韓帆　焦倩　杜希恂　閻春玲　姜宏　陳曦

［摘要］目的探討不同月齡A53T轉(zhuǎn)基因（A53T）小鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中α-突觸核蛋白（α-Syn）表達(dá)水平的變化。方法6月齡和12月齡野生型（WT）小鼠和A53T小鼠經(jīng)烏拉坦腹腔麻醉后處死，在體視顯微鏡下取出胸段、腰段和薦段的DRG組織，采用蛋白免疫印跡法檢測DRG中α-Syn的表達(dá)水平。結(jié)果與相同月齡WT小鼠相比，6月齡及12月齡A53T小鼠DRG中α-Syn表達(dá)量顯著增加（F=59.164、55.681，P<0.01）；與6月齡A53T小鼠相比，12月齡A53T小鼠DRG中α-Syn的表達(dá)量顯著增加（F=13.802，P<0.05）。結(jié)論A53T小鼠DRG中α-Syn表達(dá)量高于同月齡WT小鼠，且其表達(dá)量隨年齡增長而增加。

［關(guān)鍵詞］α突觸核蛋白；帕金森??；小鼠，轉(zhuǎn)基因；神經(jīng)節(jié)，脊

［中圖分類號］R338.2［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號］2096-5532（2023）03-0337-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.075［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//kns.cnki.net/kcms2/detail/37.1517.R.20230719.1618.003.html;2023-07-2014：53：22

EXPRESSION OF α-SYNUCLEIN IN THE DORSAL ROOT GANGLION OF A53T MICE WITH DIFFERENT AGES IN MONTHS? HAN Fan， JIAO Qian， DU Xixun， YAN Chunling， JIANG Hong， CHEN Xi? （State Key Discipline： Physiology （in Incubation）， Department of Physiology， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the expression level of α-synuclein （α-Syn） in the dorsal root ganglion （DRG） of A53T transgenic mice with different ages in months. MethodsWild-type （WT） mice and A53T mice， aged 6 or 12 months， were sacrificed after intraperitoneal anesthesia with urethane. DRG tissue samples of the thoracic， lumbar， and sacral segments were collected under a stereomicroscope， and Western blotting was used to measure the expression level of α-Syn. ResultsCompared with the WT mice with the same age in months， the A53T mice aged 6 or 12 months had a significant increase in the expression level of α-Syn in DRG （F=59.164，55.681;P<0.01）. Compared with the A53T mice aged 6 months， the A53T mice aged 12 months had a significant increase in the expression level of α-Syn in DRG （F=13.802，P<0.05）. ConclusionA53T mice have a higher expression level of α-Syn in DRG than WT mice with the same age in months， and the expression level of α-Syn increases with age.

［KEY WORDS］alpha-synuclein; Parkinson disease; mice， transgenic; ganglia， spinal

帕金森病（PD）是一種主要影響運動功能的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病率隨著年齡增加而逐漸上升[1-3]。目前，PD發(fā)生的確切原因和機制仍不完全清楚，但大量研究表明，基因突變是重要的因素之一[4-7]。A53T轉(zhuǎn)基因（A53T）小鼠是一種常見的PD模型小鼠，其體內(nèi)攜帶的人類A53T突變型α-突觸核蛋白（α-Syn）基因可改變α-Syn的結(jié)構(gòu)，使原本可溶性的α-Syn單體轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘亩嗑垠w，可在動物體內(nèi)重現(xiàn)由α-Syn聚集起始的PD病理過程[8-12]。根據(jù)BRAAK學(xué)說可知，胃腸道可能是α-Syn發(fā)生病變的起始部位[13-16]，且這些病理性α-Syn會通過外周神經(jīng)系統(tǒng)逐漸向中樞傳播[17]。已有大量實驗證實迷走神經(jīng)在α-Syn的腸-腦傳播中承擔(dān)主要作用，但是消化道與中樞之間還存在其他神經(jīng)聯(lián)絡(luò)，如交感神經(jīng)，其傳入纖維的胞體主要匯聚在脊髓背根神經(jīng)節(jié)（DRG）中。為明確DRG中是否也存在著α-Syn高表達(dá)，本實驗觀察了不同月齡A53T小鼠DRG中α-Syn的含量變化，從而為交感神經(jīng)傳入纖維參與α-Syn從胃腸道傳播至中樞的可能作用提供證據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物A53T小鼠（品系名稱：B6；C3-Tg（Prnp-SNCA*A53T）83Vle/J），SPF級，購于南京大學(xué)模式動物研究所。小鼠飼養(yǎng)于清潔級動物房中，可自由進(jìn)食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境為光照模擬自然晝夜節(jié)律，12 h明暗交替，溫度保持在20～24 ℃，相對濕度保持在40%～60%。選用6月齡和12月齡的純合子A53T小鼠作為實驗組，同窩相同月齡的野生型（WT）小鼠作為對照組。

