李玉珍， 肖懷秋*，， 劉 淼， 王 琳， 曾夢琪， 趙謀明

（1. 湖南化工職業(yè)技術學院 制藥與生物工程學院，湖南 株洲 412000；2. 華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州 510641）

食品富含碳水化合物、蛋白質和脂肪等營養(yǎng)組分，在其加工鏈各節(jié)點均極易受到食源性致病菌污染，既影響營養(yǎng)價值，還可產生潛在生物毒素。 食源性致病菌（foodborne pathogen）以大腸菌群污染和大腸桿菌超標為主，是引起食品公共安全事故與食物中毒的重要病原菌[1]。 吳萱等從北京6 個轄區(qū)的大型超市和農貿市場隨機采集259 份生鮮肉樣本，大腸桿菌檢出率為65.25%， 對甲氧芐氨嘧啶-磺胺甲惡唑高度耐藥，其次為多西環(huán)素[2]；張耀文等采用大腸桿菌熒光PCR 試劑盒對采集的90 份生鮮駝乳進行致病性大腸桿菌檢測發(fā)現(xiàn)， 大腸桿菌檢出率為20%[3]；劉文雙等分析山東不同地區(qū)蛋雞養(yǎng)殖場分離的440 株大腸桿菌blaCTX-M基因流行情況及耐藥性，32.27%菌株攜帶blaCTX-M基因， 攜帶blaCTX-M基因菌株阿莫西林耐藥率最高，四環(huán)素耐藥率次之[4]。

抗菌肽具有抗菌譜廣、穩(wěn)定性好、特異性強、對哺乳動物細胞毒副作用少且不易產生耐藥性等優(yōu)勢，可多靶點作用于食源性致病菌，是最具潛力的抗生素替代品，特別適用于多重耐藥性食源性致病菌抑制[5-6]。 由于抗菌肽結構和抑菌機理的多樣性，存在多種抑菌假說模型[5]。 Alamethicin 通過α-螺旋肽結構以“桶板模型”增強細胞質膜通透性并抑制菌體增殖[7]，Cecropin A 以“毯式模型”靶向作用于細胞質膜脂質雙分子層[8]。大量研究[9-11]認為，細胞質膜通透性改變和結構受損是最重要且最關鍵的抑菌機理，但有部分抗菌肽在細胞膜表面形成跨膜孔道進入膜內并導致細胞質膜透性增加，卻未直接導致菌體死亡，也就說抗菌肽存在其他非細胞質膜損傷效應靶點[5]。 作者所在課題組前期基于細胞質膜損傷角度研究了金屬抗菌肽（簡稱金抗肽）SIF4對大腸桿菌抑菌機制發(fā)現(xiàn)，SIF4可破壞細胞質膜結構、增強細胞質膜通透性、 誘導膜去極化和膜氧化損傷，導致胞內物質泄漏并造成細胞聚沉，并對大腸桿菌細胞壁有破壞作用[12-13]，但基于細胞壁靶點的非細胞質膜抑菌機理還不清楚。 因此， 為闡明金抗肽SIF4基于細胞壁損傷靶點的非細胞質膜抑菌機理，作者從細胞壁損傷靶點研究了SIF4對大腸桿菌的非細胞質膜損傷機理， 以期為食源性大腸桿菌生物防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金抗肽SIF4：作者所在課題組自制[12]；大腸桿菌ATCC25922：上海保藏生物技術中心獲得；牛肉膏、蛋白胨、NaCl、曲拉通（Triton-X100）：國藥集團；細胞壁脂多糖：北京索萊寶科技有限公司；多黏菌素B：南京都萊生物技術有限公司；其他試劑：國產分析純。

