白玉瑩 徐新房 張姝妍 程水清 王 璇 文 佳 李春帥 徐文娟 楊琳琳 李向日

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制研究中心/中藥品質(zhì)評價北京重點實驗室,北京,102488)

中醫(yī)治療癡呆歷史悠久,癡呆病名首見于漢代《華佗神醫(yī)秘傳》,主要病機(jī)為神機(jī)失用,腦髓空虛,氣血不足,導(dǎo)致心神失養(yǎng)。本病多表現(xiàn)為本虛標(biāo)實,以心肝脾腎虛為本,痰瘀內(nèi)生、氣血逆亂為標(biāo)[1]。治療以補(bǔ)益氣血元陰為主,兼以祛痰、活血化瘀等。人參為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的栽培品,于秋季采挖,洗凈,蒸制后,干燥而得的根和根莖。鮮人參經(jīng)蒸制后得到紅參,《中華人民共和國藥典》(2020版)中記載其味甘、微苦,溫。歸脾、肺、心、腎經(jīng)。具有大補(bǔ)元氣、復(fù)脈固脫、益氣攝血的作用[2]。紅參味甘而厚,性偏溫,其藥性與AD的證候相對應(yīng)。因此,在臨床上,紅參廣泛用于AD的治療。

果蠅壽命短,繁殖力強(qiáng),其代謝、生理狀況和生長發(fā)育同哺乳動物基本相似,是研究壽命及抗衰老藥物的理想模型。因此,常被用來研究人神經(jīng)退行性疾病[3]。果蠅成蟲大腦有著復(fù)雜的神經(jīng)回路和神經(jīng)纖維網(wǎng),可調(diào)節(jié)各種行為,如飛行、打斗、梳理、覓食、學(xué)習(xí)和記憶、睡覺和晝夜節(jié)律等。因此,許多作用于哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物被證實能在果蠅的大腦內(nèi)發(fā)揮同樣的作用[4]。人和果蠅在基因和代謝水平上也都存在著極大的相似性[5-6]。

紅參多糖是紅參中主要活性成分之一,具有抗氧化、抗炎、抗衰老、提高免疫力等作用[7-9],然而關(guān)于紅參多糖治療AD的研究較少。故本實驗以轉(zhuǎn)基因AD果蠅為模型,通過果蠅攀爬能力實驗,果蠅嗅覺記憶實驗,測定果蠅腦組織β淀粉樣蛋白1-42(Beta Amyloid 1-42,Aβ1-42)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、環(huán)腺苷酸(Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)及乙酰膽堿酯酶(Acetylcholinesterase Chloride,AChE)水平,探究紅參多糖對AD的治療作用機(jī)制,進(jìn)一步拓寬紅參多糖的藥用途徑,為相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 野生型(Canton-S)黑腹果蠅(Drosophila Melanogaster)、Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅,均由北京師范大學(xué)孫林教授惠贈。對果蠅生活環(huán)境實行每天12/12 h明暗光照周期處理,溫度(25±1)℃,相對濕度50%～60%。

1.1.2 藥物 人參藥材(JARS-180506X)于吉林(南嶺參場)收集,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)李向日教授鑒定為五加科植物人參PanaxginsengC.A.Mey.的根及根莖。紅參多糖:根據(jù)課題組前期建立的紅參炮制專利方法對人參原藥材進(jìn)行炮制得到紅參藥材,將所得到的紅參藥材按實驗室前期研究的提取方法制得紅參多糖。鹽酸多奈哌齊(上海源葉生物有限公司,批號:110119-84-1)。

此功能是本系統(tǒng)的主要功能，需要實現(xiàn)對查詢條件的設(shè)置與檢查、對票務(wù)數(shù)據(jù)的收集，并將數(shù)據(jù)傳輸至視圖頁面進(jìn)行展示。由于在線查詢需要使用網(wǎng)絡(luò)帶寬，所以需要對此功能進(jìn)行限制，用戶登錄后才可使用在線查詢系統(tǒng)。

1.1.3 試劑與儀器 苯甲酸(北京化工廠,貨號:20211025);丙酸(天津福晨化學(xué)試劑有限公司,貨號:20220117);蔗糖(天津福晨化學(xué)試劑有限公司,貨號:20211025);瓊脂(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,貨號:20210203);總蛋白(Total Protein,TP)試劑盒(貨號:RGB-30002)、Aβ1-42試劑盒(貨號:RGB-60332H)、SOD試劑盒(貨號:RGB-40001)、MDA試劑盒(貨號:RGB-40003)、cAMP試劑盒(貨號:RGB-60320D)、AChE試劑盒(貨號:RGB-60410D)均購于北京瑞格博科技發(fā)展有限公司。全自動生化分析儀(貝克曼庫爾特有限公司,美國,型號:UniCel DxC 600 Synchron);酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司,芬蘭,型號:Multiskan MK3)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 12 h內(nèi)孵化出的幼蟲不會交配,在12 h內(nèi)把雌雄果蠅分開培養(yǎng),所得的果蠅即為處女蠅。每天晚上19:00—20:00將培養(yǎng)瓶內(nèi)的成蠅轉(zhuǎn)移,次日早晨7:00—8:00對新羽化的果蠅進(jìn)行挑選,在二氧化碳麻醉板上收集12 h內(nèi)羽化的雄性處女蠅,將其移入裝有新鮮培養(yǎng)基的玻璃指管內(nèi),每個玻璃指管按照實驗需求裝入果蠅20或30只,并標(biāo)明日齡。每2天更換1次培養(yǎng)基。共分為4組:野生組,即正常Canton-S型處女蠅;Aβ42轉(zhuǎn)基因處女蠅隨機(jī)分為模型組、陽性對照組和紅參多糖組3組。連續(xù)喂養(yǎng)8 d,每2天更換1次培養(yǎng)基。

