張小明 安偉 張明輝

摘?要：為進(jìn)一步掌握上海地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）病原的流行趨勢(shì)及特點(diǎn)，定期對(duì)上海主養(yǎng)區(qū)的凡納濱對(duì)蝦開(kāi)展了8種流行病病原監(jiān)測(cè)及分析工作。51份樣品的分子檢測(cè)和細(xì)菌分離鑒定結(jié)果顯示，有4種病原檢測(cè)出陽(yáng)性，其中虹彩病毒1（DIV1）陽(yáng)性檢出率為29.41%，傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）為3.92%，致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌（VpAHPND）為1.96%，副溶血弧菌（Vp）為19.61%；而白斑綜合征病毒（WSSV）、桃拉綜合征病毒（TSV）、偷死野田村病毒（CMNV）、蝦肝腸胞蟲(chóng)（EHP）等4種病原未檢出。408項(xiàng)病原檢測(cè)結(jié)果中，4種病原的陽(yáng)性總樣本數(shù)量為28份，總體陽(yáng)性率為6.86%。結(jié)果表明，上海地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦的病原攜帶率處于較低水平，DIV1、副溶血弧菌（Vp）是攜帶的主要病原。在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)病原流行特點(diǎn)，從苗種選購(gòu)、養(yǎng)殖過(guò)程管理、藥物選用等方面進(jìn)行綜合防控，減少病害發(fā)生。

關(guān)鍵詞：凡納濱對(duì)蝦；十足目虹彩病毒1（DIV1）；致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌（VpAHPND）；副溶血弧菌（Vp）；傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）；蝦肝腸胞蟲(chóng)（EHP）

凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對(duì)蝦，原產(chǎn)于南美洲太平洋沿岸，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、肉味鮮美、適應(yīng)鹽度范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種［1］。但近年來(lái)，在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中常常暴發(fā)流行性疾病，如急性肝胰腺壞死?。?］、蝦虹彩病毒?。?］、白斑綜合征［3］、桃拉綜合征［4］、傳染性皮下及造血組織壞死病［5］、偷死野田村病［6］和蝦肝腸胞蟲(chóng)?。?］等，導(dǎo)致養(yǎng)殖產(chǎn)量嚴(yán)重下滑，對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。

蝦虹彩病毒病是一種感染甲殼類(lèi)的急性、傳染性疾病，病原為十足目虹彩病毒1（DIV1），簡(jiǎn)稱虹彩病毒，患病的凡納濱對(duì)蝦表現(xiàn)為空腸空胃、肝胰腺萎縮、顏色變淺、停止攝食、活力下降等癥狀。DIV1病毒2014年首次在浙江某養(yǎng)殖場(chǎng)的凡納濱對(duì)蝦中被發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)，已陸續(xù)在羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus）等蝦類(lèi)體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，其傳播速度快，宿主范圍廣、致死率高，給我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［8］。傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）可感染世界各地的養(yǎng)殖對(duì)蝦，感染凡納濱對(duì)蝦后會(huì)引起慢性“矮小殘綜合癥”，患病對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢，畸形，受感染的對(duì)蝦終生攜帶病毒，并進(jìn)行垂直和水平傳播［9］?；【鷮儆跅l件性致病菌，在條件適宜的情況下，弧菌病具有流行廣、發(fā)病率高、危害大、死亡率高等特點(diǎn)。安偉等［10］的研究結(jié)果顯示，上海凡納濱對(duì)蝦主養(yǎng)區(qū)以副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）誘發(fā)的疾病為主，其中以急性肝胰腺壞死?。ˋHPND）的危害最為嚴(yán)重。該病的病原菌主要是攜帶pirAvp和pirBvp基因的變種副溶血弧菌（VpAHPND），患病的對(duì)蝦攝食減少，空腸空胃，肝胰腺萎縮、發(fā)白，蝦殼松軟，死亡率高達(dá)90%以上［1］。弧菌病已給多國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。普通副溶血弧菌（Vp）雖然沒(méi)有變種弧菌引起的危害嚴(yán)重，但仍能引起一些對(duì)蝦發(fā)病，需加強(qiáng)病原監(jiān)測(cè)。