1.2 儀器與設備

JEM-7500F 型掃描電子顯微鏡： 日本株式會社；UV-2600 紫外可見分光光度計、IRPrestige-21傅里葉變換紅外光譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 對細胞壁損傷的影響 參照文獻[14]并修改。 將已活化的大腸桿菌接種至牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min 培養(yǎng)12 h，4 000 r/min離心10 min，收集菌體。 用PBS 溶液（0.03 mmol/L，pH 7.2）稀釋至OD630nm為0.1~0.3。 在96 孔細胞培養(yǎng)板中每組每孔先加入100 μL 菌液并分為3 組：A組每孔加入50 μL PBS 緩沖液（陰性對照）；B 組每孔加入50 μL TritonX-100 （質量濃度為300 mg/L，陽性對照）；C 組每孔加入50 μL SIF4， 終質量濃度為1/2MIC、MIC 和2MIC（MIC = 0.4 mg/L），振蕩均勻后于37 ℃恒溫培養(yǎng)120 min，每間隔30 min 測定A630nm。

1.3.2 與細胞壁脂多糖競爭性結合抑制分析 以大腸桿菌ATCC25922 為供試菌株，參考劉天琪[15]等方法并修改。 將SIF4與脂多糖（LPS）預先孵育后再測定細胞存活率以驗證SIF4與細胞壁脂多糖競爭性結合機制。用無菌PBS 溶液配制SIF4溶液并與質量濃度為1 024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 mg/L 的大腸桿菌細胞壁脂多糖等體積混合（終質量濃度為1MIC），37 ℃共育60 min； 將共育物與等體積大腸桿菌（1×106CFU/mL）于37 ℃溫育2 h；吸取0.1 mL 菌液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，計數(shù)菌落斑數(shù)并計算細胞存活率，以多黏菌素B（終質量濃度為1 g/L）作為陽性對照。

1.3.3 對菌體細胞壁膜組分的影響 參照Helm 等方法并修改[16]。 將對數(shù)生長期菌體于4 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，用PBS 溶液將菌體洗滌3 次并重懸（OD630nm為0.1~0.3）。 取適量SIF4與等體積大腸桿菌于37 ℃溫育2 h （終質量濃度為1MIC），取共培養(yǎng)物置于KBr 透明光學晶片中，減壓干燥成透明膜狀物，按中國藥典方法校準儀器，對比分析SIF4處理前后菌體細胞壁膜組分紅外光譜位移規(guī)律，解析SIF4處理對菌體細胞壁組分的影響機制。

1.3.4 對菌體形貌的影響 樣品制備參考Zhang等方法并修改[17]。 取對數(shù)期菌體于4 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，用PBS 溶液洗滌數(shù)次并重懸；將菌懸液與SIF4等體積混合（終質量濃度為1/2 MIC、1MIC 和2MIC），37 ℃溫育2 h，4 000 r/min 離心10 min，加入戊二醛（終體積分數(shù)為2.5%）固定過夜，用PBS 洗2 遍，再用乙醇梯度洗脫（體積分數(shù)為30%、50%、70%、85%、90%各1 次，體積分數(shù)100% 2 次）10 min，滴于潔凈蓋玻片烘干，將蓋玻片粘在樣品臺上并經(jīng)離子濺射噴金和掃描電鏡觀察菌體表面形貌變化，對照組為PBS 組。

2 結果與分析

2.1 對細胞壁損傷的影響

細胞壁在菌體保護、形態(tài)維持、細胞增殖和信號轉導等方面有重要作用，一旦受損，對細胞形態(tài)與胞內生物分子功能有重要影響[18]。 SIF4對菌體細胞壁影響見圖1。

