王夢藍 張淑涵 郭 寧 徐 核 王安琪 李西文 孫 奕

(中國中醫(yī)科學院中藥研究所,北京,100700)

細辛為馬兜鈴科植物北細辛AsarumheterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.、漢城細辛AsarumsieboldiiMiq.var.seoulenseNakai或華細辛AsarumsieboldiiMiq.的干燥根和根莖,在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被初次記載,同時被列為上品,其味辛性溫,歸心、肺、腎經(jīng),具有行水通竅、溫肺化飲、祛風散寒、止痛的功效,也可用于鼻塞鼻淵、風濕痹痛、風寒感冒、痰飲喘咳等癥[1]。細辛根部的揮發(fā)油類成分主要包括甲基丁香酚和黃樟醚,其次為3,5-二甲氧基甲苯、肉豆蔻醚、β-蒎烯、α-蒎烯、優(yōu)葛縷酮、α-細辛醚、欖香素等[2-7]。從其根及根莖的去揮發(fā)油部分則鑒定出2E,4E,8Z,10E-N-異丁基-2,4,8,10-十二碳四烯酰胺、細辛脂素、芝麻脂素、山柰酚-3-O-葡萄糖苷、5,7-二-O-β-D-吡喃葡萄糖基柚皮素、馬兜鈴酸Ⅰ(Aristolochic Acid Ⅰ,AAⅠ)等多種非揮發(fā)性成分[8-11]。臨床研究表明,細辛具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫抑制、調節(jié)血壓、抗過敏、抗衰老等藥理作用[12-13]。

“煮散”首次記載于唐代孫思邈的《備急千金要方》,而在更早的漢朝《傷寒雜病論》中已經(jīng)出現(xiàn)關于劑型的描述。中藥煮散是將藥物制成細粉或粗粉,加入水或引藥煎煮,去掉藥渣留下湯汁,最終制成的湯劑。目前,仍沿用至今的煮散劑包括銀翹散、玉屏風散等。在當代,隨著中藥飲片的需求量逐年上升,煮散劑可以發(fā)揮簡、便、廉、驗的優(yōu)勢,能夠大量節(jié)約藥源,因此有必要重新考量其應用價值[14]。目前研究較多的一是煮散劑的臨床研究并觀察其療效,二是將煮散劑與中西醫(yī)其他療法結合來進行臨床試驗,三是探討影響煮散有效成分浸出的相關因素等,四是對比研究煮散劑與傳統(tǒng)飲片煎出率的差異以及產(chǎn)生差異的因素[15-17]。本實驗對細辛的精準煮散劑進行了出膏率、有效成分轉移率、指紋圖譜等方面的研究;與藥材飲片中有效成分的含量進行比較,并分析不同規(guī)格煮散之間的成分及其含量的差別,確定了藥材煮散的最佳粉碎粒徑,同時評價煮散與原飲片的質量均一性,建立煮散劑的質量評價系統(tǒng)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Waters公司，美國，型號：Waters 2695)，超高效液相色譜儀(Waters公司，美國，型號：Acquity UPLC Class I)，超高效液相系統(tǒng)(Waters公司，美國，型號：ACQUITY UPLC H-Class)，高分辨質譜儀(Waters公司，美國，型號：Q-TOF)，電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司，型號：Sartorius-WWZA-124S)，電子天平(上海精密科學儀器有限公司，型號：YP502N)，超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，型號：KQ-5200B)，臺式高速離心機(上海洪紀儀器設備有限公司，型號：D2012)，高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司，型號：FW100)，pH試紙(上海三愛思試劑有限公司精密試紙，批號：20056)。

1.2 試劑 細辛脂素對照品(北京索萊寶科技有限公司,批號:BBP03975,純度≥98%),甲醇、乙腈均為色譜純級別(Fisher,美國,批號:20191125),其他分析試劑均為分析純級別,實驗用水均為娃哈哈純凈水或屈臣氏飲用水。

