田朝暉 廖生偉 夏 偉 楊 超

(1 恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院,恩施,445000; 2 南京中醫(yī)藥大學(xué),南京,210029; 3 南京市江寧醫(yī)院,南京,210029)

乳腺癌是全球女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,也是癌癥致死的主要原因[1-2]。近年來(lái),雖然乳腺癌的常規(guī)治療和靶向治療取得了很大的進(jìn)展,患者的生存及生命質(zhì)量得到了一定提高,但仍存在放化療耐藥、腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移等諸多挑戰(zhàn)[3-4]。因此,尋找治療乳腺癌的有效藥物已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。中藥竹節(jié)香附是毛茛科銀蓮花屬多被銀蓮花AnemoneraddeanaRegel的干燥根莖,性熱,味辛,具有祛風(fēng)濕、散寒止痛、消癰腫之效[5]。竹節(jié)香附素A(Raddeanin A,RaA)是一種齊墩果烷型三萜皂苷,為竹節(jié)香附中的有效成分之一[6]。有研究報(bào)道,RaA可通過(guò)抑制細(xì)胞增殖誘導(dǎo)凋亡等多種途徑發(fā)揮抗腫瘤活性,因而具有較高的藥用價(jià)值[7]。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的自發(fā)性死亡,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是諸多化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞的重要途徑[8]。此外,活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3)/抑癌基因53(P53)信號(hào)通路對(duì)于細(xì)胞凋亡具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[9-10]。當(dāng)前已有關(guān)于RaA抗乳腺癌、胃癌、肝癌和非小細(xì)胞肺癌的研究,其中RaA能夠通過(guò)調(diào)控肉瘤基因SRC/蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)信號(hào)通路及真核延伸因子2激酶(Eucharyotic Elongation Factor-2 Kinase,eEF-2K)發(fā)揮體外抗乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的作用,但RaA是否能夠通過(guò)ROS/STAT3/P53信號(hào)通路調(diào)控MDA-MB-231細(xì)胞凋亡尚不清楚[11-12]。因此,本研究以乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞為對(duì)象,基于ROS/STAT3/P53信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡探討RaA的抗乳腺癌作用機(jī)制,以期為RaA的臨床應(yīng)用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-231)(深圳華拓生物科技有限公司,貨號(hào):HTX1647)采用含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium,DMEM)培養(yǎng)于5%CO2、37 ℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱。

1.1.2 藥物 RaA(上海源葉生物公司,貨號(hào):B21677,純度≥98%)、乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)(MedChemexpress公司,美國(guó),貨號(hào):HY-B0215)。

1.1.3 試劑與儀器 異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)雙染試劑盒(默克公司,德國(guó),貨號(hào):APOAF)、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)(北京索萊寶公司,貨號(hào):CA1210)、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒四氯四乙基苯并咪唑碘化碳氰胺(5,5′,6,6′-Tetrechloro1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazol carbocyanine Iodide,JC-1)(Abcam公司,英國(guó),貨號(hào):ab113850)、ROS熒光試劑盒(Abcam公司,英國(guó),貨號(hào):ab113851)、胎牛血清(Thermo公司,美國(guó),貨號(hào):10099141C)、二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid,BCA)蛋白定量試劑盒(Thermo公司,美國(guó),貨號(hào):23246)、煙酸己可堿染色試劑盒(上海碧云天公司,貨號(hào):C0003);一抗:B細(xì)胞淋巴瘤-2蛋白(B-cell Lymphoma-2,Bcl-2)(北京博奧森公司,批號(hào):bs-33411R)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(BCL-2-associated X Protein,Bax)(北京博奧森公司,批號(hào):bs-0127R)、活化胱天蛋白酶-3(active CASP3,CCASP3),(北京博奧森公司,批號(hào):bsm-33199M)、細(xì)胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C)(北京博奧森公司,批號(hào):bs-0013R)、STAT3(北京博奧森公司,批號(hào):bs-55208R)、p-STAT3(北京博奧森公司,批號(hào):bs-1658R)、P53(北京博奧森公司,批號(hào):bsm-33058M)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase,GAPDH)(北京博奧森公司,批號(hào):bs-0755R);二抗:兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗IgG(Horseradish Peroxidase-labeled IgG,IgG-HRP)(北京博奧森公司,批號(hào):32935S)。

