康超　曾維軍　鄭旋　王萬坤　楊玲　劉忠玄　王晶

摘要：以不同地區(qū)及連作土壤為研究對象，利用Illumina MiSeq平臺進行高通量測序，分析不同土壤細菌和真菌物種多樣性及群落組成，并結(jié)合土壤營養(yǎng)指標，探討羊肚菌菌絲與土壤細菌和真菌群落結(jié)構(gòu)關系。結(jié)果表明，栽培地中土壤細菌多樣性高于真菌，正常生長羊肚菌可提高土壤堿解氮含量和降低土壤真菌多樣性。門水平下，細菌優(yōu)勢菌為放線菌門、變形菌門、綠彎菌門，真菌為子囊菌門、擔子菌門、被孢霉門；屬水平下，細菌優(yōu)勢屬為節(jié)桿菌屬、鞘脂單胞菌屬，連作土壤中真菌優(yōu)勢屬為被孢霉屬、頭束霉屬、青霉屬；正常生長土壤為被孢霉屬、羊肚菌屬、頭束霉屬。土壤全磷與節(jié)桿菌屬、被孢霉屬、頭束霉屬呈負相關，與鐮刀菌屬呈正相關，全鉀與頭束霉屬呈正相關，各理化因子與羊肚菌屬無明顯相關性。

關鍵詞：微生物多樣性；羊肚菌；覆土層；連作

中圖分類號：S646.701文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）14-0221-08

土壤微生物作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成，與其他微生物種群、動植物、環(huán)境等因素相互作用，直接或間接地參與土壤物質(zhì)循環(huán)、能量轉(zhuǎn)換等［1-2］。隨著農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和種植規(guī)模的擴大，不同農(nóng)藝措施對土壤本底微生物造成了明顯影響［3-7］。食用菌產(chǎn)業(yè)是中國農(nóng)業(yè)的重要產(chǎn)業(yè)，部分種類（雙孢蘑菇、大球蓋菇、竹蓀等）需要覆土才能出菇，其土壤理化性質(zhì)及微生物種類對其菌絲生長、原基分化、子實體形成具有重要作用，反之食用菌又影響著土壤理化性質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)等［3，8］。研究表明，雙孢蘑菇連作可提高土壤真菌、細菌和纖維素降解菌及有機質(zhì)、pH值，放線菌則減少［9］，在其扭結(jié)期和出菇期時添加鞘氨醇單胞菌屬、Dongia、無色桿菌屬和假單胞菌可提高雙孢蘑菇產(chǎn)量［10］。竹蓀覆土層細菌、真菌、放線菌數(shù)量隨時間增加，pH值、氮、磷、鉀、酶活性及肥力也相應變化［11］，熟料栽培覆土層微生物多樣性減少［12］，連作則導致土壤微生物數(shù)量、功能微生物數(shù)量、脲酶、過氧化氫酶、多酚氧化酶、蛋白酶等發(fā)生變化，從而影響竹蓀正常生長［13］。研究表明［14］，卵孢長根菇在采收期時，覆土層真菌數(shù)量最大，細菌呈下降趨勢，而病害發(fā)生時真菌細菌豐度、土壤營養(yǎng)元素、pH值均降低。對天麻—冬蓀輪種覆土微生物進行研究，冬蓀菌絲可通過抑制蜜環(huán)菌生長，而保持土壤微生物群落結(jié)構(gòu)［15］。