圖1 SIF4 對菌體細胞壁損傷的影響Fig. 1 Effect of SIF4 on cell wall damage

由圖1 可看出， 對照組A630nm吸光值隨處理時間增加呈遞增趨勢， 表明菌體生長沒有受到影響；SIF4處理30 min 時， 試驗組組間差異不顯著 （P>0.05），但與對照組差異顯著（P<0.05）；處理60、90、120 min 時，組間差異顯著（P<0.05），且隨著處理時間和處理劑量增加，A630nm值呈顯著下降趨勢 （P<0.05）。 表明菌體細胞壁受到不同程度損傷，使細胞壁通透性增加， 與抗菌肽MDpep9 對大腸桿菌細胞壁影響相似[14]。 TritonX-100 可破壞菌體細胞壁，導致細胞壁結構變形，從而有助于抗菌肽插入細胞膜和影響胞內物質生物合成，TritonX-100 可能以“毯式模型”介入細胞膜并進入胞內，SIF4對大腸桿菌作用機制類似TritonX-100，但顯著低于其對菌體細胞壁的破壞作用（P<0.05）。 抗菌肽主要通過抑制細胞壁合成和（或）直接破壞細胞壁實現(xiàn)抑菌活性[5]，如人源抗菌肽β-defensin3 能抑制細胞壁形成并使細胞壁穿孔，破壞細胞正常形態(tài)而最終導致細菌死亡[19]，sarcotoxins Ⅱ能抑制細胞壁合成而使菌體細胞形態(tài)維持受阻，從而阻礙菌體正常生長[20]，而家蠅抗菌肽則可破壞大腸桿菌細胞壁結構完整性[14]。 SIF4對細胞壁的破壞作用可能是因為金抗肽SIF4為金屬陽離子抗菌肽，可與細胞壁負電性脂多糖競爭性結合破壞細胞壁結構，并與細胞壁負電荷區(qū)域結合導致菌體形變等有關[12，21]。

2.2 與細胞壁脂多糖競爭性結合抑制分析

脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌細胞壁外壁的一層較厚的類脂多糖類物質，是抗菌肽主要的非細胞質膜效應靶點[22]。 SIF4與細胞壁脂多糖競爭性結合試驗結果見表1。

表1 SIF4 與脂多糖競爭性結合試驗結果Table 1 Competitive binding results between SIF4 and LPS

由表1 可看出， 隨著LPS 質量濃度升高，SIF4抑菌活性降低（細胞存活率上升）， 說明SIF4可與LPS 有效結合并影響抑菌活性。 SIF4與LPS 結合效率越高，游離SIF4越少，抑菌效率就越低，否則抑菌效率就越高[23]。 在LPS 質量濃度為256 mg/L 時，細胞存活率為（100.71 ± 1.40）%，SIF4不再具備抗菌活性， 表明SIF4和LPS 最大結合量可達到256 mg/L，研究結論與抗菌肽AP16-A 類似[23]。 研究還發(fā)現(xiàn)，SIF4在質量濃度1~4 mg/L 時與多黏菌素B 對細胞存活率影響無顯著差異（P>0.05），多黏菌素B 可與細菌外膜LPS 結合，通過破壞細菌外膜滲透性而發(fā)揮抑菌活性[24]。 SIF4為金屬陽離子抗菌肽[12]，帶正電荷，脂多糖由脂質和多糖構成，帶負電荷，能與SIF4通過靜電吸附作用發(fā)揮抗菌活性， 也有可能是SIF4結構中的Fe2+可取代Zn2+、Mg2+等維持脂多糖結構穩(wěn)定的金屬離子，從而發(fā)揮良好抑菌活性[25]。

2.3 對菌體細胞壁膜組分的影響

傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）能提供特征性基團吸收光譜譜帶，分析微生物細胞紅外光譜譜帶可用于微生物細胞與微生物組分的鑒別[16，26]。SIF4處理前后菌體細胞壁膜紅外光譜見圖2。