凡納濱對(duì)蝦是上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要品種，2022年養(yǎng)殖面積約2 738.87 hm2，主要集中在奉賢區(qū)、金山區(qū)等郊區(qū)［11］。近年來(lái)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)因病害造成的經(jīng)濟(jì)損失以凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖最為嚴(yán)重，病害問(wèn)題是凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)過(guò)程中的突出問(wèn)題。因此，加強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)的流行病病原監(jiān)測(cè)，及時(shí)、準(zhǔn)確地掌握和診斷病原攜帶情況，盡快采取有效應(yīng)對(duì)措施是保證對(duì)蝦健康和生態(tài)養(yǎng)殖的關(guān)鍵。為掌握上海地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦主要流行病病原的攜帶情況，本研究于2022年3月—2023年3月，定期對(duì)上海主養(yǎng)區(qū)的凡納濱對(duì)蝦開(kāi)展Vp、Vp AHPND、DIV1、白斑綜合征病毒（WSSV）、桃拉綜合征病毒（TSV）、IHHNV、偷死野田村病毒（CMNV）、蝦肝腸胞蟲(chóng)（EHP）等8種病原的監(jiān)測(cè)及分析，以期為上海地區(qū)蝦病防控、健康養(yǎng)殖提供參考，為制定科學(xué)合理的防控對(duì)策提供依據(jù)。

1?材料和方法

1.1?主要試劑

TaKaRa miniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0（9766）提取試劑盒、PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）、PCR Premix Taq、DNA Marker均購(gòu)自寶生生物工程（大連）有限公司；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（TCBS）、3%堿性蛋白胨水均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司。

1.2?樣品采集

2022年3月—2023年3月，定期采集上海郊區(qū)的3個(gè)凡納濱對(duì)蝦主養(yǎng)區(qū)（A、B、C）的5個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)（a、b、c、d、e）養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦，從放苗到養(yǎng)殖過(guò)程中持續(xù)采樣，共采集51份樣品，其中A區(qū)16份，B區(qū)31份，C區(qū)4份。按照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的抽樣比例［12］，隨機(jī)抽取一定數(shù)量的凡納濱對(duì)蝦樣品，每批次樣品不少于150尾。一部分樣品用95%乙醇固定保存，用于后續(xù)的分子檢測(cè)；一部分活體樣品則運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室用于弧菌的分離鑒定。

1.3?副溶血弧菌（Vp）的分離、鑒定及保存

采用平板分離方法：無(wú)菌剖取肝胰臟，取1 g組織混樣置于10 mL的3%堿性蛋白胨水中，30 ℃培養(yǎng)18 h后，分別在TCBS培養(yǎng)板上劃線培養(yǎng)，18～24 h后觀察菌落特征。

挑取具有典型弧菌特征的單菌落，接種到TSA培養(yǎng)平板上劃線培養(yǎng)18～24 h，用無(wú)菌接種環(huán)挑取單菌落，接種到3 mL滅菌的0.45%生理鹽水，最終配成菌液濃度在0.50～0.64麥?zhǔn)隙群螅儆肰ITEK2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行分析鑒定。

將已鑒定的副溶血弧菌（Vp）單菌落再次純化，接種到3%堿性蛋白胨水中增菌培養(yǎng)18～24 h，用甘油（最終體積分?jǐn)?shù)為20%）于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4?病原的分子檢測(cè)

1.4.1?核酸提取

取50 mg蝦組織勻漿液，參照RNA/DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行核酸提取，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2?PCR檢測(cè)

以提取的DNA或RNA為模板，分別進(jìn)行PCR檢測(cè)。DIV1、WSSV、IHHNV、EHP和VpAHPND的PCR反應(yīng)體系為25.0 μL：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，無(wú)菌ddH2O 8.5 μL，設(shè)置ddH2O為陰性對(duì)照模板。套式PCR以第一輪PCR產(chǎn)物為模板加1.0 μL。

