抗體： 購于Proteintech。

1.2 方法

1.2.1 CgtB 突變體Cgt1 的改造方案 首先將CgtB的C 端去除30 個氨基酸， 再將CgtB 的N 端去除30 個氨基酸即為Cgt1。改造的基因序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 Cgt1 突變體的目的基因擴(kuò)增及質(zhì)粒載體pMal-c5x 的雙酶切 以改造的Cgt1 突變體的合成基因序列為模板進(jìn)行擴(kuò)增，1 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳，電壓140 V， 電泳15 min， 回收擴(kuò)增的目的基因片段。 Cutsmart Buffer 5 μL，pMal-c5x 質(zhì)粒3 μg，限制性核酸內(nèi)切酶Nde I 和EcoRⅠ各2 μL， 補(bǔ)ddH2O至50 μL，37 ℃雙酶切30 min， 經(jīng)1 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳回收。

1.2.3 重組質(zhì)粒pMal-c5x-Cgt1 體系的構(gòu)建 以10 μL DNA 無縫連接酶、3 μL Cgt1 基因擴(kuò)增片段、1 μL pMal-c5x 質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物，補(bǔ)6 μL ddH2O 至20 μL 體系，50 ℃、20 min 無縫連接得重組質(zhì)粒pMal-c5x-Cgt1，重組質(zhì)粒圖譜見圖1。 取10 μL 重組質(zhì)粒pMal-c5x-Cgt1 轉(zhuǎn)入50 μL 的DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中， 冰浴30 min，42 ℃熱激1 min， 加入1 mL LB 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)1 h，3 000 r/min 離心1 min。取下層100 μL 涂布于氨芐青霉素抗性平板， 過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，37 ℃培養(yǎng)9 h 后菌液進(jìn)行PCR初步驗(yàn)證，后進(jìn)行單向測序進(jìn)一步驗(yàn)證。 取陽性菌液擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒， 將所提質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21（DE3）中。

圖1 重組質(zhì)粒pMal-c5x-Cgt1 的質(zhì)粒圖譜Fig. 1 Plasmid profile of the recombinant plasmid pMalc5x-Cgt1

1.2.4 Cgt1 的少量誘導(dǎo) 取Cgt1 陽性菌液于1 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)， 隨后以1∶100 菌液體積比轉(zhuǎn)入到10 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)2.5 h，至OD 值達(dá)對數(shù)期即0.6~1.0，然后加入IPTG使其終濃度為1 mmol/L，16 ℃、160 r/min 誘導(dǎo)12 h。菌液于12 000 r/min 離心1 min，棄上清液，用1 mL PBS 緩沖液重懸混勻沉淀。 超聲破碎后于4 ℃、12 000 r/min 離心20 min。

1.2.5 Cgt1 的大量表達(dá)及純化 取陽性菌液在1 mL LB 培養(yǎng)基中過夜擴(kuò)大培養(yǎng)， 以1∶100 菌液比轉(zhuǎn)入到10 mL LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 h， 隨后轉(zhuǎn)入到1 L的LB 培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)約2.5 h 使OD 值達(dá)到對數(shù)期即0.6~1.0，然后加入IPTG 使終濃度為1 mmol/L，16 ℃、160 r/min 誘導(dǎo)12 h。將1 L 菌液于4 000 r/min離心20 min， 去上清液， 用40 mL 0.01 mol/L MBP緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl、200 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA, pH 7.4）將沉淀重懸混勻。 超聲破碎，功率為200 W，破碎10 s，停10 s，共90 次。破碎完畢后于12 000 r/min 離心20 min， 收集上清液中蛋白質(zhì)樣品，過0.45 μm 濾膜除去不溶物。 上樣于預(yù)先用MBP 緩沖液平衡好的MBP 親和層析柱，流量為1 mL/min，上樣完成后，用MBP 緩沖液洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白質(zhì)，直到蛋白質(zhì)檢測儀所測值不再變化，大約需1 h，最后用50 mmol/L 麥芽糖進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰，層析柱用ddH2O 洗滌后用體積分?jǐn)?shù)20%乙醇洗滌后保存。

