錢瑞 陳書秀 羅世菊 趙聚萍 李曉捷

摘?要：為篩選用于海帶超低溫保存的冷凍保護(hù)劑，采用10%二甲基亞砜（DMSO）、10%甘油、10%蔗糖、10%乙二醇、10% DMSO+10%甘油、10% DMSO+8%葡萄糖、10% DMSO+10%蔗糖、10% DMSO+10%甘油+8%葡萄糖、10% DMSO+10%山梨醇等9種單一或復(fù)合冷凍保護(hù)劑，在0～4 ℃條件下分別對(duì)海帶配子體和孢子進(jìn)行處理，對(duì)配子體處理30 min、60 min、24 h，對(duì)孢子處理15、30、60 min，通過(guò)統(tǒng)計(jì)配子體細(xì)胞的存活率以及孢子萌發(fā)成配子體的比例，對(duì)不同種類的冷凍保護(hù)劑進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：9種冷凍保護(hù)劑均對(duì)海帶配子體和孢子有一定的毒性作用，并且毒性隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。10% DMSO對(duì)海帶配子體細(xì)胞的毒性最小，處理60 min后配子體細(xì)胞的存活率為100%；其次是10%乙二醇，處理30 min后配子體的存活率為100%；含10%甘油的單一或復(fù)合冷凍保護(hù)劑對(duì)配子體細(xì)胞毒性較大，處理后配子體的成活率顯著低于DMSO和乙二醇組（P＜0.05）。單一冷凍保護(hù)劑對(duì)海帶孢子的毒性顯著低于復(fù)合冷凍保護(hù)劑，除10%甘油組處理30、60 min外，其他單一冷凍保護(hù)劑試驗(yàn)組的配子體發(fā)生率均在60%～80%。

關(guān)鍵詞：海帶；配子體；孢子；冷凍保護(hù)劑；毒性

保護(hù)和利用好海帶種質(zhì)資源可為提高海帶品種水平、實(shí)現(xiàn)海帶良種化生產(chǎn)提供重要保證。20世紀(jì)70年代末，我國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)，在人工培養(yǎng)條件下，雌、雄配子體能形成無(wú)性繁殖系（克?。⒛墚a(chǎn)生配子，從而開始了海帶種質(zhì)保存技術(shù)的研究［1-4］。在海帶配子體世代，將單個(gè)配子體分離，使其在適宜的培養(yǎng)條件下進(jìn)行無(wú)性繁殖，以無(wú)性繁殖系的形式進(jìn)行海帶配子體的繼代培養(yǎng)保存。此法基本實(shí)現(xiàn)了海帶種質(zhì)的長(zhǎng)期保存，但也存在明顯不足：采用液體培養(yǎng)保存一般需要在半個(gè)月內(nèi)更新1次培養(yǎng)液，工作量大，操作繁瑣，頻繁操作也增加了種質(zhì)污染及混雜的概率；在采孢子前無(wú)法對(duì)種海帶進(jìn)行無(wú)菌處理，不能杜絕微生物尤其雜藻的污染；培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞形態(tài)異常、單性生殖等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生［5-7］。因此，該保種技術(shù)還不能做到種質(zhì)永久保存，無(wú)法完全排除混雜、污染、變異的可能性［8］。大量研究表明，生物細(xì)胞、組織、器官、胚胎甚至個(gè)體在超低溫（-196 ℃）狀態(tài)下代謝完全停止，生命可以在這種靜止的狀態(tài)下被長(zhǎng)期保存，解凍后又可恢復(fù)其原有的生物活性和遺傳特性［9］。超低溫保存技術(shù)既避免了在傳統(tǒng)的動(dòng)、植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中可能發(fā)生的染色體、基因組和基因水平上的變異，又保存了細(xì)胞的活力和形態(tài)發(fā)生的潛能［10-13］。水生動(dòng)物、藻類和微生物的細(xì)胞超低溫保存技術(shù)是建立水生生物種質(zhì)資源細(xì)胞庫(kù)、胚胎庫(kù)和基因庫(kù)的基本技術(shù)，將有效解決藻類種質(zhì)保存中污染、混雜、變異等問(wèn)題，從而實(shí)現(xiàn)藻類種質(zhì)的永久保存。

