張鑫 張瑛 李娜 鄭敏 吳虹 孫湛

元素是人體生理機能和代謝必不可少的重要組成部分，在人體血液中保持著一定濃度，通過參與合成人體中維生素、核酸、生物酶以及激素等，影響人體健康及多種疾病的變化和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，人體的元素含量變化與諸多疾病密切相關(guān)[1]。人體血液作為最重要的生物樣本，其元素水平能直接反映體內(nèi)元素變化，是臨床診斷和治療的重要評價指標。隨著儀器分析技術(shù)的發(fā)展，金屬微量元素分析方法也日趨先進，如溶出伏安法、X射線熒光法、原子吸收光譜法（atomic absorption spectroscopy，AAS）、原子熒光光譜法（atomic fluorescence spectrometry，AFS）、電感耦合等離子光譜法（inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES）和電感耦合等離子體質(zhì)譜法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）等[2-8]。其中ICP-MS具有分析速度快、線性范圍寬、靈敏度高以及能實現(xiàn)多元素同時檢測已成為元素分析技術(shù)最新常用方法。但對于血液樣品分析ICP-MS仍然存在很多問題，其原因是血液樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，含有大量的蛋白質(zhì)、小分子化合物和無機鹽等成分，對快速、準確測定產(chǎn)生了影響。同時血液樣品前處理技術(shù)如微波消解、水浴消解等能消除大部分基質(zhì)干擾的影響，但耗時長、試劑用量大、環(huán)境污染嚴重等缺點，均不適應(yīng)大規(guī)模樣品的處理。當前人體血液中元素的測定標準不多，如2022年1月實施的《血清中碘的測定標準 電感耦合等離子體質(zhì)譜法》（WS/T 783-2021）、2000年5月實施的《血中鉛、鎘的石墨爐原子吸收光譜測定方法》（WS/T 174-1999）等，這些多以血液樣本中單元素測定為主。因此，建立人體血液中多元素，同時、快速、準確的測定技術(shù)具有重要的現(xiàn)實醫(yī)學(xué)意義。本實驗建立了ICP-MS測定人體血液中鉻（chromium，Cr）、錳（manganese，Mn）、鈷（cobalt，Co）、鎳（nickel，Ni）、銅（copper，Cu）、砷（arsenic，As）、硒（selenium，Se）、鍶（strontium，Sr）、鉬（molybdenum，Mo）、鎘（cadmium，Cd）、錫（stannum，Sn）、銻（antimony，Sb）、鋇（barium，Ba）、鉈（thallium，TI）和鉛（lead，Pb）等15種元素的快速測定方法，優(yōu)化了分析條件及測定模式，簡化了前處理分析步驟，節(jié)省了試劑和分析時間，為人體生物監(jiān)測項目大批量、簡便、快速、準確地測定人體全血樣品中的金屬元素提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

Thermo Fisher iCAP Q型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Thermo Fisher公司）；CR22N型高速離心機（日本Hitachi公司）；Vortex-Genie 2型渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；TYMR-Ⅲ型血液混勻器（上海旌派儀器有限公司）；Direct-Q型純水機（德國Merck Millipore公司）。

1.2 試劑與標準物質(zhì)

硝酸（55%，電子AA-10級，日本Tama Chemicals公司）；TritonX-100[生化試劑級，阿拉丁試劑（上海）有限公司]。多元素金屬混合標準儲備液（100 μg/mL，PECAL2-ASL-1，美國AccuStandard 公司）；多元素內(nèi)標儲備溶液（10 μg/mL，AG-INTSTD-ASL-1美國AccuStandard公司）；凍干全血有證標準物質(zhì)（Trace Elements Whole Blood L-1，挪威Seronorm公司）；ICP-MS質(zhì)譜調(diào)諧液（美國Thermo Fisher公司）；氬氣（Ar，＞99.999%）和氦氣（He，＞99.999%）（濟南德洋氣體公司）。

1.3 樣品來源與研究時間

選取2022年2—6月200名在濟南市醫(yī)院保健門診健康體檢人群作為研究對象。年齡38～73歲，平均（60.29±5.87）歲。采取血樣放置于-80℃保存。研究工作時間為2022年7月—2023年1月。

1.4 方法

1.4.1 樣品前處理

取冷凍血液樣品放置到室溫，置于血液混勻器混勻15 min，準確吸取樣品0.50 mL于15 mL離心管內(nèi)，加入9.50 mL 0.1%HNO3+0.01%Triton X-100稀釋液，在渦旋振蕩器渦旋混勻30 s，同時做試劑空白，以3 500 r/min（離心半徑11.3 cm）離心5 min，取上清液，上機檢測。

