張珂　于欣淼　彭星瑞

摘要 ［目的］分析并預測雞Myf5蛋白的結構與生物學功能。［方法］采用ProtParam、ProtScale、SingnalP-4.1、STRING等軟件對雞Myf5蛋白的序列結構及互作蛋白進行分析。［結果］該蛋白由258個氨基酸構成，分子式為C1221H1915N359O391S18，氨基酸殘基中帶負電荷的（Asp+Glu）共有34個，氨基酸殘基中帶正電荷的（Arg+Lys）共有29個；理論等電點（pI）為5.86，半衰期為30 h，不穩(wěn)定性指數(shù)為97.59（>40）；親水性平均值（GRAVY）為-0.701，脂溶指數(shù)為54.92；其二級結構主要以無規(guī)則卷曲為主，占比63.57%，其次為α-螺旋，占比29.84%；該蛋白定位于細胞核中，不具備跨膜性，共有74個潛在的磷酸化位點，無信號肽，為親水性不穩(wěn)定蛋白。蛋白互作分析結果顯示，雞Myf5關聯(lián)的蛋白有PAX7、PAX3、SOX10、MYOD1、MYOG和SDC4，進化分析結果顯示不同物種間該蛋白序列具有較高的保守性。［結論］該蛋白可能在雞肌肉的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，為進一步探索其功能奠定基礎。

關鍵詞 雞；成肌因子5；生物信息學分析

中圖分類號 S 814文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2023）15-0093-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.15.022

Bioinformatics Analysis of the Protein Structure and Function of Chicken Myf5

ZHANG Ke， YU Xin-miao， PENG Xing-rui

（College of Life Science and Bioengineering， Shenyang University， Shenyang， Liaoning 110044）

Abstract ［Objective］The study aimed to analyze and predict the structure and biological function of chicken Myf5. ［Method］The structure of sequence and interacting protein of chicken Myf5 were analyzed by ProtParam， ProtScale， SingNALP-4.1， STRING and other softwares. ［Result］The protein was composed of 258 amino acids with the molecular formula of C1221H1915N359O391S18. There were 34 negatively charged amino acid residues （Asp+Glu） and 29 positively charged amino acid residues （Arg+Lys）. The theoretical isoelectric point （pI） was 5.86， the half-life was 30 h， and the instability index was 97.59 （>40）. The average value of GRAVY was -0.701 and the lipid solubility index was 54.92. The secondary structure of this protein is mainly random coil， accounting for 63.57%， followed by α-helix， accounting for 29.84%. The protein is localized in the nucleus， whicn has 74 potential phosphorylation sites without transmembrane property and signal peptide. It is a hydrophilic unstable protein. Protein interaction analysis showed that chicken Myf5 was associated with PAX7， PAX3， SOX10， MYOD1， MYOG and SDC4. Evolutionary analysis showed that the sequence of this protein was highly conserved among different species. ［Conclusion］This protein may play an important role in the growth and development of chicken muscle， laying a foundation for further exploration of its function.

Key words Chicken;Myf5;Bioinformatics analysis

生肌因子5（myofactor-5，Myf5）是肌肉發(fā)生調控因子（muscleregulatoryfactors，MRFs）家族成員之一。該家族又被稱為成肌細胞的增值和分化生肌決定因子家族，在骨骼肌生長和發(fā)育以及骨骼肌細胞分化發(fā)育和增殖過程中發(fā)揮著至關重要的作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)，在MRFs家族成員中，MYF5和MYOD在分化早期發(fā)揮作用，而MYOG和MRF4在分化后期發(fā)揮作用［2-4］。在小鼠胚胎發(fā)生過程中，MYF5是第一個被表達的肌源性轉錄因子，并決定著哺乳動物肌源性發(fā)育的開始［5］。MYF5占據(jù)肌肉特異性基因的啟動子區(qū)域，促進成纖維細胞向成肌細胞轉化。此外，MYF5可以穩(wěn)定染色質的開放狀態(tài)，促進肌生成素的表達［6］。除哺乳動物以外，在禽類中開展的相關研究發(fā)現(xiàn)Myf5基因同樣在骨骼肌組織生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用。鴨胸肌以及腿肌中Myf5基因的表達具有組織特異性。在鴨胚發(fā)育過程中，胸部肌肉組織和腿部肌肉組織中Myf5基因的表達量分別在27胚齡及14胚齡時達到峰值［7］。此外，雞Myf5基因外顯子1上的2個SNP位點的單倍型組合被證實與雞的活體重量、屠體重量、胸肌重量、腿肌重量、肌纖維密度和肌纖維直徑都具有顯著相關關系（P<0.05）［1］。為了進一步闡明雞Myf5基因調控骨骼肌細胞分化發(fā)育與增殖的作用機制，筆者對雞Myf5基因進行生物信息學分析并進行功能預測，旨在為深入研究雞Myf5基因的作用機理和表達調控機制奠定基礎，進而為肉雞生長性狀的改良提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