羊肚菌屬典型覆土食用菌，為羊肚菌科羊肚菌屬真菌［16］。2003年，外援營養(yǎng)袋技術(shù)助推了羊肚菌商業(yè)化栽培，栽培種類主要為梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌和七妹羊肚菌［17］。研究表明，不同海拔地區(qū)羊肚菌根際土壤變形菌門和放線菌門為優(yōu)勢類群，且變形菌門與土壤含水量、養(yǎng)分和海拔呈正相關，與pH值、Ca、Mg含量呈負相關；放線菌門與Mg含量、脲酶和芳基硫酸酯酶呈正相關，與Fe、Se、速效鉀、土壤脫氫酶和堿性磷酸酶呈負相關［18］。不同土層中，以10～20 cm土層細菌多樣性最高，但多數(shù)種類豐度較低，以變形菌門、固氮菌為主［19］。熊川等對涼山州野生羊肚菌發(fā)生地土樣進行分析，其菌塘土壤細菌多樣性指數(shù)和豐度均高于非菌塘，以Thermosporotrichaceae、黏球菌科和紅螺菌科為主要類群［20］。Longley等研究堆肥基質(zhì)栽培紅褐羊肚菌時發(fā)現(xiàn)，其分生孢子期（菌霜期）、原基、衰退3個時期，細菌以芽孢桿菌屬、擬桿菌屬為優(yōu)勢菌；原基衰退和子實體期，真菌優(yōu)勢菌分別為Gilmaniella和頭孢霉［21］。比較未栽羊肚菌、正常生長、染病羊肚菌土壤真菌多樣性變化，正常栽培后微生物多樣性降低，發(fā)霉病則增加［22］。以上文獻主要考察不同地區(qū)野生羊肚菌、不同栽培期及病害發(fā)生是栽培羊肚菌根際微生物變化情況，關于不同地區(qū)及連作對土壤微生物多樣性研究較少。因此，本研究通過高通量測序技術(shù)對不同栽培地羊肚菌覆土層根際及羊肚菌連作土樣微生物群落組成、多樣性等特征進行分析，并結(jié)合土壤理化性質(zhì)變化，探討羊肚菌菌絲與根際微生物之間的相互關系，為羊肚菌高效栽培提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2021年12月3日，在貴州省銅仁市石阡縣和碧江區(qū)羊肚菌栽培基地分別設置樣地，標記為石阡縣試驗組（SQS，羊肚菌連作第2年）、碧江區(qū)試驗組（BJS，羊肚菌種植第1年），分別以不栽培羊肚菌的土壤為對照組，標記為石阡縣對照組（CKS）、碧江區(qū)對照組（CKB）。2022年12月13日，每個樣地隨機設置20 m×20 m樣方，采用5點取樣法，每個樣點直接鉆取5～10 cm土層并混合，將土樣過2 mm篩網(wǎng)去雜質(zhì)，保存于4 ℃冰箱和-80 ℃冰箱中，用于土壤理化性質(zhì)和土壤DNA測定分析。

1.1.2 試劑

FastPfu Polymerase（TransGen，中國）；agArose瓊脂糖（Biowest，西班牙）；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen，美國）；NEXTFLEX[KG-*5] Rapid DNA-Seq Kit建庫試劑盒（Bioo Scientific，美國）；MiSeq Reagent Kit v3測序試劑盒（Illumina，美國）。土壤基本營養(yǎng)指標檢測的相關試劑（分析純）均購置于成都金山化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.2 DNA提取和PCR擴增

根據(jù) FastDNA[KG-*5] Spin Kit for Soil DNA抽提試劑盒（MP Biomedicals，美國）說明書逐步進行土樣微生物群落總DNA抽提，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，使用NanoDrop 2 000（Thermo Fisher Scientific，美國）測定DNA濃度和純度。以提取的總DNA為模板，采用細菌通用引物338F （5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）、806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)進行PCR擴增，用真菌通用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對ITS1基因進行擴增。擴增程序如下：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃穩(wěn)定延伸10 min，再在10 ℃進行保存。338F-806R引物PCR反應體系為：5×FastPfu Buffer 緩沖液 4.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，上游引物（5 mmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase DNA聚合酶0.4 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O補足至 20.0 μL。ITS1F-ITS2R引物PCR反應體系為：10×Buffer緩沖液2.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs? 2.0 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下游引物（5 μmol/L）0.8 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL，模板DNA 10 ng，ddH2O補足至20.0 μL。

