宋文婷 丁 昭 苗 蘭 孫明謙 尹春園 曹 慧 史 躍 馬彥雷 李 磊 劉建勛

(1 中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,北京市中藥藥理重點(diǎn)研究室,北京,100091; 2 萊頓大學(xué)萊頓藥物研究中心,萊頓,2333CD)

中風(fēng)是嚴(yán)重危害中國國民健康的重大慢性非傳染性疾病,具有致殘率高和死亡率高的特點(diǎn)[1]。60%的中風(fēng)患者為缺血性中風(fēng)[2]。中醫(yī)認(rèn)為,氣能推動血液運(yùn)行,氣機(jī)調(diào)暢,則血液能夠正常運(yùn)行。但在氣虛狀態(tài)下,氣無力推動血行,形成瘀滯[3]。臨床上常用益氣活血法治療氣虛血瘀型中風(fēng)[4]。補(bǔ)陽還五湯由黃芪、川芎、赤芍、紅花、桃仁、當(dāng)歸、地龍等7味傳統(tǒng)中藥組成[5],對于氣虛血瘀型中風(fēng)有較好治療作用[6-7]。

代謝組學(xué)是研究生物體受到內(nèi)外刺激后,體內(nèi)小分子代謝物變化的一項(xiàng)技術(shù),它反映了多種因素作用的終點(diǎn)效應(yīng),是各種因素效應(yīng)的綜合體現(xiàn)[8]。代謝組學(xué)的整體性和系統(tǒng)性與中醫(yī)藥的整體性思維相吻合。本實(shí)驗(yàn)觀察補(bǔ)陽還五湯對氣虛血瘀型腦缺血大鼠的治療作用,再借助代謝組學(xué)技術(shù),對大鼠血清中的內(nèi)源性小分子代謝物進(jìn)行檢測和通路分析,探討給藥前后大鼠機(jī)體代謝產(chǎn)物的動態(tài)變化,以期為深入探索其作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠30只,無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級,7周齡,體質(zhì)量200～220 g,購于維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司,動物合格證號SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心,溫度23～25 ℃,濕度50%～70%,12 h交替照明,大鼠5只一籠,可自由飲水?dāng)z食。本研究經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院倫理委員會審批通過(倫理審批號:2018XLC003-2)。

1.1.2 藥物 黃芪配方顆粒(批號:1812002C),川芎配方顆粒(批號:1812001S),赤芍配方顆粒(批號:1812005S),紅花配方顆粒(批號:1812001S),桃仁配方顆粒(批號:1812004S),地龍配方顆粒(批號:1812001S),當(dāng)歸尾配方顆粒(批號:1812003S),均購自華潤三九有限公司。

1.1.3 試劑與儀器 乙腈(色譜純,Fisher公司,美國,批號:F19M9J202),甲醇(色譜純,Fisher公司,美國,批號:198267),甲酸(分析純,西隴化工股份有限公司,批號:101117),純凈水(中國娃哈哈有限公司,批號:20170317),二甲基亞砜(分析純,西隴化工股份有限公司,批號:111115),熒光微球(UVPMS-BY2,Cospheric公司,美國,批號:100309-7),醫(yī)用水合氯醛(上海源葉生物有限公司,批號:Z16J10Y80098),大鼠血栓素B2(Thromboxane,B2,TXB2)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20191016),大鼠6-酮前列腺素F1α(6-keto-prostaglandin F1α,6-keto-PGF1α)酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:20191016),右旋糖酐D40(大連美侖生物,批號:M1001A),API-TOF參比質(zhì)量溶液試劑盒[包含hexakis(1H,1H,3H-tetrafluoropropoxy)phosphazine和7-purine](Agilent公司,美國,批號:LB97178),Agilent高效液相色譜儀(Agilent公司,美國,型號:1200),Agilent Q-TOF質(zhì)譜儀(Agilent公司,美國,型號:6520),高速離心機(jī)(Hettich公司,德國,型號:MIKRO 220 R),超聲波破碎儀(Sonics公司,美國,型號:VCX150)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將30只雄性健康SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和補(bǔ)陽還五湯組,每組10只。配制熒光微球右旋糖酐混懸液:稱取5 g右旋糖酐D40,溶解于100 mL純凈水中。將BY2 180～212 μm微球與BY2 106～125 μm微球分別稱取5 mg與10 mg,懸浮于10 mL5%右旋糖酐D40溶液中,每只實(shí)驗(yàn)大鼠共注射200 μL。2種微球濃度分別為0.5 mg/mL與1 mg/mL。