TSV和CMNV的PCR反應(yīng)體系為25.0 μL：2×1 Step Buffer 12.5 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，上、下游引物各1.0 μL，RNA模板2.0 μL，無(wú)菌ddH2O 7.5 μL。套式PCR反應(yīng)體系：Premix Taq 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，第一輪PCR產(chǎn)物模板1.0 μL，無(wú)菌ddH2O 8.5 μL。檢測(cè)7種病原的引物和方法具體見(jiàn)表1，文獻(xiàn)中的引物與國(guó)標(biāo)引物相同。

反應(yīng)結(jié)束后，取6 μL產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并在凝膠成像系統(tǒng)拍照。PCR陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

2?結(jié)果與分析

2.1?檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)PCR檢測(cè)分析，2022年3月—2023年3月采集的51份凡納濱對(duì)蝦樣品中，攜帶DIV1病毒的15份（見(jiàn)圖1），攜帶VpAHPND的1份（見(jiàn)圖2），攜帶IHHNV的2份，陽(yáng)性檢出率分別為29.41%、1.96%、3.92%。WSSV、TSV、CMNV、EHP等4種病原未檢出；經(jīng)平板劃線分離到副溶血弧菌（Vp）10株，陽(yáng)性檢出率為19.61%。

8種流行病的408項(xiàng)病原檢測(cè)結(jié)果顯示，DIV1、IHHNV、VpAHPND 和Vp這4種病原的陽(yáng)性總樣本數(shù)量為28份，總體陽(yáng)性率為6.86%。其中DIV1陽(yáng)性率占比最高，為29.41%，Vp次之，為19.61%，VpAHPND和IHHNV陽(yáng)性率較低，分別為1.96%和3.92%；其余4種病原未檢出（見(jiàn)表2）。

2.2?不同區(qū)域檢測(cè)情況

從51份凡納濱對(duì)蝦樣品的病原攜帶情況分析，養(yǎng)殖場(chǎng)a、b主要攜帶DIV1和Vp，養(yǎng)殖場(chǎng)c主要攜帶DIV1和VpAHPND，養(yǎng)殖場(chǎng)d主要攜帶DIV1，養(yǎng)殖場(chǎng)e攜帶DIV1和IHHNV。5個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)同時(shí)攜帶DIV1，而僅在1個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的1份樣品中檢測(cè)到VpAHPND，另1個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的2份樣品中檢測(cè)到IHHNV（見(jiàn)圖3）。從3個(gè)主養(yǎng)區(qū)的病原攜帶情況分析，A區(qū)主要攜帶DIV1和Vp ，B區(qū)主要攜帶DIV1、Vp和VpAHPND，C區(qū)主要攜帶DIV1和IHHNV（見(jiàn)圖4）。3個(gè)主養(yǎng)區(qū)域同時(shí)攜帶有DIV1。