1.1.2試劑α-Syn抗體、β-tubulin抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔和山羊抗鼠抗體購于英國Thermo Fisher Scientific公司；0.45 μm PVDF轉(zhuǎn)印膜、ECL化學(xué)發(fā)光液均購于美國Millipore公司：RIPA裂解液購于中國Com Win Biotech公司。A53T小鼠基因型鑒定PCR試劑盒購于中國Vazyme生物科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1A53T小鼠基因鑒定A53T純合子小鼠由A53T雜合子小鼠配種育得，飼養(yǎng)至1月齡進(jìn)行分籠和鑒定。于尾尖部截取0.5 cm長鼠尾組織提取DNA，按照試劑盒（Taq Pro HS U+Probe Master Mix，Vazyme生物科技有限公司）說明配制實時熒光定量PCR反應(yīng)體系并進(jìn)行實驗。根據(jù)PCR數(shù)據(jù)計算△Ct值，通過比較實驗組與對照組純合子目的基因的△Ct值，確定基因型。

1.2.2蛋白免疫印跡法檢測DRG中α-Syn表達(dá)小鼠經(jīng)烏拉坦腹腔麻醉處死后取出脊柱，于體視顯微鏡下取出胸段、腰段和薦段的DRG組織放入EP管中，先用剪刀將組織剪碎，再加入配制好的RIPA裂解液，充分磨碎組織。冰上靜置裂解30 min后，應(yīng)用高速離心機在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，利用BCA試劑盒和酶標(biāo)儀進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，計算上樣量。按比例加入loading buffer，充分混勻，100 ℃煮沸10 min使蛋白充分變性，-20 ℃凍存。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳（90 V、30 min，120 V、60 min）分離后，濕法轉(zhuǎn)至孔徑為0.45 μm的PVDF膜上，按蛋白Marker將目標(biāo)蛋白裁剪出來，經(jīng)脫脂奶粉封閉、一抗孵育、HRP-IgG二抗孵育后，用TBST緩沖液洗凈，將膜與ECL超敏發(fā)光液反應(yīng)后置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行觀察并拍攝圖像。采用Image J分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度計算，目的蛋白表達(dá)水平以α-Syn和β-tubuling條帶灰度值的比值表示。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。小鼠DRG中α-Syn的表達(dá)量以±s表示，不同月齡WT和A53T小鼠DRG中α-Syn表達(dá)水平比較采用析因設(shè)計的方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1A53T小鼠鑒定

PCR結(jié)果顯示，對照組和實驗組純合子目的基因△Ct平均值分別為5.84±0.57和6.11±0.47。△Ct值大于對照組純合子目的基因△Ct值的小鼠為A53T純合子小鼠。共選取10只A53T純合子小鼠進(jìn)行實驗。

2.2不同月齡WT和A53T小鼠DRG中α-Syn表達(dá)比較

蛋白免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，6月齡WT組（n=6）、6月齡A53T組（n=6）、12月齡WT組（n=4）和12月齡A53T組（n=4）小鼠DRG中α-Syn表達(dá)水平分別為0.18±0.07、1.09±0.21、0.46±0.22和1.63±0.35。析因設(shè)計方差分析結(jié)果顯示：F_月齡=17.417，P<0.01；Ｆ_組別=112.168，P<0.01；F_月齡×組別=1.727，P＞0.05。與同月齡WT組小鼠相比，6月齡、12月齡A53T組小鼠DRG中α-Syn表達(dá)量顯著增高，分別增加了505.56%和254.35%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=59.164、55.681，P<0.01）；12月齡A53T組小鼠DRG中α-Syn表達(dá)量比6月齡A53T組小鼠增加了50.46%，兩組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=13.802，P<0.05）。表明A53T小鼠DRG中α-Syn的表達(dá)遠(yuǎn)高于同月齡WT小鼠，且隨年齡的增長，其表達(dá)量增加。