睡眠剝奪復(fù)合多發(fā)性腦梗死(Multiple Cerebral Infarction,MCI)大鼠模型制備:大鼠先接受睡眠剝奪2周,然后制備微球致MCI手術(shù),術(shù)后繼續(xù)復(fù)合睡眠剝奪,并給藥4周。睡眠剝奪方法參考文獻(xiàn)[9]“水環(huán)境小平臺法”,睡眠剝奪結(jié)束后回籠正常飲食飲水。為不使大鼠耐受睡眠剝奪,每天在不同時間進(jìn)行操作。見表1。

表1 睡眠剝奪時間

大鼠MCI模型制備:麻醉大鼠,頸部正中切口,分離頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈。用動脈夾夾閉頸總動脈,頸外動脈的遠(yuǎn)心端用線結(jié)扎,用注射器從頸外動脈向頸內(nèi)動脈注入配制好的熒光微球右旋糖酐混懸液0.2 mL,微球經(jīng)由頸內(nèi)動脈分散至大腦各動脈。假手術(shù)組大鼠則從頸外動脈向頸內(nèi)動脈注入右旋糖酐溶液0.2 mL。松開動脈夾,將頸外動脈近心端結(jié)扎,逐層縫合傷口,回籠正常飼養(yǎng),術(shù)后24 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分,正常0分,無神經(jīng)性征象。1分:提尾時大鼠不能完全伸展左前肢。2分:大鼠左側(cè)肢體癱瘓,行走時向左側(cè)轉(zhuǎn)圈,出現(xiàn)追尾現(xiàn)象。3分:大鼠行走向左側(cè)跌倒或不能站立或翻滾。4分:無自發(fā)活動,有意識障礙。淘汰死亡、0分及4分大鼠,1～3分為MCI模型建造成功。評分結(jié)束后,各組有10只造模成功。手術(shù)結(jié)束3 d后開始給藥,并恢復(fù)睡眠剝奪操作。干預(yù)4周后取材。

1.2.2 給藥方法 藥物配制:黃芪、川芎、赤芍、紅花、桃仁、地龍、當(dāng)歸尾配方顆粒的飲片當(dāng)量分別為10 g/g、6 g/g、5 g/g、6 g/g、20 g/g、6.7 g/g、5 g/g,在配藥時先將各個顆粒劑分別進(jìn)行稱量后再混合,以蒸餾水配制成混懸液。大鼠全方組每天給予配方顆粒3.49 g/kg,相當(dāng)于2倍臨床等效劑量。

補(bǔ)陽還五湯:分別稱取黃芪顆粒10.8 g、赤芍2.7 g、川芎2.16 g、當(dāng)歸尾3.6 g、地龍2.16 g、紅花2.16 g、桃仁2.16 g,混合后配至100 mL,相當(dāng)于給藥量3.49 g/kg。

具體實(shí)驗(yàn)方案流程見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)方案流程

圖2 各組大鼠體質(zhì)量比較

圖3 各組大鼠血清TXB2、6-keto-PGF1α、 TXB2/6-keto-PGF1α值比較

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 體質(zhì)量測量 手術(shù)造模當(dāng)天稱重,手術(shù)恢復(fù)后每天給藥時稱重,各組稱重后分別給予藥物或相應(yīng)體積的蒸餾水。

1.2.3.2 氣虛血瘀相關(guān)指標(biāo)檢測 大鼠腹主動脈取血,試管內(nèi)靜置1.5 h,4 ℃預(yù)冷,4 000×g離心15 min,分離血清,凍存在-80 ℃冰箱中,按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒說明書操作,檢測血清中TXB2、6-keto-PGF1α等相關(guān)指標(biāo)。

1.2.3.3 血清樣本制備 取50 μL血清加入有機(jī)溶劑[乙腈-甲醇(1∶1)]200 μL,混勻振搖1 min,于4 ℃,12 000×g離心10 min后,取上清液進(jìn)樣分析。