CO2培養(yǎng)箱(IRM公司,德國(guó),型號(hào):ICA175)、Milli-Q超純水系統(tǒng)(默克公司,德國(guó),型號(hào):SynergyTM)、生物顯微鏡(尼康公司,日本,型號(hào):TS100、TS2R)、流式細(xì)胞儀(BD公司,美國(guó),型號(hào):Calibur)、酶標(biāo)儀(Thermo公司,美國(guó),型號(hào):MK3)、小型垂直電泳儀(伯樂(lè)公司,美國(guó),型號(hào):MINI-4)。

1.2 方法

1.2.1 分組 體外培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231),本實(shí)驗(yàn)分為空白組、RaA組、RaA聯(lián)合NAC組3組。

1.2.2 干預(yù)方法 空白組:使用0.1%二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。RaA組:收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于24孔板中,細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL,24 h后加入含有RaA終濃度為0(0.1% DMSO)、2、4和6 μmol/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。RaA聯(lián)合NAC組:在RaA組干預(yù)方法基礎(chǔ)上,加入含有RaA終濃度為0(0.1%DMSO)、4 μmol/L以及含有ROS抑制劑NAC終濃度5 mmol/L的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞存活率 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于96孔板中,細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL。精密稱取RaA溶解于DMSO中配置成50 mmol/L的母液,使用前使用培養(yǎng)基稀釋。24 h后加入含有RaA終濃度為0(0.1% DMSO)、0.2、0.5、1、2、5、10、20和50 μmol/L的培養(yǎng)基干預(yù)。24 h后,每孔加入10 μL CCK8溶液,繼續(xù)孵育1 h,在490 nm處測(cè)定吸光值并計(jì)算存活率,24 h后計(jì)算半抑制濃度(Half Maximal Inhibitory Concentration,IC50)值。

1.2.3.2 Hochest法檢測(cè)凋亡 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于24孔板中,細(xì)胞密度為5×104個(gè)/mL,24 h后加入含有RaA終濃度為0(0.1% DMSO)、2、4和6 μmol/L的培養(yǎng)基干預(yù)。24 h后棄液,磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)洗滌3次,加入300 μL染液,避光孵育10 min后PBS洗滌2次,隨后加入300 μL PBS,最后使用熒光倒置顯微鏡觀察處理后的細(xì)胞并拍照。

1.2.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡 收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板中,細(xì)胞密度為2×105個(gè)/mL,24 h后加入含有RaA終濃度為0(0.1% DMSO)、2、4和6 μmol/L的培養(yǎng)基干預(yù)。24 h后用不含乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetra-acetic Acid,EDTA)的胰酶收集各組細(xì)胞,用PBS洗滌細(xì)胞2次,隨后加入500 μL的結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)重懸細(xì)胞,加入5 μL Annexin V-FITC混勻后,再加入PI染液,室溫混合后避光反應(yīng)15 min,最后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理后的細(xì)胞凋亡率。

1.2.3.4 JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位變化 細(xì)胞處理同“1.2.3.2項(xiàng)”,24 h后用不含EDTA的胰酶收集各組細(xì)胞,用500 μL的JC-1工作液將細(xì)胞懸浮后,孵育15 min,用1×Incubation Buffer洗2次,最后使用熒光倒置顯微鏡觀察處理后的細(xì)胞并拍照,使用Photoshop制作Merge熒光圖片。

1.2.3.5 DCFH-DA法檢測(cè)ROS水平 細(xì)胞處理同“1.2.3.2項(xiàng)”,給藥干預(yù)3 h后,棄去培養(yǎng)基,加入500 μL含有DCFH-DA熒光染料的培養(yǎng)基,避光孵育30 min。吸去熒光染料,用4 ℃預(yù)冷的PBS沖洗3次,加入500 μL 4%多聚甲醛溶液固定30 min,PBS沖洗3次,最后使用熒光倒置顯微鏡觀察處理后的細(xì)胞并拍照。

1.2.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS水平 細(xì)胞處理同“1.2.3.2項(xiàng)”,在此基礎(chǔ)上加入0(0.1% DMSO)、4 μmol/L RaA、5 mmol/L ROS抑制劑NAC的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后依據(jù)ROS試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟處理,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理后的細(xì)胞ROS水平。