海帶生活史包括肉眼可見(jiàn)的孢子體和顯微可見(jiàn)的配子體兩個(gè)世代，其中配子體世代包括游孢子、胚孢子和配子體3個(gè)階段。通常海帶種質(zhì)保存是以絲狀體作為材料，但絲狀體是由人工分離的單個(gè)配子體培養(yǎng)而成，由于培養(yǎng)空間、操作方法等的限制，大數(shù)量株系的保存很困難，保存有限株系又難以滿足遺傳多樣性研究和應(yīng)用。相反，孢子懸液含有大量的孢子，對(duì)其進(jìn)行凍存可保存大量的株系［14］。因此，研究海帶配子體和孢子的超低溫冷凍技術(shù)有利于推動(dòng)海帶種質(zhì)保存技術(shù)的發(fā)展。冷凍保護(hù)劑的應(yīng)用在超低溫保存技術(shù)發(fā)展中具有里程碑作用，使用毒性小、高效的冷凍保護(hù)劑是海帶種質(zhì)超低溫冷凍保存成功的關(guān)鍵。

本研究以海帶配子體和孢子為試驗(yàn)對(duì)象，采用單一或復(fù)合冷凍保護(hù)劑對(duì)其進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)處理，通過(guò)統(tǒng)計(jì)海帶配子體細(xì)胞的存活率及海帶孢子萌發(fā)成配子體的比例，對(duì)不同種類的冷凍保護(hù)劑進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)，并篩選出毒性作用小且有效的冷凍保護(hù)劑，以期為海帶種質(zhì)超低溫冷凍保存冷凍保護(hù)劑的選擇提供依據(jù)。

1?材料和方法

1.1?試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用海帶配子體為國(guó)家海藻與海參工程技術(shù)研究中心海藻種質(zhì)庫(kù)保存的901海帶配子體克隆系，編號(hào)為019601018。海帶孢子從葉片表面長(zhǎng)有孢子囊的成熟海帶（901）中采集獲得。

1.2?冷凍保護(hù)劑種類及配比

試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。以煮沸冷卻的海水為基礎(chǔ)液，按表1中的成分和比例配制9種單一或復(fù)合冷凍保護(hù)劑。配制好的冷凍保護(hù)劑存放在0～4 ℃冰箱中備用。

1.3?配子體克隆系預(yù)處理

取適量配子體（編號(hào)019601018）克隆團(tuán)，用智能型超聲波細(xì)胞粉碎儀（型號(hào)JYD-650，上海之信儀器有限公司）進(jìn)行細(xì)胞粉碎。粉碎機(jī)實(shí)際功率為250～300 W，超聲時(shí)長(zhǎng)6 s，超聲次數(shù)4次，每次間隔時(shí)間5 s。粉碎的細(xì)胞液用孔徑38 μm的篩絹過(guò)濾至消毒的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿放置在低溫弱光［4～8 ℃、1～2 μmol/（m2·s）］條件下靜置培養(yǎng)1周，備用。

1.4?海帶孢子的獲得

選取成熟度好的種海帶，剪下長(zhǎng)有孢子囊的小塊，經(jīng)沖洗、擦拭、消毒處理，加低溫海水，大量放散游孢子后，將經(jīng)孔徑38 μm篩絹過(guò)濾的游孢子液倒入各培養(yǎng)皿中，使孢子附著于培養(yǎng)皿底部。

1.5?冷凍保護(hù)劑對(duì)海帶配子體的毒性影響

1.3中所述預(yù)處理的配子體細(xì)胞經(jīng)1周靜置培養(yǎng)后得以恢復(fù)，且附著于培養(yǎng)皿底部。將培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液倒掉，加入事先預(yù)冷的各組冷凍保護(hù)劑，作為試驗(yàn)組；以未添加冷凍保護(hù)劑的海水培養(yǎng)組作為對(duì)照組；每組均設(shè)3個(gè)平行。所有處理組均在0～4 ℃條件下分別處理30 min、60 min、24 h，結(jié)束后更換普通海水培養(yǎng)液，然后統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的存活率。每組計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)存活細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.6?冷凍保護(hù)劑對(duì)海帶孢子的毒性影響

當(dāng)1.4中所述的培養(yǎng)皿底部附著的孢子達(dá)到一定密度時(shí)，倒凈孢子液，重新加入事先預(yù)冷的低溫冷凍保護(hù)液，在0～4 ℃條件下分別處理15、30、60 min。處理結(jié)束后，在保證孢子體附著的前提下，用海水培養(yǎng)液沖洗10次以上，以最大程度減少冷凍保護(hù)劑的殘留。所有處理組均添加普通海水培養(yǎng)液，放置在溫度8～10 ℃、光強(qiáng)22～24 μmol/（m2·s）、光周期12（L）：12（D）（即光照時(shí)間和黑暗時(shí)間各為12 h）條件下培養(yǎng)，88 h后統(tǒng)計(jì)配子體發(fā)生率（即胚孢子體萌發(fā)成配子體的比例）。配子體發(fā)生率即細(xì)胞內(nèi)含物集中于萌發(fā)管頂端的細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)的百分比。每個(gè)處理組計(jì)數(shù)細(xì)胞200個(gè)。