1.2.3.4 液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用分析 色譜條件:Agilent Waters HILIC Amide色譜柱(Waters公司,ACQUITY UPLC,BEH amide1.7 μm,2.1 mm×100 mm);流動相A為含0.1%甲酸的乙腈-水(1∶9)混合液,流動相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液,梯度洗脫(0～11 min,92% B～70% B;11～13 min,70% B;13～15 min,70%～92% B),18 min停止,兩針之間平衡時間3 min。流速0.3 mL/min,柱溫35 ℃,進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件:離子源為電噴霧離子源,霧化氣和干燥氣均為氮?dú)?碰撞氣為氦氣,采集模式為正離子模式,毛細(xì)管電壓3 500 eV,霧化溫度350 ℃,干燥氣流速600 L/h,霧化氣壓力207 kPa,掃描范圍m/z 80～1 000,數(shù)據(jù)儲存模式為Centroid。質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)通過2個已知的對照品[hexakis(1H,1H,3H-tetrafluoropropoxy)phosphazine和7-purine,二者對應(yīng)的m/z分別為922.009 8和121.050 9]進(jìn)行實(shí)時矯正。參比液通過Agilent Isocratic泵以0.01 mL/min的速度噴入質(zhì)譜。Auto MS/MS實(shí)驗(yàn)采用碰撞誘導(dǎo)裂解的方式,碰撞能量30 eV。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體征及體質(zhì)量觀察 造模前后大鼠的精神狀態(tài)和體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。造模結(jié)束后,與假手術(shù)組大鼠比較,模型組大鼠精神萎靡,毛發(fā)直立且晦暗無光,身體消瘦,體質(zhì)量變化明顯(P<0.01)。補(bǔ)陽還五湯組大鼠精神狀態(tài)有所改善,體質(zhì)量比模型組有顯著增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠體質(zhì)量比較

2.2 各組大鼠血清TXB2、6-keto-PGF1α、TXB2/6-keto-PGF1α值比較 與假手術(shù)組比較,模型組TXB2、TXB2/6-keto-PGF1α值均升高,6-keto-PGF1α值下降,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05);與模型組比較,補(bǔ)陽還五湯組TXB2、TXB2/6-keto-PGF1α值均下降,同時6-keto-PGF1α值升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠血清TXB2、6-keto-PGF1α、TXB2/6-keto-PGF1α值比較

2.3 血清代謝輪廓圖 大鼠血清代謝組學(xué)結(jié)果顯示模型組和假手術(shù)組有較為明顯的區(qū)別,而補(bǔ)陽還五湯組有明顯的向假手術(shù)組回調(diào)的趨勢,且補(bǔ)陽還五湯組和假手術(shù)組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。模型組與假手術(shù)組的PLS-DA模式識別圖顯示,模型組和假手術(shù)組之間的內(nèi)源性代謝成分出現(xiàn)了較為明顯的變化(R2=0.996,Q2=0.854)。見圖5。利用PLS-DA分析,選出模型組與模型組差異大的離子進(jìn)行初步鑒定和分析,篩選條件為變量重要性投影VIP(Variable Importance in the Project,VIP)>1.2,Pvalue(Student′s t)<0.05,結(jié)果顯示,篩選模型組與給藥組補(bǔ)陽還五湯組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且均有向?qū)φ战M水平恢復(fù)的趨勢。通過將這些潛在生物標(biāo)志物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與METLIN、HMDB等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比,鑒定出11種與補(bǔ)陽還五湯治療作用相關(guān)的生物標(biāo)志物,大鼠氣虛血瘀證模型和補(bǔ)陽還五湯藥效潛在生物標(biāo)志成分及其通路富集得到的代謝通路。見表4。