1.2.3 Illumina Miseq測序

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，美國）進行回收產(chǎn)物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用QuantusTM Fluorometer（Promega，美國）對回收產(chǎn)物進行檢測定量。使用NEXTflexTM Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific，美國）進行建庫：（1）接頭鏈接；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴增進行文庫模板的富集；（4）磁珠回收PCR產(chǎn)物得到最終的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺（Illumina，美國）進行測序。

1.2.4 土壤理化指標測定

土壤全氮、全磷、全鉀、有效磷、速效鉀、pH值分別按照NY/T 53—1987、GB/T 9837—1988、NY/T 87—1988、NY/T 1121.7—2014、NY/T 1849—2010、NY/T 1241—1999進行測定；土壤堿解氮按照《土壤學實驗》中的堿解擴散法［23］進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Uparse7.0.1090進行OTU分析，聚類方式采用USEARCH7-uparse算法，OTU序列相似度為0.97，物種分類數(shù)據(jù)庫為unite8.0/its_fungi，分類置信度為0.7。使用mothur v.1.30.2計算Shannon指數(shù)，并對組間Shannon指數(shù)差異進行t檢驗。使用R語言3.3.1制作群落柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土壤樣本理化性質(zhì)變化

分別在石阡縣和碧江區(qū)羊肚菌栽培基地采集土樣35份，其中，石阡縣14份，碧江區(qū)21份。石阡縣土樣為羊肚菌連作土壤，播種羊肚菌后菌絲萌發(fā)緩慢，竄土能力差，外援營養(yǎng)袋吃料慢，污染率高；碧江區(qū)土樣為第1年羊肚菌栽培土壤，其菌絲萌發(fā)快，生長旺盛，營養(yǎng)袋吃料快，污染率低。對不同土壤理化性質(zhì)進行檢測，結(jié)果（表1）表明，石阡縣土樣全氮含量、全鉀含量、pH值高于碧江區(qū)（P<0.05），全磷、有效磷、速效鉀含量低于碧江區(qū)（P<0.05），2個樣地試驗組與對照組差異不顯著。碧江區(qū)試驗組堿解氮含量最高，明顯高于對照組（P<0.05），而所有樣品有機質(zhì)差異不顯著。

2.2 不同土壤樣本中細菌、真菌物種多樣性分析

對不同土壤樣品細菌和真菌DNA進行抽提和測序，高通量分析后，獲得8 613個細菌物種OTU，屬于45個門和1 159個屬，總序列數(shù) 1 572 726 條，各樣本序列平均數(shù)38 989～49 520條，序列平均長度為407 bp；獲得4 411個真菌物種OTU，屬于16個門和780個屬，總序列數(shù)2 503 140條，各樣本序列數(shù)范圍為66 151～76 349條，序列平均長度為 2 391 bp（表2）。由表2可知，碧江區(qū)土樣細菌Shannon指數(shù)高于石阡縣土樣，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)差異不明顯；真菌Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)則存在差異，碧江區(qū)對照組最高，試驗組降低，與對照組差異明顯（P<0.05），石阡縣也低于對照組，差異不顯著；碧江區(qū)土樣ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)高于石阡縣，2個土樣試驗組與對照組差異不明顯。結(jié)果表明，羊肚菌栽培前后細菌多樣性和真菌多樣性均降低，菌絲正常生長前后真菌變化顯著，連作前后細菌和真菌多樣性變化不明顯，推測土壤中真菌多樣性與羊肚菌菌絲長勢有關。