1.2.3.7 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blotting)檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Bax、Bcl-2、Cleaved Caspase-3、Cyt-C、P53、p-STAT3和STAT3蛋白表達(dá)。細(xì)胞處理同“1.2.3.2項(xiàng)”,在此基礎(chǔ)上加入0(0.1% DMSO)、4 μmol/L RaA、5 mmol/L ROS抑制劑NAC的培養(yǎng)基干預(yù)。24 h后提取總蛋白,按BCA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟定量,按每孔30 μg蛋白量進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳,結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜,5%脫脂奶粉溶液,用0.1%洗滌緩沖液(Tris Buffered Saline Tween,TBST)配制,封閉2 h。0.1% TBST 1∶1 000稀釋相應(yīng)一抗,4 ℃孵育過(guò)夜,0.1% TBST潤(rùn)洗。0.1% TBST 1∶10 000稀釋HRP標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h,0.1% TBST潤(rùn)洗。加入顯影液,反應(yīng)結(jié)束后吸干顯影液。曝光、顯影并掃描圖像。最后導(dǎo)入分析軟件分析并計(jì)算相應(yīng)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響 RaA干預(yù)24 h后,MDA-MB-231細(xì)胞存活率明顯下降,并且該效果呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,24 h后的IC50值為6.35 μmol/L。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇濃度為2、4、6 μmol/L RaA進(jìn)行。見(jiàn)表1。

表1 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響

2.2 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率的影響 未給藥干預(yù)的MDA-MB-231細(xì)胞核表現(xiàn)狀態(tài)正常;隨著RaA的干預(yù),MDA-MB-231細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的凋亡特征(濃染致密的顆粒塊狀藍(lán)色熒光)。結(jié)果表明,RaA可誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖1。

圖1 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響

與空白組比較,2、4、6 μmol/L RaA干預(yù)后,MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡)明顯增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。結(jié)果表明,RaA可誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生凋亡。見(jiàn)圖2,表2。

圖2 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡)的影響

表2 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡)的影響

2.3 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞線粒體膜電位的影響 未給藥干預(yù)的MDA-MB-231細(xì)胞紅色熒光較強(qiáng);隨著RaA濃度的增加,MDA-MB-231細(xì)胞紅色熒光逐漸變?nèi)?綠色熒光逐漸加強(qiáng),Merge亦呈現(xiàn)變綠趨勢(shì)。結(jié)果表明,RaA可促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞線粒體膜電位坍塌。見(jiàn)圖3。

圖3 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞線粒體膜電位的影響

2.4 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞ROS水平的影響 未給藥干預(yù)的空白組比較,MDA-MB-231細(xì)胞ROS綠色熒光較弱;隨著RaA濃度的增加,MDA-MB-231細(xì)胞ROS綠色熒光逐漸增強(qiáng)。結(jié)果表明,RaA可提升MDA-MB-231細(xì)胞ROS水平。見(jiàn)圖4。

圖4 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞ROS水平的影響

與空白組比較,2、4、6 μmol/L RaA干預(yù)后,RaA組MDA-MB-231細(xì)胞ROS水平明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)圖5,表3。

圖5 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞ROS水平的影響

表3 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞ROS水平的影響

2.5 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較,2、4、6 μmol/L RaA干預(yù)后,RaA組MDA-MB-231細(xì)胞CCASP3、Cyt-C、P53蛋白表達(dá)明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01),STAT3磷酸化水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01);4、6 μmol/L RaA干預(yù)后,RaA組MDA-MB-231細(xì)胞Bax/Bcl-2比值明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)圖6,表4。

圖6 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Bax、Bcl-2、CCASP3、Cyt-C、P53、p-STAT3和STAT3蛋白表達(dá)影響的電泳圖

表4 RaA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Bax、Bcl-2、CCASP3、Cyt-C、P53、p-STAT3和STAT3蛋白表達(dá)的影響

2.6 RaA聯(lián)合NAC對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞ROS水平的影響 與RaA組比較,RaA聯(lián)合NAC組MDA-MB-231細(xì)胞ROS水平明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖7,表5。

圖7 RaA聯(lián)合NAC對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞ROS水平的影響

表5 RaA聯(lián)合NAC對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞ROS水平的影響

2.7 RaA聯(lián)合NAC對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響 與RaA組比較,RaA聯(lián)合NAC組MDA-MB-231細(xì)胞Bax/Bcl-2比值明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),CCASP3、Cyt-C、P53蛋白水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),STAT3磷酸化水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖8,表6。

圖8 RaA聯(lián)合NAC對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Bax、Bcl-2、CCASP3、Cyt-C、P53、p-STAT3和STAT3蛋白水平影響的電泳圖

表6 RaA聯(lián)合NAC對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞Bax、Bcl-2、CCASP3、Cyt-C、P53、p-STAT3和STAT3蛋白水平的影響