3?討論

隨著集約化養(yǎng)殖方式的發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大、密度增加，凡納濱對(duì)蝦面臨的細(xì)菌病和病毒病威脅越來(lái)越嚴(yán)重。多種病毒病具有傳播速度快、發(fā)病率高、致死率高等特點(diǎn)［13］，給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室多次在上海地區(qū)的對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)中檢測(cè)到DIV1和副溶血弧菌［10］。本研究于2022年3月至2023年3月對(duì)上海市3個(gè)主養(yǎng)區(qū)采集的51批次樣品進(jìn)行副溶血弧菌分離，DIV1、WSSV、TSV、IHHNV、CMNV、EHP、VpAHPND等病原檢測(cè)，8種病原的陽(yáng)性總檢出率為6.86%。其中TSV未檢出，這與施慧等［14］于2009—2010年對(duì)浙江地區(qū)凡納濱對(duì)蝦苗種場(chǎng)調(diào)查的結(jié)果以及王筱珊等［15］于2015—2016年在江蘇地區(qū)調(diào)查的結(jié)果相一致。自2009年起全國(guó)多地均未檢測(cè)到TSV，表明桃拉綜合征病毒在我國(guó)多地已得到了有效控制。WSSV和EHP未檢出，IHHNV的檢出率為3.92%，這一結(jié)果與鄭曉葉等［13］報(bào)道的浙江省凡納濱對(duì)蝦苗種WSSV檢出率為1.55%、EHP檢出率為31.78%、IHHNV檢出率為20.93%的結(jié)果，以及王筱珊等［15］報(bào)道的江蘇地區(qū)對(duì)蝦WSSV檢出率17.20%、IHHNV檢出率39.48%的結(jié)果存在差異，表明WSSV、EHP、IHHNV在不同地區(qū)的攜帶情況存在差異，也有可能是因?yàn)?022年3—5月上海市因疫情防控，物品、人員和蝦苗流動(dòng)較少，而6—8月平均氣溫高，進(jìn)一步降低了病原的傳播。李小平等［6］對(duì)河北、山東、浙江、福建、廣東和海南等地區(qū)對(duì)蝦的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，2016、2017年CMNV在對(duì)蝦中的陽(yáng)性檢出率分別為26.8%和16.3%。本研究未檢測(cè)到CMNV，表明CMNV在不同地區(qū)的攜帶情況不同，可能在上海地區(qū)的攜帶率較低。TSV和CMNV都是RNA病毒，容易發(fā)生變異，變異后的病毒用OIE規(guī)定的引物無(wú)法檢出，抑或是目前這兩種病毒攜帶率低？究竟是什么原因造成的檢出率低，目前尚無(wú)法定論。

孫衛(wèi)芳等［16］對(duì)廣東沿海地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，VpAHPND攜帶率為2.38%，與本研究VpAHPND攜帶率為1.96%的檢測(cè)結(jié)果基本一致，說(shuō)明上海地區(qū)VpAHPND的攜帶率較低。本研究通過(guò)平板分離到副溶血弧菌10株，副溶血弧菌的檢出率為19.61%，而安偉等［10］于2014—2016年對(duì)上海市凡納濱對(duì)蝦主養(yǎng)區(qū)52株不同來(lái)源弧菌的分析鑒定結(jié)果，副溶血弧菌占比達(dá)57.7%，這表明通過(guò)持續(xù)的技術(shù)指導(dǎo)和養(yǎng)殖戶病害防治意識(shí)的提高，目前上海地區(qū)副溶血弧菌的檢出率已呈逐年下降的趨勢(shì)。高曉華等［1］對(duì)從上海某養(yǎng)殖場(chǎng)患病凡納濱對(duì)蝦分離到的一株副溶血弧菌的研究發(fā)現(xiàn)，該菌株對(duì)氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾沙星等藥物敏感，這一結(jié)果可為副溶血弧菌的藥物防控提供參考。

鄭曉葉等［13］通過(guò)對(duì)浙江省4個(gè)地區(qū)凡納濱對(duì)蝦苗種場(chǎng)的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，DIV1病原陽(yáng)性檢出率為37.21%。本研究中，DIV1的檢出率為29.41%，并且是在3個(gè)主養(yǎng)區(qū)的5家養(yǎng)殖場(chǎng)同時(shí)檢測(cè)到，說(shuō)明不同地區(qū)的DIV1攜帶率均相對(duì)較高。近年來(lái)DIV1在全國(guó)呈一定的流行趨勢(shì)，在上海地區(qū)也有一定的傳播風(fēng)險(xiǎn)。不過(guò)由于DIV1的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法為套式PCR，檢出的15個(gè)陽(yáng)性均為第二輪PCR檢出，表明病毒攜帶量較低。針對(duì)陽(yáng)性批次，本實(shí)驗(yàn)室及時(shí)對(duì)相關(guān)養(yǎng)殖場(chǎng)開(kāi)展了預(yù)防控制技術(shù)指導(dǎo)，并持續(xù)進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，后續(xù)在凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖周期內(nèi)基本未出現(xiàn)DIV1暴發(fā)情況。