通過美國國家生物信息中心（NCBI，National center of biotechnology information）取得雞等11種動物的Myf5基因的mRNA序列和蛋白質序列以及相關信息。

1.2 方法

該研究所進行的生物信息學分析內容及所用到的軟件見表1。

2 結果與分析

2.1 雞Myf5蛋白理化性質

利用ProtParam在線軟件預測雞Myf5蛋白理化性質，對雞的Myf5蛋白各氨基酸的數(shù)量及百分含量進行分析。該蛋白共包含258個氨基酸，其中絲氨酸（Ser）含量最多，達12.4%；脯氨酸（Pro）次之，含量為10.9%；除吡咯賴氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸為0外，色氨酸（Trp）含量最少，僅0.8%。肽鏈N-端為蛋氨酸（Met），氨基酸殘基中帶負電荷的（Asp+Glu）共有34個，帶正電荷的（Arg+Lys）共有29個（表2）。Myf5蛋白分子式為CC1221H1915N359O391S18，分子質量為28 456.89 Da，由3 904個原子構成，理論等電點（pI）為5.86，半衰期為30 h，不穩(wěn)定性指數(shù)為97.59（>40），表明該蛋白結構極不穩(wěn)定；親水性平均值（GRAVY）為-0.701，脂溶指數(shù)為54.92，說明雞Myf5蛋白屬于親水性蛋白。

2.2 雞Myf5蛋白二級結構及三級結構預測

利用SOPMA在線軟件預測雞Myf5蛋白二級結構。結果顯示，雞Myf5蛋白有無規(guī)則卷曲164個，占比63.57%，有β-轉角8個，占比3.10%，有延伸鏈9個，占比3.49%，有α-螺旋77個，占比29.84%（圖1）。

利用SWISS-MODEL在線軟件以1mdy.1.C為模板推測并建立了雞Myf5的三級結構，結果見圖2。

2.3 雞Myf5蛋白亞細胞定位和跨膜結構域預測

采用ProtCompv 9.0在線軟件對雞Myf5蛋白進行亞細胞定位預測及分析。綜合數(shù)值結果分析，該蛋白定位于細胞核的分值9.99，定位于高爾基體分值0.01，表明雞Myf5蛋白大概率定位在細胞核中。利用TMHMM Server v.2.0在線軟件對雞Myf5蛋白跨膜區(qū)進行預測，發(fā)現(xiàn)該蛋白不存在跨膜結構（圖3）。

2.4 雞Myf5蛋白磷酸化位點和信號肽預測

通過NetPhos 3.1 Server在線軟件分析，并預測雞Myf5蛋白的磷酸化位點，結果見圖4。分析結果顯示，雞Myf5蛋白共有74個潛在的磷酸化位點，其中絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）磷酸化位點分別為54、16和4個。通過SingnalP-4.1軟件及雞Myf5的蛋白質序列對Myf5信號肽進行分析和預測，結果顯示，雞Myf5蛋白內不存在信號肽序列（圖5）。

2.5 雞Myf5蛋白親／疏水性預測

使用ProtScale工具分析雞Myf5蛋白的親/疏水性。分析結果可知，雞Myf5蛋白分子疏水性最強位置為210位的亮氨酸（Leu），得分為1.433；親水性最強位置是96位的精氨酸（Arg），得分為-2.622。此外，雞Myf5蛋白疏水性區(qū)域（正分值）明顯少于親水性區(qū)域（負分值）。表明該蛋白為親水性蛋白，進而可以推測該蛋白為可溶性蛋白（圖6）。

2.6 雞Myf5蛋白互作分析

為了進一步預測雞Myf5蛋白發(fā)揮其生物學作用的可能機制，運用STRING在線軟件對Myf5進行蛋白互作分析。分析結果顯示，與雞Myf5關聯(lián)的蛋白有PAX7、PAX3、SOX10、MYOD1、MYOG和SDC4。STRING分析表明，Myf5與PAX7的相關性評分為0.963，與PAX3的相關性評分為0.958（圖7）。