1.4.2 標準系列與內(nèi)標溶液的配制

取多元素混合標準儲備溶液，使用0.1%HNO3+0.01%Triton X-100稀釋液依次配制成0.10、0.50、1.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100 μg/L標準系列；吸取100 μL多元素內(nèi)標儲備溶液于1 000 mL容量瓶中，用1% HNO3溶液定容得濃度10.0 μg/L混合內(nèi)標溶液。

1.4.3 儀器工作條件

使用ICP-MS質(zhì)譜調(diào)諧液調(diào)諧儀器至最佳使用狀態(tài)，滿足普通標準（STD）模式下，鋰（7Li）、59Co、銦（115In）和鈾（238U）元素響應(yīng)值≥50 000、100 000、200 000和300 000；氦氣碰撞（kinetic energy discrimination，KED）模式下，59Co≥30 000和59Co/35Cl.16O＞18。射頻發(fā)生器功率為1 500 W，霧化器流速為1.05 L/min，輔助氣流速為0.80 L/min，冷卻氣體流速為14.0 L/min，碰撞氦氣流速為5.00 mL/min，蠕動泵轉(zhuǎn)速為40 r/min，掃描次數(shù)為20次，采樣錐和截取錐均為鎳錐。

2 結(jié)果

2.1 前處理方法優(yōu)化

2.1.1 稀釋劑的選擇

選擇3種不同稀釋劑[A：1%硝酸（V/V）；B：0.1%硝酸（V/V）；C：0.1%硝酸（V/V）+0.1%Triton100（V/V）]對人體血樣進行直接稀釋，并通過加標回收率分析其對元素檢測的影響。從圖1中能看到稀釋劑C的加標回收率最好，能保證樣品分析的準確性。這源于接近中性的溶液更接近人體的酸堿性；0.1%Triton100的加入降低了血液的黏度，同時又對較好的碳補償劑起到一定增敏的作用。

圖1 不同稀釋劑加標回收率

2.1.2 內(nèi)標元素的選擇

儀器不穩(wěn)定或非質(zhì)譜干擾引起的信號不穩(wěn)定通常選擇內(nèi)標元素來校正。根據(jù)內(nèi)標元素的選擇原則，本實驗選擇鍺（74Ge）用作低質(zhì)量數(shù)元素Cr、Mn、Ni、Co、As、Se、Sr和Cu等的內(nèi)標元素，115In被用作Mo、Sn、Cd、Sb和Ba等的內(nèi)標元素，鉍（209Bi）被用作TI和Pb等的內(nèi)標元素。實驗發(fā)現(xiàn)，42Sc回收率變化較大，因此選擇其不作為本實驗內(nèi)標元素。本實驗通過在線加標的方式將混合內(nèi)標溶液引入進樣系統(tǒng)中。

2.1.3 質(zhì)譜干擾的優(yōu)化

ICP-MS在多元素測定時，氧化物和雙電荷離子干擾、同量異位素干擾、多原子離子干擾等為主要的質(zhì)譜干擾，其中最主要的干擾來源是多原子離子干擾。通過干擾校正方程、儀器優(yōu)化以及碰撞反應(yīng)池技術(shù)能有效降低多原子離子帶來的干擾，保證測定結(jié)果的準確。本實驗中分析元素Cr干擾來自40Ar12C+和37Cl15O+、As干擾來自40Ar35Cl+，利用KED模式能有效降低多原子離子能量，明顯降低對待測元素的干擾；分析元素Cd和Pb干擾主要為同量異位素干擾，通過干擾校正方程和選擇次靈敏度的質(zhì)量數(shù)分析能最大程度上消除同量異位素干擾的影響。非質(zhì)譜型干擾程度與樣品基體性質(zhì)有關(guān)，可通過對樣品稀釋、內(nèi)標法或標準加入法等降低干擾，本實驗發(fā)現(xiàn)對血樣樣本稀釋20倍以及選擇合適內(nèi)標，能有效降低非質(zhì)譜型干擾?？紤]實驗時間和大批量檢測的要求本實驗統(tǒng)一選擇常用的He氣作為KED模式對血樣樣本稀釋20倍進行測定。

2.2 方法性能指標

2.2.1 標準曲線、檢出限和線性范圍

本實驗各分析元素標準曲線在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均＞0.999，平行測定11次空白溶液各分析元素的結(jié)果3倍和10倍標準偏差其對應(yīng)的濃度來確定檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）。見表1。