2.3 不同土壤環(huán)境中微生物物種組成

2.3.1 細菌真菌門水平下物種相對豐度

由圖1-a 可知，門水平下放線菌門、變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門為各土樣土壤優(yōu)勢細菌門，以放線菌門占比最高，其4個優(yōu)勢門類相對豐度平均值分別為35.07%、21.83%、12.89%、11.39%，石阡縣樣地放線菌門豐度高于碧江區(qū)樣地，碧江區(qū)試驗組高于對照組。由圖1-b可知，門水平下子囊菌門、擔子菌、被孢霉門為各土樣土壤優(yōu)勢真菌門，以子囊菌門占比最高，其3個優(yōu)勢門類相對豐度平均值分別為66.10%、20.62%、10.32%，石阡縣（連作土壤）子囊菌門物種豐度減少，擔子菌門、被孢霉門增加，碧江區(qū)（正常生長）羊肚菌樣地3個優(yōu)勢真菌門物種豐度差異不明顯。

由圖2-a可知，在細菌主要屬水平下共有35個屬相對豐度>1%，其中，石阡縣樣地節(jié)桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、類諾卡氏菌、Gaiella和Vicinamibacterales、Galellales中不能注釋的屬物種豐度占比較高，均>2%，以節(jié)桿菌屬占比最高，對照組和試驗組分別達到12.33%和13.90%；碧江區(qū)樣地物種占比相對均勻，僅試驗組節(jié)桿菌屬占比較高（3.85%）。結(jié)果表明，2個樣地中節(jié)桿菌屬物種豐度差異大，連作土壤占比大，且播種羊肚菌后，節(jié)桿菌屬占比有一定提高。由圖2-b可知，在真菌屬水平上共有33個屬相對豐度>1%，石阡縣樣地中被孢霉屬、頭束霉屬、青霉屬物種豐度占比最大，可看出栽培羊肚菌后，被孢霉屬豐度明顯增加，頭束霉屬豐度則明顯降低、青霉屬豐度變化不大，羊肚菌屬豐度差異不顯著。碧江區(qū)樣地中被孢霉屬占比較大，栽培羊肚菌后豐度有所減少；試驗組中羊肚菌屬物種豐度占比最大（21.15%），因羊肚菌栽培第1年，故對照組未檢測出羊肚菌屬；青霉屬物種豐度無明顯變化。碧江區(qū)土樣與對照組頭束霉屬豐度較低，差異不明顯，但明顯低于石阡縣樣地。

2.3.2 不同土壤環(huán)境真菌、細菌β多樣性分析

對樣品進行主坐標分析（PCoA），結(jié)果（圖3）表明，4個分組細菌、真菌物種基本匯聚在一起，同樣地對照組和試驗組物種均有交叉，表明對照組和試驗組間物種存在相似性，但栽培羊肚菌之后，樣地中物種組成發(fā)生了變化，樣本之間物種差異變大。2個樣地細菌真菌相對獨立匯聚在一起，樣本間距離遠，表明2個樣地間物種組成差異大，且碧江區(qū)樣地物種多樣性差異大于石阡縣樣地。表明樣地間物種多樣性差異要大于組內(nèi)物種多樣性。

2.3.3 不同土壤環(huán)境主要真菌、細菌物種差異分析

對2個樣地土壤細菌優(yōu)勢屬進行組間差異分析，結(jié)果（圖4-a）表明，不同處理間主要物種有顯著或極顯著差異（Kruskal-Wallis秩和檢驗，P<0.05，P<0.01），Top 10已知物種分別為節(jié)桿菌屬、芽單胞菌屬、小單孢菌屬、溶桿菌屬，其他物種暫不能注釋，因此考察前3優(yōu)勢屬物種在不同分組間的差異性。由圖4-b、圖4-d可知，石阡縣試驗組中節(jié)桿菌屬、小單孢菌屬豐度最高，明顯高于碧江區(qū)樣地物種豐度（P<0.01），略高于對照組，但不顯著；由圖 4-c 可知，碧江區(qū)試驗組芽單胞菌屬豐度明顯高于石阡縣樣地（P<0.01），略高于對照組，但不顯著。