圖2 SIF4 對細胞壁膜組分的影響Fig. 2 Effect of SIF4 on cell wall membrane components

FT-IR 提供的分子特征基團吸收譜帶可用于描述細胞壁膜組分信息，其中，900~500 cm-1為指紋信息區(qū)；1 200~900 cm-1為細胞壁多糖信息區(qū)；1 500~1 200 cm-1為蛋白質和脂肪酸混合信息區(qū)域；1 800~1 500 cm-1為多肽酰胺和蛋白質信息區(qū)；3 000~2 800 cm-1為脂肪酸信息區(qū)[26]。當抗菌肽結合菌體細胞壁并破壞細胞壁膜結構時，可引起紅外光譜圖譜特征區(qū)吸收光譜的改變。 由圖2 可看出，與對照組相比，試驗組（1MIC 組）在1 200~900、1 500~1 200、3 000~2 800 cm-1的3 個區(qū)間紅外光譜吸收峰變化明顯， 分別對應細胞壁多糖信息區(qū)、蛋白質與脂肪酸混合信息區(qū)、脂肪酸信息區(qū)，表明SIF4對細胞壁多糖信息區(qū)、 蛋白質與脂肪酸混合信息區(qū)以及脂肪酸信息區(qū)域有一定影響，特別是1 200~900 cm-1和1 500~1 200 cm-1區(qū)域影響最明顯，揭示細胞壁是金抗肽SIF4的潛在抑菌效應靶點[12-13]。

2.4 對菌體形貌的影響

掃描電鏡（SEM）是觀察微生物菌體形貌最有效的手段，通過電子束對樣品外在結構掃描得到三維立體構造，SIF4對菌體形貌影響見圖3。

圖3 SIF4 處理對菌體形貌的影響Fig. 3 Effect of SIF4 treatment on strain morphology

由圖3 可看出，對照組菌體微觀結構沒有發(fā)生明顯改變，菌體呈清晰桿狀，菌體細胞壁膜結構完整且表面平滑。 1/2MIC SIF4處理后，部分菌體細胞壁膜變粗糙，出現(xiàn)輕微坍塌，菌體表面開始出現(xiàn)皺縮，細胞壁膜結構完整性遭到一定程度破壞。 1MIC SIF4處理后，菌體除表面出現(xiàn)皺縮和凹陷外，部分菌體的細胞膜出現(xiàn)明顯崩塌。 2MIC SIF4處理后，菌體表面凹陷和皺縮現(xiàn)象更為明顯，胞內原生質體有泄漏，可觀測到有部分菌體出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。 可能是由于菌體與SIF4互作后，細胞壁膜結構完整性遭到破壞，使胞內蛋白質和核酸等原生質組分泄漏，從而使結構受損細胞產生的細胞碎片與坍塌的菌體出現(xiàn)聚集。 課題組前期研究觀察到，SIF4可破壞細胞壁（膜）結構并使胞內容物泄漏，可增強表面疏水性和降低表面zeta 電位， 造成細胞聚沉和生物代謝紊亂[12]，SIF4對菌體細胞壁膜影響機理與抗菌肽P7相似[27]。

3 結 語

從細胞壁損傷、 細胞壁脂多糖競爭性結合、細胞壁膜組分衍變及菌體形貌改變等方面系統(tǒng)研究了SIF4對基于細胞壁損傷靶點的大腸桿菌非細胞質膜損傷抑菌機理。研究發(fā)現(xiàn)，SIF4可破壞大腸桿菌細胞壁結構，在一定質量濃度范圍內，細胞壁受損與SIF4處理時間和處理劑量呈正相關且組間差異顯著（P<0.05），細胞壁受損可使細胞壁通透性增加；SIF4可與大腸桿菌細胞壁脂多糖（LPS）有效結合，與LPS 結合量達到256 mg/L 或更大時，抑菌活性消失。FT-IR 分析發(fā)現(xiàn)，SIF4對細胞壁多糖信息區(qū)和蛋白質與脂肪酸混合信息區(qū)影響最明顯，表明細胞壁可能是SIF4潛在抑菌效應靶點。 SEM 觀測發(fā)現(xiàn)，隨著SIF4處理劑量的增加， 菌體形貌可出現(xiàn)壁膜變糙、輕微坍塌、表面皺縮、表面崩塌、原生質泄漏及細胞聚集等遞進現(xiàn)象，SIF4可使菌體形貌發(fā)生顯著改變。