1.2.6 Cgt1 的ELISA 活性檢測 用包被液（pH 9.6的NaHCO3）分別將黏蛋白（含有O-GalNAc 修飾，以O(shè)-連接糖基化為主）， Transferrin （含有NGlycans）標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白稀釋至10 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃包被過夜。 吸出包被液， 用體積分?jǐn)?shù)0.1%的PBST（PBS 緩沖液，體積分?jǐn)?shù)0.1%的Tween 20）洗滌3 次， 用3 g/dL 的BSA 室溫封閉1 h，PBST 洗滌3 次， 開始孵育質(zhì)量濃度為20 μg/mL 的Cgt1 突變體蛋白質(zhì)溶液，室溫孵育1 h，用PBST 洗滌5 次，隨后室溫孵育鼠源MBP 一抗（1∶1 000）1 h，洗滌5 次后室溫孵育羊抗鼠二抗（1∶5 000）1 h，PBST 洗滌5 次， 向每孔加入100 μL TMB 反應(yīng)液避光顯色，30 min 后加入100 μL、1 mmol/L 鹽酸終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測每孔在450 nm 的吸光值。

1.2.7 Cgt1 對細(xì)胞中O-GalNAc 修飾的鑒定 分別準(zhǔn)備兩組相同的HeLa 和HepG2 細(xì)胞樣品，同時制樣，并于10 g/dL SDS-PAGE 分析，在Marker 的10 000 條帶接近板底部時停止電源， 開始轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，5 g/dL 的BSA 室溫封閉1 h。 一組室溫孵育2 μg/mL Cgt1 蛋白質(zhì)溶液；另一組室溫孵育提前混合旋轉(zhuǎn)1 h 的2 μg/mL Cgt1 蛋白質(zhì)和50 mmol/L N-乙酰半乳糖胺的混合溶液1 h，即糖封閉過程，洗滌后于室溫孵育鼠源GST 一抗（1∶2 000）1 h，隨后室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（1∶5 000）1 h，顯影液反應(yīng)后，暗室顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cgt1 突變體的基因改造分析

為增加其可溶性表達(dá)， 去除CgtB C 端的30 個氨基酸。 大量研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株的CgtB 的N 端前108 個氨基酸高度保守，可能是供體UDP-半乳糖的結(jié)合位點(diǎn)，所以為了突變CgtB 的催化活性位點(diǎn)，將CgtB （C 端已經(jīng)刪除30 個氨基酸） 的N 端去除30個氨基酸即為Cgt1，改造路線見圖2。

圖2 CgtB 的改造路線Fig. 2 Transforming strategy of CgtB

2.2 Cgt1 突變體基因擴(kuò)增及pMal-c5x 質(zhì)粒雙酶切結(jié)果

以合成的Cgt1 基因序列作為模版擴(kuò)增目的基因，所得3 管PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 g/dL 的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，見圖3。 在800 bp 附近均有明顯條帶，與改造后的目的基因大?。?53 bp）一致。 將雙酶切質(zhì)粒產(chǎn)物與酶切前的質(zhì)粒經(jīng)1 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳對照，結(jié)果見圖4?？梢婋p酶切后的質(zhì)粒從3 條帶變成1 條帶， 并且酶切前后條帶大小有明顯差異，說明pMal-c5x 雙酶切成功。