對2個樣地土壤真菌優(yōu)勢屬進行組間差異分析，結(jié)果（圖5-a）表明，不同處理間主要物種有顯著或極顯著差異（Kruskal-Wallis秩和檢驗，P<0.05，P<0.01），Top 10已知物種分別為被孢霉屬、頭束霉屬、羊肚菌屬、鐮刀菌屬、籃狀菌屬、毛殼屬、Gibellulopsis、Albifimbria、芽枝霉屬，1個種類暫無明確分類地位，因此考察前3優(yōu)勢屬物種在不同分組間的差異性，由圖5-b可知，石阡縣試驗組中被孢霉屬豐度最高。由圖5-d可知，石阡縣對照組頭束霉屬豐度最高，兩者明顯高于碧江區(qū)樣地物種豐度（P<0.01）；由圖5-c可知，碧江區(qū)試驗組羊肚菌屬豐度明顯高于石阡縣樣地（P<0.01）。

2.4 不同土壤環(huán)境微生物群落與土壤營養(yǎng)的相關性分析

考察土壤理化性質(zhì)與土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)關系，為確定共線性較小的環(huán)境因子，分別對細菌物種和真菌物種進行方差膨脹因子（VIF）分析?；诤Y選出的主要土壤營養(yǎng)因子進行RDA/CCA分析，結(jié)果（圖6-a）表明，速效鉀、有效磷、堿解氮、有機質(zhì)與碧江區(qū)土樣細菌群落組成呈正相關，pH值、全鉀與石阡縣土樣細菌群落組成呈正相關。速效鉀、有效磷、堿解氮、有機質(zhì)之間呈正相關，與全磷、全鉀呈負相關，以全鉀對石阡縣試驗組細菌群落組成影響最大，以速效鉀、有效磷對碧江區(qū)群落組成影響最大。由圖6-b可知，全鉀、pH值與石阡縣對照組真菌群落組成呈正相關，速效鉀、有效磷與碧江區(qū)試驗組真菌群落組成呈正相關，有效磷、速效鉀與全鉀、pH值之間呈負相關，彼此之間呈負相關，以有效磷對碧江區(qū)真菌群落組成影響最大。

2.5 不同土壤環(huán)境中土壤微生物物種與土壤營養(yǎng)的相關性分析

由圖7可知，不同樣地中的理化性質(zhì)指標均與相對基因豐度排名前10的細菌屬有一定相關性，其中細菌屬中速效鉀與Vicinamibacterales無法注釋的屬呈正相關（P<0.01），相關系數(shù)為48.29%，有效磷與節(jié)桿菌屬呈負相關（P<0.01）（圖7-a），真菌屬中有效磷與鐮刀菌屬、青霉屬、籃狀菌屬，全鉀與毛殼屬、頭束霉屬均呈正相關（P<0.01，P<0.05），速效鉀與毛殼屬、沙蜥屬，有效磷與被孢霉屬、頭束霉屬呈負相關（P<0.01，P<0.05）（圖7-b），其他理化性質(zhì)與物種之間無相關性或呈弱相關性。結(jié)果表明，土壤中理化性質(zhì)對物種豐度影響較小。