1.7?統(tǒng)計(jì)分析

采用雙因子方差分析檢驗(yàn)不同保護(hù)劑和處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)配子體存活率和孢子的配子體發(fā)生率的影響，采用相同冷凍保護(hù)劑、在相同處理時(shí)長(zhǎng)下進(jìn)行單因子方差分析（one-way ANOVA），并采用Duncans方法進(jìn)行差異顯著性分析。用Levens-test進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，必要時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化。設(shè)P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 19.0軟件完成。

2?結(jié)果

2.1?冷凍保護(hù)劑對(duì)海帶配子體的毒性評(píng)價(jià)

冷凍保護(hù)劑的類型、處理時(shí)長(zhǎng)及兩者的交互作用均對(duì)配子體成活率有顯著的影響（見(jiàn)表2）。冷凍保護(hù)劑種類的偏Eta2值（0.980）>處理時(shí)長(zhǎng)的偏Eta2值（0.855）>保護(hù)劑種類×處理時(shí)長(zhǎng)的偏Eta2值（0.578），表明這3個(gè)因素對(duì)海帶配子體存活率的影響效應(yīng)為：保護(hù)劑種類>處理時(shí)長(zhǎng)>兩者的交互作用。

不同冷凍保護(hù)劑及不同處理時(shí)長(zhǎng)下配子體的成活率見(jiàn)表3。從表3可以看出，除10%乙二醇和10%甘油外，用其他冷凍保護(hù)劑處理24 h后，配子體的成活率顯著低于處理30、60 min的（P＜0.05）。10%甘油組處理24 h的成活率也顯著低于處理30 min的（P＜0.05）。用10%乙二醇和10% DMSO處理30 min以及用10% DMSO處理60 min，配子體的存活率均為100%。在相同處理時(shí)長(zhǎng)下，含有10%甘油的單一或復(fù)合冷凍保護(hù)劑對(duì)配子體細(xì)胞的毒性作用較大，配子體細(xì)胞的成活率均低于45%，顯著低于其他單一冷凍保護(hù)劑組（P＜0.05）。

2.2?冷凍保護(hù)劑對(duì)海帶孢子的毒性評(píng)價(jià)

冷凍保護(hù)劑的類型、處理時(shí)長(zhǎng)及兩者的交互作用均對(duì)孢子萌發(fā)配子體的形成率有顯著的影響（見(jiàn)表4）。冷凍保護(hù)劑種類的偏Eta2值（0.979）>處理時(shí)長(zhǎng)的偏Eta2值（0.891）>保護(hù)劑種類×處理時(shí)長(zhǎng)偏Eta2值（0.787），表明這3個(gè)因素對(duì)孢子萌發(fā)配子體的影響效應(yīng)為：保護(hù)劑種類>處理時(shí)長(zhǎng)>兩者的交互作用。孢子經(jīng)不同冷凍保護(hù)劑處理不同時(shí)間后，在溫度8～10 ℃、光強(qiáng)22～24 μmol/（m2·s）的條件下培養(yǎng)88 h，其配子體發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。

從表5可以看出，除10% DMSO、10%乙二醇和 10%DMSO+10%甘油+8%葡萄糖組外，其他冷凍保護(hù)劑組處理60 min后，配子體發(fā)生率顯著低于15 min和30 min時(shí)，前兩種在30、60 min間差異不顯著。10%甘油處理15 min后，配子體發(fā)生率顯著高于處理30 min（P＜0.05），其他單一冷凍保護(hù)劑處理15 min和30 min時(shí)的配子體發(fā)生率差異不顯著（P＞0.05）。單一冷凍保護(hù)劑組配子體發(fā)生率顯著高于復(fù)合冷凍保護(hù)劑組，除10%甘油的30、60 min 2個(gè)試驗(yàn)組外，其他單一冷凍保護(hù)劑試驗(yàn)組的配子體發(fā)生率均在60%～80%。

3?討論

3.1?冷凍保護(hù)劑對(duì)海帶配子體的毒性評(píng)價(jià)