1.3 分析樣品 3批細辛飲片經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥研究所李西文研究員鑒定,均由馬兜鈴科植物北細辛AsarumheterotropoidesF.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.)Kitag.的干燥根及根莖炮制加工而成,藥材標本存放于中國中醫(yī)研究院中藥研究所整合中藥學中心。見表1。

表1 細辛產(chǎn)地及批次

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 細辛飲片標準湯劑供試品溶液的制備 精密稱取生產(chǎn)批號160960111的細辛20 g,加8倍量水,采用標準湯劑的方法進行煎煮。首先浸泡30 min,第1次加熱回流30 min,用200目的篩網(wǎng)趁熱過濾,再加入6倍量水,第2次加熱回流30 min,趁熱過濾,合并2次煎煮濾液,減壓濃縮,使最終體積為100 mL,過0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.1.2 不同規(guī)格煮散飲片水煎液供試品溶液的制備 取細辛飲片均勻粉碎后過篩,分別過5～10目,10～24目,24～65目篩,可得到3種不同規(guī)格的煮散飲片。稱取上述煮散飲片各20 g,加8倍量水,采用標準湯劑方法進行煎煮。浸泡30 min,第1次加熱回流30 min,用200目的篩網(wǎng)趁熱過濾,接著加入6倍量水,第2次加熱回流30 min,趁熱過濾,合并2次煎煮濾液,減壓濃縮,使最終體積為100 mL,過0.22 μm微孔濾膜即得。

2.1.3 細辛飲片供試品溶液的制備 本品粉末過3號篩后,精密稱定約0.5 g,置于具塞錐形瓶中,精密加入15 mL甲醇,密塞稱重,超聲處理(功率500 W,頻率40 kHz)45 min,待冷卻后再次稱重,用甲醇補足減失的重量后,過0.22 μm微孔濾膜,即得。

2.1.4 對照品溶液的制備 精密稱定適量細辛脂素對照品,加入甲醇制成50 μg/mL的細辛脂素對照品溶液,4 ℃保存,即得。

2.2 細辛脂素含量測定

2.2.1 色譜條件 Thermo BDS Hypersil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);0.2%乙酸水(A)-流動相乙腈(B),梯度洗脫(0～8 min,5%B;8～20 min,5%～20%B;20～40 min,20%～60%B;40～45 min,60%～95%B;45～50 min,95%B),流速為1.0 mg/mL,柱溫設置為30 ℃,檢測波長為280 nm,進樣量為10 μL。

2.2.2 線性關系考察 取細辛脂素對照品溶液,分別稀釋2、4、8、16、32倍,按2.2.1項色譜條件進行測定,橫坐標(X)為對照品質量(μg),縱坐標(Y)為峰面積,繪制標準曲線,得到回歸方程Y=1 282.8X+593 3,r=1,線性范圍為50～500 ng。

2.2.3 精密度試驗 取煮散劑供試品溶液(S1)，按2.2.1項色譜條件連續(xù)測定6次，結果顯示供試品溶液中細辛脂素峰面積相對標準偏差(Relative Standard Deviation，RSD)為0.1%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取煮散劑供試品溶液(S1),分別在0、2、4、8、12、24 h時按照2.2.1項色譜條件進行分析,結果表明供試品中細辛脂素峰面積RSD為1.3%,表明標準煮散供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.2.5 重復性 取相同批次的標準煮散劑樣品(S1),按2.1.2項中的方法平行制備6份供試品溶液,分別按2.2.1項色譜條件進行檢測分析,計算得出細辛脂素的平均質量分數(shù)分別為0.025,0.025,0.024,0.024,0.025,0.024 mg/mL,RSD為2.2%,表明該方法重復性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 精密吸取同一批次已知含量的供試品溶液適量(S1),按1∶1的比例添加細辛脂素對照品,平行制備6份后按2.2.1項色譜方法對細辛脂素進行分析,計算出細辛脂素的平均回收率為101.3%,RSD為2.1%,表明該實驗方法準確可靠。

2.2.7 細辛樣品中細辛脂素含量測定 依照2020年版《中華人民共和國藥典》方法,制備不同批次細辛飲片樣品溶液,精密吸取3批次供試品溶液各10 μL,并在2.2.1項下的色譜條件進樣分析,測定細辛脂素的峰面積,通過外標法計算細辛脂素含量。見表2。

