馬芹 劉丹丹 鄒志強(qiáng) 馬元元 魏書(shū)強(qiáng) 李玉峰 汪建華

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：C 文章編號(hào)：1673-1085（2023）08-0088-05

雞傳染性支氣管炎（Infections bronchitis， IB）是由傳染性支氣管炎病毒（Infections bronchitis virus， IBV）感染引起的一種急性、高度接觸性傳染病，最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)[1， 2]。H9亞型禽流感（Avian influenza， AI）是由H9亞型禽流感病毒（Avian influenza virus， AIV）引起的傳染病，該病為低致病性禽流感，廣泛分布于全國(guó)各地[3]。近幾年，隨著我國(guó)肉雞規(guī)?；B(yǎng)殖不斷發(fā)展，飼養(yǎng)條件得到了較大的改善，但是腎型傳染性支氣管炎的發(fā)病率沒(méi)有減少反而有增高的趨勢(shì)。該病典型的剖檢癥狀為支氣管栓塞、花斑腎，如果飼養(yǎng)管理不當(dāng)易繼發(fā)大腸桿菌，使臨床雞群出現(xiàn)死淘較高的現(xiàn)象[4]。目前雞傳染性支氣管炎病毒、H9亞型禽流感病毒和大腸桿菌的混合感染對(duì)臨床造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，本文從臨床診斷、病理剖檢及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)等方面展開(kāi)，建立科學(xué)有效的診斷和治療方法，對(duì)臨床防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

山東聊城地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)18日齡商品肉雞。

1.2 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、膽硫乳、SS培養(yǎng)基購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司；核酸提取試劑盒購(gòu)于杭州博日科技股份有限公司；PCR反應(yīng)式試劑購(gòu)于南京諾維贊生物科技有限公司；微生物藥敏片購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品等。

1.3 方法

1.3.1 臨床觀察與剖檢 肉雞16日齡出現(xiàn)精神不振、有呼吸道癥狀，18日齡出現(xiàn)張嘴呼吸，全群死淘80～100只，23日齡死淘繼續(xù)上升，單日死淘400多只。將病死雞羽毛打濕，放置在解剖盤上，暴露其胸、腹腔，觀察氣囊、肺臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌胃、腺胃等臟器有無(wú)明顯的病理變化，沿病死雞頭部一側(cè)剪開(kāi)，觀察喉頭、氣管、支氣管有無(wú)病變。

1.3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 在無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)，取肝臟劃線接種于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、膽硫乳培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基上，37 ℃溫箱放置18～24 h，觀察培養(yǎng)基上菌落顏色和形態(tài)。

1.3.3 病毒檢測(cè) 取病死雞的氣管、喉頭、肺、肝脾、法氏囊等臟器剪碎后按1：3比例加入無(wú)菌PBS溶液，充分研磨制備組織懸液，反復(fù)凍融3次后，8 000 r/min 離心10 min，取上清液用于病毒核酸的提取，具體提取步驟參考試劑盒內(nèi)說(shuō)明書(shū)。將提取的核酸進(jìn)行疑似病原如H9亞型禽流感、傳染新支氣管炎病毒（IBV）、傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）、傳染性法氏囊病毒（IBDV）、偏肺病毒（aMPV）、新城疫病毒（NDV）的PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和程序參照南京諾唯贊擴(kuò)增試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，擴(kuò)增結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行觀察，陽(yáng)性產(chǎn)物膠回收后連接轉(zhuǎn)化并進(jìn)行測(cè)序分析。

1.3.4 病毒分離培養(yǎng) 將1.3.3制備的組織懸液經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾后，接種于9日齡SPF雞胚，每枚接種0.2 mL。放置于37 ℃溫箱培養(yǎng)，每天觀察有無(wú)死胚，24 h之內(nèi)的死胚棄去，若出現(xiàn)死胚，收取24～144 h內(nèi)死亡雞胚的尿囊液及胚體；若無(wú)死胚現(xiàn)象盲傳5代，進(jìn)行PCR鑒定。

1.3.5 藥敏試驗(yàn) 參考K-B紙片法[5]進(jìn)行分離菌株的12種藥物（大觀霉素、恩諾沙星、新霉素、卡那霉素、頭孢噻肟、多西環(huán)素、氟苯尼考、阿莫西林、氨芐西林、林可霉素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明）的敏感性分析。將菌液均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)板上，間隔適當(dāng)位置進(jìn)行藥敏片的粘貼與固定，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，量取抑菌圈的直徑，判定藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 剖檢結(jié)果