圖4 血清樣本PCA圖

圖5 血清樣本PLS-DA平面

表4 補(bǔ)陽還五湯治療大鼠氣虛血瘀證模型血清中的潛在生物標(biāo)志成分

3 討論

TXB2和6-keto-PGF1α分別為血栓素和前列環(huán)素的穩(wěn)定代謝物,TXB2、6-keto-PGF1α和一氧化氮都是與血管內(nèi)皮損傷和血小板活化密切相關(guān)的活性物質(zhì)[10]。TXB2能夠收縮血管、促進(jìn)血小板聚集;6-keto-PGF1α能夠舒張血管、抑制血小板聚集,二者平衡的破壞會促進(jìn)血小板聚集,也是造成血液黏度高的重要因素之一[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,模型組與假手術(shù)組比較,TXB2水平升高,6-keto-PGF1α水平降低,導(dǎo)致模型組中二者比值顯著高于假手術(shù)組,表明在模型組中血小板花生四烯酸代謝途徑亢進(jìn),內(nèi)皮細(xì)胞功能異常,血管舒縮功能異常,血小板異常聚集,血液黏度增加,繼而引起血液流變學(xué)改變[12]。而補(bǔ)陽還五湯對模型組表現(xiàn)出的內(nèi)皮損傷有良好的糾正作用,能夠降低血清中TXB2并升高6-keto-PGF1α值,使TXB2/6-keto-PGF1α值降低,發(fā)揮抗血小板聚集、保護(hù)血管內(nèi)皮、改善血瘀的作用。

代謝組學(xué)結(jié)果顯示,模型組與假手術(shù)組比較呈現(xiàn)出明顯的區(qū)別,補(bǔ)陽還五湯組部分逆轉(zhuǎn)模型組的變化,指標(biāo)向假手術(shù)組回調(diào)的趨勢明顯,說明模型組大鼠的體內(nèi)代謝成分已經(jīng)受到干擾,而補(bǔ)陽還五湯組可以對體內(nèi)異常的生物代謝途徑進(jìn)行有效的調(diào)整。本研究主要發(fā)掘補(bǔ)陽還五湯發(fā)揮治療作用生物標(biāo)志物,首先使用PLS-DA分析假手術(shù)組與模型組間代謝輪廓的總體差異,篩選正常組與模型組之間的差異代謝物,根據(jù)這些潛在生物標(biāo)志物在補(bǔ)陽還五湯組中含量的變化進(jìn)一步篩選,發(fā)掘出補(bǔ)陽還五湯組中濃度變化趨于正常組的代謝成分作為潛在生物標(biāo)志物并進(jìn)行下一步的分析。結(jié)果顯示,模型組和假手術(shù)組之間的內(nèi)源性代謝成分出現(xiàn)了較為明顯的變化,PLS-DA分析篩選模型組與補(bǔ)陽還五湯組差異有統(tǒng)計學(xué)意義,且均有向?qū)φ战M水平恢復(fù)的趨勢,即為補(bǔ)陽還五湯作用的潛在生物標(biāo)志物[9]。經(jīng)代謝產(chǎn)物分析后,精氨酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、賴氨酸的生物合成是代謝產(chǎn)物中重要的信號通路。精氨酸和脯氨酸代謝:本研究中,有多種代謝異常組分都與精氨酸和脯氨酸的代謝相關(guān)。其中,瓜氨酸(Citrulline)的和鳥氨酸(Ornithine)是尿素循環(huán)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),而高瓜氨酸(Homocitrulline)、N1-乙酰亞精胺(N1-Acetylspermidine)、天冬酰胺(Asparagine)都通過上游的代謝途徑與精氨酸和脯氨酸的代謝相關(guān)[13]。精氨酸可在精氨酸酶的作用下轉(zhuǎn)化為鳥氨酸,由鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Ornithine Aminotransferase,OAT)代謝形成脯氨酸,鳥氨酸脫羧酶(Ornithine Decarboxylase,ODC)代謝形成多胺。脯氨酸可用于膠原蛋白合成,而多胺可促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。其中多胺的代謝也被研究者證明與神經(jīng)元細(xì)胞的缺血性損傷有關(guān)[15]。L-精氨酸也是一氧化氮合酶(Nitricoxide Synthase,NOS)的底物。一氧化氮是生物體內(nèi)重要的信號分子,具有抗炎、舒張血管和改善微循環(huán)的作用,對缺血性腦組織具有保護(hù)作用。一氧化氮分為3種亞型,神經(jīng)元型NOS(Neuronal NOS,nNOS)、內(nèi)皮型NOS(Endothelial NOS,eNOS)、誘導(dǎo)型NOS(Inducible NOS,iNOS)。eNOS在血管內(nèi)皮細(xì)胞中可以通過催化精氨酸轉(zhuǎn)化為一氧化氮和瓜氨酸來維持適當(dāng)?shù)难髁?因此,在血管健康中起著關(guān)鍵作用[16]。在腦損傷早期,精氨酸含量降低,一氧化氮的合成減少會導(dǎo)致腦血流量減少[17]。有研究者發(fā)現(xiàn),在大鼠腦缺血早期使用精氨酸可以加速缺血區(qū)域一氧化氮的合成,從而緩解腦損傷[18]。本實(shí)驗(yàn)中,模型組與假手術(shù)組比較,瓜氨酸和鳥氨酸的含量上升,提示一氧化氮的生成途徑發(fā)生異常,而精氨酸可以通過精氨酸酶的代謝,轉(zhuǎn)化為鳥氨酸,并產(chǎn)生尿素,模型組中高瓜氨酸含量的升高與這一途徑異常導(dǎo)致的尿素積累相關(guān)。在補(bǔ)陽還五湯組中,幾種物質(zhì)的含量均得到調(diào)整,說明補(bǔ)陽還五湯可以通過調(diào)節(jié)精氨酸和脯氨酸代謝的多個節(jié)點(diǎn)來達(dá)到對腦的保護(hù)作用。