3 討論與結(jié)論

土壤微生物多樣性和外源微生物的種類和數(shù)量呈正相關［7，24］，本研究考察不同地區(qū)連作羊肚菌覆土層土壤，未栽培羊肚菌（對照組）和栽培羊肚菌（試驗組）之間土壤理化性質(zhì)和細菌真菌多樣性變化情況。結(jié)果表明，碧江區(qū)試驗組覆土層堿解氮明顯增加，可能在于正常生長羊肚菌菌絲多，活力強，可轉(zhuǎn)變土壤中氮素形態(tài)，增加效養(yǎng)分含量［25-26］。比較不同樣地細菌、真菌多樣性差異，細菌多樣性高于真菌多樣性，同一樣地試驗組和對照組細菌多樣性差異不大。碧江區(qū)樣地（正常生長）真菌多樣性低于對照組，可能在于連作時本底微生物及理化性質(zhì)抑制了羊肚菌菌絲生長，則真菌多樣性變化不大，而羊肚菌菌絲正常生長，成為優(yōu)勢菌群，從而抑制了本底微生多樣性，與前人研究［22，27］一致。對不同樣地土壤微生物主要屬水平物種進行分析，石阡縣和碧江區(qū)樣地差異較大，即地域之間物種差異性大于栽培前后差異性。連作土壤中細菌主要物種為節(jié)桿菌屬，且對照組和試驗組物種豐度分別達12.33%和13.90%。從2個樣地栽培前后看，羊肚菌栽培后節(jié)桿菌屬豐度均有一定程度的增加，表明羊肚菌栽培及連作可增加節(jié)桿菌屬豐度，且是連作過程中的代表物種［28-29］。屬水平下真菌物種主要有被孢霉屬、頭束霉屬、羊肚菌屬。針對被孢霉屬物種豐度，石阡縣樣地明顯高于碧江區(qū)，前者在連作后物種豐度增加，后者則有一定降低，但不明顯。研究表明，頭束霉屬在羊肚菌原基退化時有明顯豐度［21］，本研究發(fā)現(xiàn)連作土樣中該物種占比很大，對其原基分化有明顯影響，栽培結(jié)果表明石阡縣土樣在原基分化后無法正常生長，或衰退，或無法形成成熟子實體。Longley等發(fā)現(xiàn)，在羊肚菌菌絲生長和成熟時期，芽孢桿菌屬、擬桿菌屬、Gilmaniella是覆土層優(yōu)勢菌［21］，本研究則未發(fā)現(xiàn)這2個種類，與文獻有差異。鐮刀菌被認為是一類重要植物病原菌類群，具有隨著栽植代數(shù)增加而顯著增加的趨勢［27，30］，本研究發(fā)現(xiàn)連作后鐮刀菌豐度與對照物種豐度差異不明顯，原因可能在于地區(qū)及土壤生態(tài)系統(tǒng)中物種的差異影響，有待進一步研究。而栽培羊肚菌，碧江區(qū)對照組鐮刀菌屬物種豐度明顯降低，推測羊肚菌菌絲有抑制鐮刀菌屬真菌的作用，有待進一步研究驗證。

本研究通過對不同地區(qū)和連作土壤理化性質(zhì)、微生物（真菌、細菌）群落組成結(jié)構(gòu)、多樣性等特征進行分析，發(fā)現(xiàn)羊肚菌屬物種豐度可轉(zhuǎn)變土壤中氮素，提高堿解氮含量。不同土樣細菌多樣性高于真菌，連作土壤細菌、真菌多樣性差異不顯著，正常生長羊肚菌可降低真菌多樣性。在門水平下，細菌優(yōu)勢物種為放線菌門、變形菌門、綠彎菌門，真菌優(yōu)勢物種為子囊菌門、擔子菌門、被孢霉門。屬水平下，細菌優(yōu)勢物種為節(jié)桿菌屬、鞘脂單胞菌屬；連作土壤中真菌優(yōu)勢屬為被孢霉屬、頭束霉屬、青霉屬；碧江區(qū)樣地為被孢霉屬、羊肚菌屬、青霉屬。相關分析表明，全磷與節(jié)桿菌屬呈負相關，與鐮刀菌屬呈正相關，全鉀與頭束霉屬均呈正相關，全磷與被孢霉屬、頭束霉屬呈負相關，各理化因子與羊肚菌屬無明顯相關性。

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收稿日期：2022-10-05

基金項目：貴州省科技計劃項目（編號：黔科合支撐［2022］114、黔科合服企［2019］4007-6）。

作者簡介：康 超（1987—），男，貴州仁懷人，碩士，高級工程師，從事食藥用菌菌種繁育及栽培技術(shù)研究。E-mail：464286916@qq.com。