3 討論

我國(guó)絕大多數(shù)中藥來(lái)源于藥用植物,其原植物的成分十分復(fù)雜,這種復(fù)雜性體現(xiàn)在成分的結(jié)構(gòu)類型各不相同,復(fù)雜的成分正是中藥發(fā)揮多種藥理作用和多方面功效的重要基礎(chǔ)[13]。值得注意的是,不斷有研究證實(shí)這些中藥單體成分可通過(guò)調(diào)節(jié)多種生物學(xué)過(guò)程,在腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮作用,并且具有高效低毒的特點(diǎn)[14]。因此,包括RaA在內(nèi)的諸多中藥單體成分可能成為腫瘤的潛在治療藥物。

不受控制的細(xì)胞增殖和逃避細(xì)胞凋亡是腫瘤的2大特征,抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡成為治療腫瘤的重要途徑[15]。本研究中,RaA明顯抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡,顯示出較好的抗乳腺癌活性。線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡主要的分子途徑,線粒體膜電位去極化是其發(fā)生的重要標(biāo)志[16]。本研究中,RaA可誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞線粒體膜電位坍塌,提示RaA可能誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑。線粒體凋亡途徑主要受Bcl-2家族蛋白包括Bax、Bcl-2的調(diào)控[15]。隨著B(niǎo)ax/Bcl-2比值的變化,導(dǎo)致線粒體膜電位降低及通透性增加,線粒體內(nèi)部的Cyt-C因而釋放至細(xì)胞質(zhì)[17-18]。胞質(zhì)中Cyt-C可以與凋亡因子作用形成凋亡復(fù)合體,活化Caspase-9,進(jìn)一步活化凋亡最終執(zhí)行蛋白Caspase-3,進(jìn)而啟動(dòng)線粒體凋亡途徑[19]。在本研究中,RaA明顯提升MDA-MB-231細(xì)胞Bax/Bcl-2比值,以及上調(diào)Cyt-C和CCASP3蛋白表達(dá),進(jìn)一步提示RaA可能通過(guò)誘導(dǎo)線粒體凋亡而發(fā)揮體外抗乳腺癌作用。

ROS作為細(xì)胞氧代謝的副產(chǎn)物,通常可以參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),但較高濃度的ROS會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和,DNA,導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。腫瘤抑制基因P53是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,對(duì)細(xì)胞信號(hào)如DNA損傷和ROS等做出防御性反應(yīng)。STAT3是STAT家族成員之一,可被上游ROS信號(hào)激活而調(diào)控Bcl-2家族的抗凋亡蛋白表達(dá),在惡性腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用[21]。另有研究表明,阻斷癌細(xì)胞中的STAT3活性可促進(jìn)P53的表達(dá),從而導(dǎo)致P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[22]。因此,ROS/STAT3/P53信號(hào)通路為調(diào)控細(xì)胞線粒體凋亡的重要途徑。在本研究中,RaA明顯提升MDA-MB-231細(xì)胞的ROS水平,下調(diào)STAT3的磷酸化水平,以及上調(diào)P53的蛋白表達(dá),提示RaA可能通過(guò)激活ROS/STAT3/P53信號(hào)通路誘導(dǎo)線粒體凋亡。NAC為一種常用的ROS抑制劑。在本研究中,NAC與RaA聯(lián)用后,MDA-MB-231細(xì)胞ROS水平降低,STAT3磷酸化水平上調(diào),P53蛋白表達(dá)下調(diào),MDA-MB-231細(xì)胞ROS/STAT3/P53信號(hào)通路被抑制。此外,MDA-MB-231細(xì)胞Bax/Bcl-2比值降低,Cyt-C和CCASP3蛋白表達(dá)下調(diào),MDA-MB-231細(xì)胞線粒體凋亡被逆轉(zhuǎn)。以上說(shuō)明,RaA通過(guò)激活ROS/STAT3/P53信號(hào)通路誘導(dǎo)線粒體凋亡而發(fā)揮體外抗乳腺癌作用。

綜上所述,中藥單體RaA可通過(guò)調(diào)控ROS/STAT3/P53信號(hào)通路誘導(dǎo)線粒體凋亡而在體外發(fā)揮抗乳腺癌作用,本研究結(jié)果可為RaA及含RaA中藥臨床防治乳腺癌提供一定思路。后期將結(jié)合更多乳腺癌細(xì)胞系及動(dòng)物實(shí)驗(yàn),并納入更為全面的上下游信號(hào)途徑分子系統(tǒng)闡明RaA的抗乳腺癌機(jī)制。

利益沖突聲明:無(wú)。