賴氨酸的生物合成:本研究中Lysine(賴氨酸)和二氨基庚二酸等與賴氨酸生物合成相關(guān)的物質(zhì)含量出現(xiàn)了異常,這說明在模型組中賴氨酸的合成受到了影響。賴氨酸是一種機(jī)體必需氨基酸,在骨骼肌、血清蛋白、多肽激素等多種蛋白質(zhì)的合成中起重要作用,還具有免疫調(diào)節(jié)作用,因此與機(jī)體生長和修復(fù)密切相關(guān)。賴氨酸缺乏會導(dǎo)致疲勞、脂肪酸代謝受損和全身蛋白質(zhì)能量缺乏[19]。二氨基庚二酸是賴氨酸合成中的重要物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中,模型組與假手術(shù)組比較,賴氨酸和合成它所需二氨基庚二酸含量升高。說明大鼠體內(nèi)有多發(fā)梗死灶和血瘀致內(nèi)皮損傷,需要大量賴氨酸為修復(fù)受損組織提供必要的氨基酸及能量,促進(jìn)受損組織修復(fù)。在氣虛血瘀腦缺血模型大鼠體內(nèi),虛意味著能量代謝匱乏,賴氨酸產(chǎn)生反應(yīng)性增加,促進(jìn)酮體和葡萄糖代謝,彌補(bǔ)能量不足;當(dāng)藥物干預(yù)后,改善了腦缺血的狀態(tài),對賴氨酸的需求恢復(fù)正常,從而賴氨酸的生成較模型組下降。

谷胱甘肽代謝:在模型組中,焦谷氨酸(Pyroglutamic Acid)的含量下降,在體內(nèi),焦谷氨酸可以在5-羥脯氨酸酶的作用下,轉(zhuǎn)化為谷氨酸(Glutamic Acid,Glu)和γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric Acid,GABA)[20],也可以在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、5-羥脯氨酸酶和谷胱甘肽生物合成酶等作用下,轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽。谷胱甘肽具有清除自由基,保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞膜的作用[21]。在模型組中,焦谷氨酸含量下降,提示可能有更多的焦谷氨酸在酶的作用下轉(zhuǎn)化為谷胱甘肽,谷胱甘肽增加以保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞,當(dāng)藥物干預(yù)后,改善了腦缺血的狀況,對谷氨酰胺的需求恢復(fù)正常,從而減少了焦谷氨酸的消耗。

本研究采用代謝組學(xué)的方法對氣虛血瘀型腦缺血大鼠模型的血清樣本進(jìn)行分析,結(jié)果顯示該模型中賴氨酸、焦谷氨酸、瓜氨酸等成分的代謝都受到干擾。補(bǔ)陽還五湯可以通過調(diào)節(jié)精氨酸和脯氨酸代謝,調(diào)節(jié)一氧化氮與尿素的合成與積累起到對腦組織的保護(hù)作用;也可以通過調(diào)節(jié)谷胱甘肽代謝和賴氨酸的生物合成,彌補(bǔ)能量缺乏,改善氣虛情況,氣虛改善后,對血液的推動力增加,可有效緩解血瘀的癥狀。

利益沖突聲明:無。