目前尚無(wú)關(guān)于DIV1的防控措施的相關(guān)報(bào)道，也缺乏有效藥物治療的研究。有研究表明，調(diào)控養(yǎng)殖水溫可以作為預(yù)防DIV1的措施之一，當(dāng)水溫在（24.6±3.3）℃時(shí)，有利于DIV1病毒增殖，從而誘發(fā)疾病發(fā)生［17］。當(dāng)養(yǎng)殖水溫在16～32 ℃時(shí)，可在對(duì)蝦體內(nèi)檢測(cè)到DIV1，而當(dāng)水溫高于32 ℃時(shí)則不能檢出［18-19］。繩秀珍等［8］建議要做好放養(yǎng)前的池塘消毒工作，避免污染源進(jìn)入，同時(shí)應(yīng)投放品種優(yōu)良、抗性良好的SPF蝦苗，并采用合理的養(yǎng)殖密度等來(lái)預(yù)防疾病發(fā)生。作為新的病原，目前DIV1病毒的生物學(xué)特性、感染宿主的分子機(jī)制及宿主的應(yīng)答機(jī)制等還有待進(jìn)一步研究，對(duì)病害的防控具有一定難度。

本研究結(jié)果顯示，上海地區(qū)養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦的病原攜帶率處于較低水平，說(shuō)明各養(yǎng)殖場(chǎng)在蝦苗引進(jìn)質(zhì)量控制、強(qiáng)化苗種檢疫及建立綠色健康養(yǎng)殖模式等方面取得了一定的成效，虹彩病毒、副溶血弧菌是上海主養(yǎng)區(qū)凡納濱對(duì)蝦攜帶的主要病原，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)病原流行特點(diǎn)，從苗種選購(gòu)、養(yǎng)殖過(guò)程管理、藥物選用等方面進(jìn)行防控，采取綜合防控措施來(lái)減少病害的發(fā)生。

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Abstract： In order to further understand the epidemic trend and characteristics of Litopenaeus vannamei in Shanghai，the epidemiological surveillance and analysis of 8 kinds of epidemic pathogens were carried out regularly.The results of molecular detection and bacterial isolation and identification of 51 samples showed that 4 kinds of pathogens were detected positive，and the positive detection rates were 29.41% for decapod iridescent virus 1（DIV1），3.92% for infectious hypodermic and hematopoietic necrosis virus（IHHNV），1.96% for Vibrio parahaemolyticus acute hepatopancreatic necrosis disease（VpAHPND），19.61% for Vibrio parahaemolyticus（Vp）.However，White spot syndrome virus（WSSV），Taura syndrome virus（TSV），covert mortality nodavirus（CMNV） and Enterocytozoon hepatopenaei（EHP） were not detected.Among the 408 pathogen detection results，the total positive number of 4 pathogens were 28 and the total positive rate was 6.86%.The results showed that the pathogen carrying rate of L. vannamei cultured in Shanghai was at a low level，and DIV1 and V.parahaemolyticus were the main pathogens.According to the epidemic characteristics of pathogens，comprehensive prevention and control should be carried out from shrimp larvae selection，farming process management and drug selection to reduce the occurrence of diseases.

Key words： Litopenaeus vannamei; decapod iridescent virus 1（DIV1）; Vibrio parahaemolyticus acute hepatopancreatic necrosis disease（VpAHPND）; Vibrio parahaemolyticus（Vp）; infectious hypodermic and hematopoietic necrosis virus（IHHNV）; Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）

作者簡(jiǎn)介：張小明（1990—），男，助理工程師，研究方向?yàn)樗镆卟》揽?。E-mail： xmzhangwork@163.com

通信作者：張明輝（1978—），男，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)樗镆卟》揽亍-mail： mhzhang0907@163.com

項(xiàng)目資助：上海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系［滬農(nóng)科產(chǎn)字（2022）第5號(hào)］。