圖3 Cgt1 突變體PCR 基因擴(kuò)增Fig. 3 Gene PCR amplification of Cgt1 mutant

圖4 pMal-c5x 質(zhì)粒的雙酶切Fig. 4 Double enzyme digestion of pMal-c5x plasmid

2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的PCR 驗(yàn)證

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到克隆菌DH5α 后，隨機(jī)挑取2 個單克隆菌落在1 mL LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)大，9 h后以1 μL 菌液作為模板進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，1 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖5。 可見2 個單克隆菌落均在800 bp 左右有明顯條帶，與預(yù)期大小一致，初步判斷為陽性。 取該菌液進(jìn)一步測序驗(yàn)證，其序列均完全符合，為陽性。

圖5 pMal-c5x-Cgt1 重組質(zhì)粒體系的菌液PCR 驗(yàn)證Fig. 5 PCR validation for pMal-c5x-Cgt1 recombinant plasmid system

2.4 Cgt1 突變體的表達(dá)及純化

取未誘導(dǎo)的陽性菌上清液和IPTG 少量誘導(dǎo)的陽性菌上清液各400 μL，蛋白質(zhì)抽提制樣（甲醇氯仿抽提，V蛋白質(zhì)液∶V甲醇∶V氯仿為4∶4∶1）， 經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果見圖6（a）。 Cgt1 可溶性表達(dá)，隨后大量表達(dá)Cgt1 蛋白質(zhì)。 將上樣前的蛋白質(zhì)液和MBP 親和層析柱純化收集到的2 個樣品即50 mmol/L 麥芽糖的洗脫液、穿流液，各取200 μL 分別進(jìn)行蛋白質(zhì)抽提制樣（甲醇氯仿抽提，V蛋白質(zhì)液∶V甲醇∶V氯仿為4∶4∶1）。 與超聲破碎后的沉淀樣品經(jīng)SDSPAGE 和考馬斯亮藍(lán)染色，結(jié)果見圖6（b）。 可見目的蛋白質(zhì)Cgt1 富集于50 mol/L 麥芽糖的洗脫液中，條帶純度較高，和預(yù)期大小（70 000）一致。 用PBS反復(fù)超濾置換原始的緩沖液，超濾后測得Cgt1 蛋白質(zhì)的終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。

圖6 Cgt1 的表達(dá)與純化Fig. 6 Expression and purification of Cgt1

2.5 Cgt1 的ELISA 活性檢測

Cgt1 的ELISA 檢測結(jié)果見圖7。結(jié)果顯示，Cgt1能特異結(jié)合O-GalNAc 修飾的mucin 標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白，而對BSA 和含有N-連接糖基化的Transferrin 即轉(zhuǎn)鐵蛋白沒有結(jié)合活性， 該結(jié)果說明Cgt1 保留OGalNAc 結(jié)合活性。

圖7 Cgt1 對不同糖蛋白的結(jié)合Fig. 7 Bindings profiles of Cgt1 to different glycoproteins

2.6 Cgt1 對不同腫瘤細(xì)胞中的O-GalNAc 修飾鑒定

Cgt1 作為糖識別工具的免疫印跡結(jié)果見圖8。在HepG2 和HeLa 復(fù)雜腫瘤細(xì)胞樣品中，Cgt1 均鑒別到大量O-GalNAc 修飾信號，該結(jié)果證明Cgt1 具有O-GalNAc 修飾結(jié)合活性。

圖8 Cgt1 對不同腫瘤細(xì)胞的O-GalNAc 修飾鑒定Fig. 8 O-GalNAc modification in different tumor cells identified by Cgt1

3 結(jié) 語

作者所在課題組通過改造CgtB 的基因， 突變其催化活性位點(diǎn)，保留其糖結(jié)合位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了其突變體Cgt1 在大腸桿菌中的大量表達(dá)、MBP 親和層析柱純化，并在純化后驗(yàn)證了Cgt1 對O-GalNAc 修飾的結(jié)合活性。 通過糖蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)，證明Cgt1 保留了其O-GalNAc 修飾結(jié)合活性， 并且可以作為鑒別O-GalNAc 修飾的鑒定工具， 這對O-GalNAc 修飾的研究起到了極大的推動作用。