表2 細辛標準煮散劑的理化特征參數(shù)與細辛脂素參數(shù)

2.2.8 細辛飲片標準湯劑中細辛脂素含量測定 精密吸取2.1.1項下細辛飲片標準湯劑供試品溶液10 μL,并在2.2.1項色譜條件下進樣分析,測定細辛脂素的峰面積,根據(jù)外標法計算細辛脂素含量。見表2。

2.2.9 細辛煮散飲片水煎液中細辛脂素量測定 精密吸取2.1.2項下各個批次不同規(guī)格的供試品溶液各10 μL,并在2.2.1項的色譜條件下進樣分析,測定細辛脂素的峰面積,接著通過外標法計算細辛脂素含量。見表2。

2.3 細辛脂素轉移率 根據(jù)以上實驗測得的細辛脂素含量得結果,按照轉移率的公式計算細辛脂素轉移率,轉移率=標準湯劑或煮散劑中細辛脂素含量/相應飲片中細辛脂素含量×100%,發(fā)現(xiàn)粉碎后的不同粒徑煮散飲片水煎液細辛脂素的轉移率均比原飲片有顯著增加,其中以中等粒徑細辛脂素轉移率最高。見表2。

2.4 出膏率 精密量取2.1.1項下制得的細辛飲片標準湯劑和2.1.2項下制得不同規(guī)格煮散飲片水煎液25 mL,置于干燥的蒸發(fā)皿中,水浴加熱蒸干,接著在105 ℃烘箱中干燥3 h,取出后放置干燥器中冷卻30 min,稱重,計算出膏率。見表2。

2.5 指紋圖譜的建立 將3批細辛飲片標準煮散劑生成高效液相色譜指紋圖譜,對照指紋圖譜則由平均數(shù)生成。見圖1～2。根據(jù)峰形、峰面積、保留時間等參數(shù),最終選擇出共有峰5個,以峰5作參照,來計算5個共有峰的相對保留時間、保留時間、相對峰面積以及峰面積。見表3。通過對比高效液相色譜色譜圖信息可知,3批細辛標準煮散劑所生成的指紋圖譜的相似度均大于90%。見表4。

圖1 細辛標準煮散劑的高壓液相色譜圖譜

圖2 細辛標準煮散劑的高效液相色譜指紋譜

表3 細辛標準煮散劑的主要共有指紋峰指標參數(shù)

表4 細辛標準煮散劑的高效液相色譜指紋圖譜的相似度

2.6 超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(Ultra-performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry,UPLC-MS/MS)成分指認

2.6.1 檢測條件 色譜條件為Waters ACQUITY HSS T3 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動相0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～2 min,5%B;2～17 min,5%～95%B;17～19 min,95%B;19～24 min,95%～5%B),流速0.3 mL/min,進樣2 μL,柱溫設置為40 ℃,檢測波長為270 nm。

質譜條件為電噴霧電離(Electrospray Ionization,ESI),正離子模式全掃描;離子源工作參數(shù)為毛細管電壓3.0 kV,錐孔電壓30 V,錐孔反吹氣流量(N2)50 L/h,脫溶劑氣流量1 000 L/h,離子源溫度120 ℃,脫溶劑氣溫度450 ℃,每0.2秒采集1次譜圖,掃描范圍m/z 50～1 000,采用UNIFITM 1.9.4質譜分析軟件進行數(shù)據(jù)采集和分析。

2.6.2 色譜峰指認 精密吸取2 μL的細辛標準煮散供試品溶液注入超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質譜法(Ultra Performance Liquid Chromatography Tandem Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS)儀器,在正離子模式下測定,利用UNIFITM1.9.4質譜分析軟件進行數(shù)據(jù)處理,對比分析相對分子質量、特征離子碎片,并結合MassFragmentTM確定化合物的分子式和相對分子質量等信息。最終鑒定出16個色譜峰?；衔锛跋嚓P離子推斷見表5,圖3。