病死雞通過(guò)剖檢觀察到肌胃、腺胃交接處有輕微出血，個(gè)別有纖維素性氣囊炎、心包炎和肝周炎，肝臟破裂出血，脾臟出血腫大，腎臟腫大呈典型的花斑狀，支氣管內(nèi)有黃色干酪樣硬物，氣管內(nèi)有出血點(diǎn)；見(jiàn)圖1。

2.2 細(xì)菌分離結(jié)果

經(jīng)分離培養(yǎng)后，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上長(zhǎng)出純凈單一的白色、邊緣光滑的菌落；膽硫乳和SS培養(yǎng)基上長(zhǎng)出紅色或粉紅色小菌落，周圍有膽酸鹽沉淀圈，鏡檢觀察到革蘭氏陰性短桿菌，符合大腸桿菌的培養(yǎng)與鏡檢結(jié)果。

2.3 病毒檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示IBDV、ILTV、aMPV、NDV未擴(kuò)增出目的條帶，H9、IBV有單一條帶，且大小與目的片段一致，見(jiàn)圖2；經(jīng)測(cè)序和Blast比對(duì)分析H9、IB陽(yáng)性。將IBV進(jìn)行S1基因測(cè)序，繪制進(jìn)化樹(shù)（圖3），分析可知，該分離毒株屬于GI分支，且與QX株關(guān)系最近，為同一分支，與GII-GVII等分支的同源關(guān)系較遠(yuǎn)。經(jīng)Megalign比對(duì)分析可知，該分離毒株與QX株的同源性在90.4%～92%；與GII的同源性在59.3%，與GIII株同源性在61.4%，與GIV株同源性在57.2%，與GV同源性在64.7%，與GVI同源性在63.2%～63.6%，與GVII株同源性在67.3%，詳見(jiàn)圖4。

2.4 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果

雞胚分離結(jié)果顯示，傳代培養(yǎng)后F3仍有90%的雞胚存活，收獲尿囊液盲傳至F4，死亡率為50%，收獲觀察到胚體發(fā)育矮小并蜷縮成球狀，羊膜增厚附著在胚體上，為典型的傳染性支氣管炎癥狀（圖5）。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

目前實(shí)驗(yàn)室藥敏結(jié)果顯示該大腸桿菌分離株對(duì)新霉素、多粘菌素B和多西環(huán)素敏感性較低，對(duì)大觀霉素、恩諾沙星、卡那霉素、頭孢噻肟、氟苯尼考、阿莫西林、氨芐西林、林可霉素、復(fù)方新諾明等9種藥物不敏感。大腸桿菌分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

3 討論與結(jié)論

肉雞傳染性支氣管炎、H9亞型禽流感與大腸桿菌混合感染后，剖檢觀察肌胃腺胃交接處出血，支氣管內(nèi)有黃色干酪樣硬物，腎臟腫大呈花斑樣，這與現(xiàn)場(chǎng)初期出現(xiàn)呼吸道癥狀、采食量下降以及隨后排水樣白色稀糞、糞便中含有大量尿酸鹽、死亡率升高相吻合[6]。傳染性支氣管炎病毒是冠狀病毒科冠狀病毒屬，經(jīng)雞胚分離時(shí)能觀察到胚體發(fā)育萎縮呈小丸形，羊膜增厚，緊貼胚體，卵黃囊縮小，尿囊液增多，再經(jīng)PCR和測(cè)序分析確定病原，本試驗(yàn)為臨床傳染性支氣管炎感染病例提供了診斷技術(shù)和方法。臨床上發(fā)病后檢測(cè)是一方面，另一方面還應(yīng)查清病因并進(jìn)行預(yù)防。本試驗(yàn)通過(guò)臨床分析、病理剖檢、細(xì)菌分離培養(yǎng)、病毒分離及分子生物學(xué)診斷等方法，確定了病原為傳染性支氣管炎病毒、H9亞型禽流感病毒與大腸桿菌。大腸桿菌多隨病雞糞便排出體外，從而污染飼料、飲水、環(huán)境等，因此動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境的衛(wèi)生條件和糞污的無(wú)害化處理等因素直接影響著的大腸桿菌的發(fā)生和流行[7-9]。本次發(fā)病臨床上緊急使用VC通腎，并使用傳染性支氣管炎活苗飲水，5日后使用強(qiáng)力霉素1個(gè)療程，使疾病得到了有效控制。為了防止該病再次發(fā)生，生產(chǎn)上應(yīng)強(qiáng)化飼養(yǎng)管理，給雞群提供優(yōu)質(zhì)全價(jià)飼料，嚴(yán)格執(zhí)行環(huán)境衛(wèi)生消毒防疫措施，消滅傳染源，切斷傳播途徑。

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