表1 全血中15種元素線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限

2.2.2 精密度和加標回收率

選取5份實際血液樣品混合后測定，按照加標量為樣品中原含量的0.5～2倍分別加入高、中和低3種濃度的目標元素混合標準溶液，重復(fù)測定6次計算各元素的加標回收率和精密度。所測元素的加標回收率為87%～118%，對每個加標后樣本重復(fù)測定6次計算各目標元素的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），其值為0.8%～4.2%。

2.2.3 全血標準物質(zhì)檢測

為了更直觀評價方法的準確性，對全血有證標準物質(zhì)做驗證實驗。向凍干全血有證標準物質(zhì)加入3.00 mL水，手動搖勻30 min；準確吸取0.50 mL標準物質(zhì)3份與血液樣品前處理同步驟操作，測定各分析元素的含量，檢測結(jié)果見表2。實驗結(jié)果表明，各元素的檢測值與證書給出的參考值具有很好的吻合度，說明本實驗建立的檢測方法可以滿足血液樣品中元素的準確定量。

表2 全血中15種元素標準物質(zhì)測定結(jié)果（μg/L）

2.3 實際樣品測定

對采集于2022年上半年濟南市65歲以下和以上健康人群的全血樣品各100份，各分析元素的含量結(jié)果見圖2～圖3。從圖中能發(fā)現(xiàn)血液中各分析元素的含量分布，Cu元素含量較高，平均濃度在900 μg/L左右。Se元素次之，平均濃度在100 μg/L左右。Ba、Mn、Pb、Sr等元素的平均濃度在10～50 μg/L，As和Sb元素的平均濃度約為4 μg/L，Cr、Co、Ni、Mo、Cd、Sn、TI等元素含量較低，平均濃度均低于1 μg/L。通過兩組圖對比，發(fā)現(xiàn)65歲以下和以上健康人群各元素平均含量近似，僅有Pb元素平均含量65歲以下低于65歲以上人群約5 μg/L。

圖2 65歲以下健康人群的全血樣品15種元素箱式圖

圖3 65歲以上健康人群的全血樣品15種元素箱式圖

3 討論

目前對于ICP-MS生物樣品的前處理方法以消解法為主，微波消解、水浴消解為主導(dǎo)方法。消解法能減少基質(zhì)效應(yīng)的干擾，提高測定結(jié)果的準確度，但消解法操作復(fù)雜、耗時長、試劑消耗多、環(huán)境污染大，同時易于引入外源性污染等問題，不能滿足生物樣品元素含量低、取樣量小和樣本量大的檢測需求。因此，對于生物樣品，特別是血液樣本，發(fā)展基于直接稀釋的樣品前處理方法，采用合適的稀釋劑和質(zhì)譜工作條件來滿足樣品中元素的準確定量以及簡化前處理流程的需求就顯得尤為重要。本實驗應(yīng)用接近中性的弱酸溶液更接近人體的酸堿性，Triton100的加入降低了血液的黏度并提高元素分析的靈敏度，保證了血液樣本更好的分散性[9]。干擾問題一直是ICP-MS研究的難點，質(zhì)譜干擾以多原子離子干擾為主，目前消除多原子離子干擾的主流方法是利用碰撞/反應(yīng)池技術(shù)[10]。在碰撞/反應(yīng)池技術(shù)中氦氣常作為碰撞氣體。氦氣為惰性氣體，在碰撞/反應(yīng)池中不會形成新的干擾物，待測元素也不因副反應(yīng)而有損失，反應(yīng)池中沒有新的副反應(yīng)離子，因此無需動態(tài)掃描去消除副反應(yīng)產(chǎn)物。本實驗通過對人體血液樣品中基質(zhì)效應(yīng)的探討，選擇碰撞/反應(yīng)池技術(shù)以氦氣作為碰撞氣確立了Cr、Mn、Co、Ni、Cu、As、Se、Sr、Mo、Cd、Sn、Sb、Ba、TI和Pb等15種金屬元素檢測方法，通過選擇合適的氦氣流量有效地消除血液中干擾效應(yīng)同時又保證了待測元素的靈敏度。通過方法學(xué)評價，驗證了該方法對人體血液樣品中15種金屬元素分析的可行性。該方法取樣量小、操作簡便、實際消耗少、環(huán)境污染低，能滿足大批量血液樣品的檢測需求。利用該方法對200名兩個年齡段的健康人體血液樣本檢測分析，得出了部分健康人體血液中15種微量元素的基本分布情況，其結(jié)果與文獻報道基本一致[11-12]。因此，該方法可以為進一步探索人體血液中基本元素的變化規(guī)律提供必要的參考。