3討論

大量臨床數(shù)據(jù)表明，在典型的PD運動癥狀出現(xiàn)之前，胃腸道功能障礙就已經(jīng)在PD病人身上長期存在，包括便秘、胃輕癱等[18-24]。德國的BRAAK教授于2003年提出了經(jīng)典的PD分期學(xué)說，該學(xué)說指出胃腸道是病理性α-Syn蛋白傳播的起源地，并且通過腸腦軸逐漸蔓延至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[25-26]。其中，α-Syn通過迷走神經(jīng)傳播進(jìn)入迷走神經(jīng)運動背核（DMV）是腸腦軸傳播的重要組成部分。后續(xù)有實驗表明，迷走神經(jīng)切斷術(shù)可以使PD的發(fā)展進(jìn)程大幅減緩，并且使PD的患病風(fēng)險大大降低[27-30]。但該法仍不能完全杜絕PD，這提示α-Syn在胃腸與中樞之間傳播可能還有其他的通道。支配消化道的神經(jīng)除迷走神經(jīng)外，還有交感神經(jīng)，其傳入纖維的胞體主要匯聚在脊髓DRG中，可感受消化道內(nèi)機械刺激（如管壁擴張、胃腸道蠕動等）、化學(xué)刺激（如管腔內(nèi)毒性物質(zhì)、酸堿度等）以及溫度的變化等，并將這些信息傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。與迷走神經(jīng)類似，交感神經(jīng)在消化道和中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間也起橋梁作用，那么它是否在α-Syn的傳播過程中起某些作用呢？本研究對此進(jìn)行了探討。

本實驗選取小鼠胸椎、腰椎和薦椎處的DRG組織進(jìn)行檢測，來自消化道的交感神經(jīng)傳入纖維主要通過以上部位進(jìn)入脊髓，可充分反映交感神經(jīng)傳入纖維在病理性α-Syn腸腦傳播中的作用。實驗結(jié)果顯示，與同月齡WT組小鼠相比，6月齡、12月齡A53T組小鼠DRG中α-Syn表達(dá)量顯著增加，且隨年齡的增長，A53T小鼠DRG中α-Syn表達(dá)量會進(jìn)一步增加，表明交感神經(jīng)中確實存在病理性α-Syn。值得注意的是，本實驗所取組織來源于A53T小鼠，該小鼠是一種攜帶人類A53T突變型α-Syn基因的PD模型小鼠，其體內(nèi)存在廣泛的人A53T突變型α-Syn過表達(dá)。那么，本實驗中小鼠DRG中α-Syn增多的原因，是否僅與該部位的基因突變相關(guān)呢？已有實驗表明，3月齡A53T小鼠小腸組織中α-Syn的表達(dá)已經(jīng)明顯升高，且出現(xiàn)了消化道功能障礙，但此時中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)并未出現(xiàn)病理性的α-Syn，此種情況甚至?xí)掷m(xù)到6月齡以后，提示老齡A53T小鼠中樞病理性α-Syn的增多可能亦與該蛋白從外周至中樞的傳播有關(guān)[31-33]。故作者推測A53T小鼠DRG中α-Syn的增多也可能與交感神經(jīng)在此傳播過程中的作用相關(guān)。有其他研究也報道了交感神經(jīng)的可能作用，如PD病人腎上腺中存在α-Syn的沉積，腎上腺髓質(zhì)中包含由交感神經(jīng)胞體組成的神經(jīng)節(jié)，在這些神經(jīng)節(jié)及發(fā)出的神經(jīng)纖維中均觀察到α-Syn聚集的現(xiàn)象[34-35]；在膀胱和生殖器官附近的交感神經(jīng)神經(jīng)節(jié)中同樣出現(xiàn)了路易小體[24，36]。這些證據(jù)均表明交感神經(jīng)可能參與了PD進(jìn)展，并且可能與病理性α-Syn的傳播有關(guān)。

綜上所述，A53T小鼠DRG中α-Syn的表達(dá)量顯著增加，且其表達(dá)量隨年齡的增長同步上升，提示交感神經(jīng)在PD進(jìn)展中可能發(fā)揮作用。本實驗結(jié)果可為PD發(fā)生機制研究提供實驗依據(jù)，同時為通過阻斷α-Syn由外周向中樞傳播來治療PD提供了新的思路。

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（本文編輯馬偉平）