抗凍保護(hù)劑的應(yīng)用在超低溫保存技術(shù)的發(fā)展中具有里程碑作用，能有效減少超低溫保存時(shí)冷凍對(duì)細(xì)胞造成的損傷。但多數(shù)保護(hù)劑對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，毒性大小與使用濃度及處理時(shí)間有關(guān)［15-16］。在藻類種質(zhì)冷凍保存中，最常用的保護(hù)劑是二甲基亞砜（DMSO）、甘油和甲醇，其中DMSO的使用最為普遍。Zhang等［17］研究發(fā)現(xiàn)，DMSO是對(duì)海帶配子體毒性最小的抗凍保護(hù)劑，它可以快速滲透到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用。本研究也得出了相似的結(jié)論。本試驗(yàn)中采用的冷凍保護(hù)劑均對(duì)海帶配子體細(xì)胞有一定的毒性作用，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其毒性作用隨之增強(qiáng)，其中10%DMSO對(duì)配子體細(xì)胞毒性最小，處理60 min，配子體細(xì)胞的存活率為100%，處理24 h，配子體細(xì)胞的存活率在70%以上。

3.2?冷凍保護(hù)劑對(duì)海帶孢子的毒性評(píng)價(jià)

曲善村［14］研究了海帶游（胚）孢子超低溫保存技術(shù)，發(fā)現(xiàn)DMSO、甘油、蔗糖、葡萄糖及山梨醇對(duì)海帶孢子均有毒性，其中DMSO是對(duì)孢子毒性最小且對(duì)凍存最有效的抗凍保護(hù)劑，采用5% DMSO平衡50 min以內(nèi)，10% DMSO或甘油平衡15 min以內(nèi)，均可獲得70%以上的配子體發(fā)生率。本研究也得出了相似的結(jié)論。試驗(yàn)中所使用的冷凍保護(hù)劑均對(duì)孢子有一定的毒害作用，不僅影響了孢子的配子體發(fā)生率，而且延緩了配子體發(fā)生。采用10% DMSO、10%蔗糖、10%乙二醇處理海帶孢子60 min以內(nèi)，可獲得60%以上的配子體發(fā)生率。經(jīng)復(fù)合保護(hù)劑處理的孢子萌發(fā)成配子體的百分比顯著低于單一保護(hù)劑，說(shuō)明復(fù)合保護(hù)劑對(duì)海帶孢子的毒性高于單一抗凍保護(hù)劑。此結(jié)果與在某些微藻、紫菜、萱藻等的研究［18-23］中得出的結(jié)果有所差異。在這些藻類的超低溫保存中，使用復(fù)合保護(hù)劑比單一保護(hù)劑的效果好，復(fù)合保護(hù)劑可以減輕或消除單一保護(hù)劑成分對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒害作用，而且各種保護(hù)劑的作用可以相互協(xié)調(diào)，共同作用。

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Abstract： In order to screen the cryoprotectants of ultra-low temperature preservation of kelp，nine single or compound cryoprotectants including 10% Dimethyl sulfoxide（DMSO），10% glycerol，10% sucrose，10% ethylene glycol，10% DMSO+10% glycerol，10% DMSO+8% glucose，10% DMSO+10% sucrose，10% DMSO+10% glycerol+8% glucose，and 10% DMSO+10% sorbitol were used to treat the gametophytes and spores of kelp for 30?min，60 min，24 h and 15?min，30 min，60?min，respectively，at 0-4 ℃.The toxicity of different cryoprotectants was evaluated by calculating the survival rate of gametophyte cells and the proportion of spores germination.The results showed that all the 9 cryoprotectants had certain toxic effects on gametophytes and spores of S. japonica，and the toxicity increased with the extension of treatment time.The toxicity of 10% DMSO to gametophytic cells was minimal，and the survival rate of was 100% after 60 min treatment，followed by 10% ethylene glycol.The survival rate of gametophyte treated with single or compound cryoprotectant containing 10% glycerol was significantly lower than that of DMSO and ethylene glycol groups（P<0.05）.The toxicity of single cryoprotectant was significantly lower than that of compound cryoprotectant，the incidence of gametophyte treated with single cryoprotectant was 60%-80% except 10% glycerol group treated for 30 min，60?min.

Key words： Sacchatina japonica; gametophyte; spore; cryoprotectant; toxicity

作者簡(jiǎn)介：錢瑞（1979—），女，工程師，研究方向?yàn)榇笮秃Ｔ宸N質(zhì)資源保存及遺傳育種。E-mail：359148694@qq.com。

通信作者：陳書秀（1983—），女，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)楹Ｔ宸N質(zhì)資源保存及遺傳育種。E-mail：chenshuxiu124@163.com

項(xiàng)目資助：山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重大科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（2022LZGC004）;財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 （CARS- 50）;山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目（2021LZGC004）;國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“藍(lán)色糧倉(cāng)科技創(chuàng)新”重點(diǎn)專項(xiàng)（2018YFD0901500）;山東省現(xiàn)代?農(nóng)業(yè)藻類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（SDAIT-26）;煙臺(tái)市校地融合發(fā)展項(xiàng)目。