1.2.2 給藥方法 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制備:玉米粉40 g、瓊脂3.5 g、蔗糖35 g,以上材料倒入500 mL蒸餾水中,不斷攪拌并加熱,煮沸后3 min,?；?放涼至70 ℃左右,加入15%苯甲酸1 mL、丙酸1 mL,持續(xù)攪拌,冷卻至60 ℃后,加入酵母粉10 g,混勻后,倒入高12 cm、直徑3 cm經(jīng)高溫滅菌的指管中,培養(yǎng)基厚度約3 cm。培養(yǎng)基需要倒置于干燥實驗室內(nèi)24 h以上。經(jīng)過摸索確定最佳給藥劑量,在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入實驗室自制的紅參多糖和鹽酸多奈哌齊(陽性對照藥物),制成濃度為1 mg/mL紅參多糖和10 μmol/L鹽酸多奈哌齊培養(yǎng)基。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 果蠅攀爬能力實驗 果蠅攀爬能力實驗是利用果蠅的反趨地性，通過觀察果蠅在垂直的指管內(nèi)的爬行情況來測試果蠅的運動能力。將以上4組待測果蠅分別裝入未裝培養(yǎng)基的空指管中，果蠅于空指管內(nèi)適應(yīng)5 min，輕晃指管將果蠅搖至瓶底，果蠅由于習(xí)性將向上爬。測試10 s到達(dá)指管頂部的果蠅個數(shù)(A)，至少連續(xù)記錄5次，每次至少間隔1 min，每次晃動的力度一致。計算攀附指數(shù)(Climbing Index，CI)即CI=A/總數(shù)。記錄5次，取平均值。CI越高，證明果蠅的運動能力越強(qiáng)。測試時，每管內(nèi)隨機(jī)放置果蠅20只，每個組別各測試6管，每組共計120只，4組共計480只(正常Canton-S型處女蠅120只，Aβ42轉(zhuǎn)基因處女蠅隨機(jī)分為模型組、陽性對照組和紅參多糖組共360只，雌雄各半)。

1.2.3.2 果蠅嗅覺記憶實驗 將以上4組待測果蠅分別放入空指管內(nèi)饑餓2 h后,放入1 000 mL的燒杯中。燒杯中放有2個100 mL帶孔離心管,其中一個離心管內(nèi)直接放入香蕉(可食離心管,也可簡稱為可食管),果蠅可聞到氣味,并且通過孔洞進(jìn)入離心管內(nèi)時可直接吃到香蕉;另一個在香蕉的外面包有紗布,果蠅只能聞到氣味,但無法吃到香蕉。每隔1 h記錄進(jìn)入無障礙可食離心管果蠅的數(shù)目,連續(xù)記錄8 h,每組記錄6次,取平均值。測試時,每管內(nèi)隨機(jī)放置果蠅30只,每組別各測試6管,每組共計180只,4組共720只。

1.2.3.3 果蠅腦組織TP含量測定 將果蠅腦組織勻漿提取液適當(dāng)稀釋,按TP含量測定試劑盒步驟,用酶標(biāo)儀在546 nm處測定其OD值,根據(jù)公式計算TP含量。測定時,每30只果蠅為一個樣本,每組別各測定6個樣本,每組180只,4組共720只。

1.2.3.4 果蠅腦組織Aβ1-42含量的測定 按Aβ1-42試劑盒操作說明,用酶標(biāo)儀在450 nm處測定其OD值,根據(jù)Aβ1-42回歸曲線計算Aβ1-42含量。測定時,每30只果蠅為一個樣本,每個組別各測定6個樣本,每組180只,4組共720只。

1.2.3.5 果蠅腦組織SOD活性的測定 按SOD試劑盒操作說明,用酶標(biāo)儀在550 nm處測定其OD值,根據(jù)公式,計算SOD活性。測定時,每30只果蠅為一個樣本,每個組別各測定6個樣本,每組180只,4組共720只。

1.2.3.6 果蠅腦組織MDA含量的測定 按MDA試劑盒操作說明,用酶標(biāo)儀在532 nm處測定其OD值,根據(jù)公式,計算MDA含量。測定時,每30只果蠅為一個樣本,每個組別各測定6個樣本,每組180只,4組共720只。