2.7 物種間Myf5蛋白序列同源性及進化性分析

利用ClustalW在線軟件對雞等11個物種的Myf5蛋白氨基酸序列進行了多重比對并分析其相似性。相似性比對結果表明，雞Myf5蛋白氨基酸序列與智人、山羊、牛、豬、狗、家鼠、馬、鴨和斑馬魚、綿羊的相似性分別為71.0%、70.1%、70.1%、71.6%、70.5%、70.1%、71.6%、90.1%、58.6%、70.9%（圖8）。

隨后，利用MEGA6.0在線軟件構建系統(tǒng)進化樹。從圖9可觀察到，11個物種可大致分為3組，第1組包含綿羊、山羊、牛、狗、豬、馬、人和鼠，均為哺乳動物；第2組包含雞和鴨，為鳥類；第3組為斑馬魚。通過系統(tǒng)進化樹分析得出，Myf5蛋白序列的相似性符合物種分類規(guī)律，其中雞與鴨的親緣關系最近，與斑馬魚親緣關系最遠（圖9）。

3 討論

Myf5作為肌源性調節(jié)因子，在其他物種中已被證實能夠影響骨骼肌的發(fā)生［1］，而骨骼肌的發(fā)生過程對于雞的產肉性能又有重要影響，因此對該基因開展功能預測與研究十分必要。該研究采用生物信息學方法，對雞Myf5蛋白的結構與功能進行了預測分析。分析結果表明，雞Myf5蛋白包含氨基酸總數(shù)為258個，分子量為28 456.89 Da，理論等電點5.86，不穩(wěn)定性指數(shù)97.59，表明雞Myf5蛋白是一個不穩(wěn)定的酸性蛋白。二級結構分析結果表明，雞Myf5蛋白無規(guī)則卷曲結構占比最高，為63.57%，有助于Myf5蛋白識別結合序列［8］。亞細胞定位分析結果表明，雞Myf5大概率定位在細胞核中，信號肽分析結果表明，雞Myf5不具有信號肽，可以預測出該蛋白不屬于分泌性蛋白，因此推測雞Myf5蛋白也可能同樣具有轉錄因子功能。蛋白磷酸化是一種重要、常見的蛋白質翻譯后的修飾方式，其參與和調控生物體內的許多生命活動。磷酸化可導致蛋白質的三級結構發(fā)生改變，進而影響其正常生物學功能的發(fā)揮［9］。該研究分析預測結果表明，雞Myf5分子中共有74個潛在的磷酸化位點，說明磷酸化與去磷酸化可能會影響雞Myf5發(fā)揮作用，可作為后續(xù)功能研究的切入點。采用STRING在線軟件預測雞Myf5蛋白合作伙伴有PAX7和PAX3，此外還有SOX10、SDC4、MYOD1和 MYOG蛋白。已有研究表明，PAX7、PAX3［10］、SOX10［11］和SDC4［12］均能夠參與細胞增殖調控；MYOD1和MYOG蛋白和Myf5屬于同一家族，MYOD1主要在成肌前體細胞的命運決定和成肌細胞增殖中起重要作用［13］，而MYOG蛋白則在成肌細胞的融合和分化中起作用，是肌管和肌纖維形成的必需因子［14］。雞Myf5蛋白與PAX7、PAX3、SOX10、SDC4、MYOD1和 MYOG蛋白彼此間均有緊密聯(lián)系，節(jié)點越近代表蛋白與蛋白之間的互作關系越強，說明雞Myf5蛋白很可能通過與這幾種蛋白相互作用，進而發(fā)揮其調解肌細胞增殖分化的生物學功能。進化分析結果顯示，不同物種之間該蛋白序列具有較高的保守性，推測其在不同物種之間的功能也存在相似性。以上研究結果表明，雞Myf5蛋白可能作為重要的轉錄因子對雞肌肉組織的生長發(fā)育產生調控作用。該研究為深入驗證雞Myf5蛋白的生物學功能奠定基礎，進而為肉雞生長性狀的改良提供參考依據(jù)。

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基金項目 遼寧省博士科研啟動基金計劃項目（2019-BS-171）。

作者簡介 張珂（1989—），女，遼寧沈陽人，講師，博士，從事動物分子遺傳研究。

收稿日期 2022-09-16