圖3 細辛標準煮散劑UPLC-Q-TOF-MS分析的基峰離子(Base Peak Ion,BPI)色譜圖

表5 正離子模式下細辛煮散劑溶液中的色譜峰鑒別

3 討論

本實驗選取了不同產(chǎn)地的細辛制成煮散劑,分別測定了出膏率和pH值。結果顯示,粉碎成不同粒徑的煮散飲片與原飲片pH值無明顯差異,而出膏率則比原飲片有所增加;然而最小粒徑容易出現(xiàn)輕微糊化現(xiàn)象,故選用中等細度的顆粒制備煮散劑最為合適。

中藥生產(chǎn)中計算出膏率最重要的是要確保中藥的提取程度夠完全,并保證中藥材能煮透,計算出膏率的基礎上可以降低生產(chǎn)成本,使藥品質量得到控制以實現(xiàn)良好的經(jīng)濟效益。并且出膏率和含量之間的關聯(lián)密切;控制好藥材的質量和工藝提取參數(shù),有利于更好地保證產(chǎn)品的最終質量。

采用高壓液相色譜法-二極管面陣(High-performance Liquid Chromatography-diode Array Detection,HPLC-DAD)色譜法進行分析,根據(jù)其高分辨數(shù)據(jù)以及分析結果,說明不同規(guī)格煮散劑與原飲片在主要成分上并沒有明顯差別,具有屬性上的一致性;根據(jù)其相似度計算結果,不同規(guī)格煮散劑與原飲片批次之間相似度較好,說明粉碎后的煮散飲片與原藥材飲片中的成分種類沒有太大差別,是否粉碎及粉碎程度對其藥物成分幾乎沒有影響。本實驗制成了3個不同規(guī)格煮散劑,包括粗粒徑(24～65目)、中粒徑(10～24目)、細粒徑(5～10目),通過查閱2020版《中華人民共和國藥典》,借鑒其中方法,對有效成分細辛脂素的含量及轉移率進行了測定,與飲片制得的標準湯劑比較,粉碎后不同粒徑煮散飲片水煎液中細辛脂素的含量均明顯增加,其中中等粒徑(10～24目)細辛脂素含量及轉移率均為最高,有效成分含量最高,且不易糊化。如果細辛藥材制成10～24目粒徑的顆粒再加工成煮散劑,則可以得到最高的藥材提取率,從而更廣泛地應用于生物醫(yī)藥行業(yè)。

細辛在炮制入藥時,飲片中的有效成分之一細辛脂素的轉移率不高,但制成煮散后,可使其出膏率和轉移率有所提高。研究發(fā)現(xiàn),不同規(guī)格的煮散劑之間的出膏率也存在差異,其中以中等顆粒的細辛脂素的轉移率最高,且具有良好的均一性。采用UPLC-QTOF-MS進行檢測,用UNIFITM1.9.4質譜分析軟件分析,結合文獻查閱,以及對照品質譜分析和保留時間等參數(shù),最終鑒定出16個化合物,這對于細辛煮散劑的質量評價具有一定的研究意義。

4 小結

本實驗按照制備中藥飲片標準煮散劑的方法,建立細辛飲片標準煮散劑的質量標準,而煮散可以使得患者煎煮服藥過程更簡單、快捷;并且價格相對低廉,一定程度上減輕患者的經(jīng)濟負擔;技術的改進可以大大提高效率,節(jié)約資源的同時能保護環(huán)境。傳統(tǒng)湯劑由于長時間沸騰會導致?lián)]發(fā)性有效成分的散失,煮散恰好避免這個問題。同時煮散可以減少藥材使用、縮短煎煮時間、煎藥出率高,有助于藥效更好的發(fā)揮,方便攜帶以及服用。煮散雖好,但也存在一些缺點,比如無法清晰辨認原材料是何種藥材,不易長久保存等問題。目前對于煮散劑的研究已比較深入且取得不小成就,但仍有缺陷需要系統(tǒng)地完善,這也將是煮散方向今后研究和討論的熱點。

利益沖突聲明:無。