1.2.3.7 果蠅腦組織cAMP含量的測定 按cAMP試劑盒操作說明,用酶標(biāo)儀在450 nm處測定其OD值,根據(jù)cAMP回歸曲線計算cAMP含量。測定時,每30只果蠅為一個樣本,每個組別各測定6個樣本,每組180只,4組共720只。

1.2.3.8 果蠅腦組織AChE含量的測定 按AChE試劑盒操作說明,用酶標(biāo)儀在450 nm處測定其OD值,根據(jù)AChE回歸曲線計算AChE含量。測定時,每30只果蠅為一個樣本,每個組別各測定6個樣本,每組180只,4組共720只。

2 結(jié)果

2.1 紅參多糖對Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅攀爬能力的影響 雌性和雄性果蠅,野生組與模型組、紅參多糖組、陽性對照組CI差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較,紅參多糖組、陽性對照組CI均顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),此外,雌雄紅參多糖組與陽性藥對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 紅參多糖對Aβ42轉(zhuǎn)基因雄/雌性果蠅攀爬能力的影響

2.2 紅參多糖對Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅嗅覺記憶的影響 各組果蠅進(jìn)入無障礙可食離心管的數(shù)量隨著時間的增長皆呈上升趨勢,且在同一時間段內(nèi),野生組果蠅進(jìn)入無障礙可食離心管的數(shù)量始終高于其他組,直至果蠅全部進(jìn)入。與模型組比較，陽性對照組、紅參多糖組進(jìn)入無障礙可食離心管的數(shù)量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；2 h后，紅參多糖組與野生組數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；7 h后，陽性對照組與野生組數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖1。

圖1 不同給藥組的Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅各時段進(jìn)入無障礙可食管的數(shù)量

表2 紅參多糖對Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅嗅覺記憶的影響

2.3 紅參多糖對Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅腦組織Aβ1-42含量的影響 4組Aβ1-42差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較,紅參多糖組、陽性對照組果蠅腦組織Aβ1-42含量顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而紅參多糖組與陽性對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 紅參多糖對Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅腦組織Aβ1-42含量的影響

2.4 紅參多糖對Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅腦組織SOD活性和MDA含量的影響 與模型組比較,紅參多糖組、陽性對照組SOD活性均顯著升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01),而紅參多糖組與陽性對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較,紅參多糖組、陽性對照組MDA含量顯著降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01),而紅參多糖組與陽性對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 紅參多糖對Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅腦組織SOD活性及MDA含量的影響

2.5 紅參多糖對Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅腦組織cAMP、AChE含量的影響 4組cAMP含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較,紅參多糖組、陽性對照組的cAMP、AChE含量均顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),而紅參多糖組與陽性對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 紅參多糖對Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅腦組織cAMP、AChE含量的影響

3 討論

神經(jīng)元細(xì)胞外Aβ沉積是AD主要病理變化特征之一。腦脊液中其水平能夠在一定程度上反映大腦中Aβ的沉積。Aβ根據(jù)C末端結(jié)構(gòu)分為Aβ1-40和Aβ1-42形式,在腦組織、腦脊液和血液中均能檢測出。因此,Aβ1-40、Aβ1-42是臨床比較公認(rèn)的AD診斷生物學(xué)標(biāo)志物。其中,Aβ1-42是大腦中毒性較強(qiáng)、易于形成原纖維的一種沉積[10]。

SOD是一種抗氧化酶,可以清除自由基[11]。MDA是脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,可作為機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度的指標(biāo)[12]。大腦是耗氧最多、抗氧化酶較少的器官之一,導(dǎo)致其神經(jīng)元清除自由基能力弱,不飽和脂肪酸更易氧化。此外,血腦屏障阻止了某些抗氧化劑通過。因此,大腦對氧化應(yīng)激特別敏感,這是導(dǎo)致多種神經(jīng)退行性疾病的主要原因[13-14]。氧化應(yīng)激在AD各階段均表現(xiàn)明顯,氧化程度隨疾病進(jìn)展而增加[15]。因此,抗氧化可能是開發(fā)治療或延緩AD治療方法的有效途徑。許海順等[16]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)紅參精制多糖具有一定的清除自由基及抗氧化作用。PENG等[8]發(fā)現(xiàn)在D-gal誘導(dǎo)的衰老小鼠中,紅參較人參更能抑制AChE和MDA水平的升高,提高血清中SOD和過氧化氫酶(Catalase,CAT)的表達(dá)并改善腦組織結(jié)構(gòu)和行為學(xué)實驗,認(rèn)為紅參抗衰老活性優(yōu)于人參可能是依賴于其中存在更多的非淀粉多糖。cAMP是影響神經(jīng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的因子,在果蠅學(xué)習(xí)記憶中心蘑菇體神經(jīng)細(xì)胞中發(fā)揮重要作用,cAMP的上調(diào)會減少神經(jīng)元的存活造成神經(jīng)毒性以及認(rèn)知功能下降。乙酰膽堿為一類能對各類膽堿受體發(fā)揮特異性作用的神經(jīng)遞質(zhì),AChE是乙酰膽堿的水解酶。當(dāng)AChE水平下降時,腦內(nèi)乙酰膽堿分解率降低,有利于神經(jīng)信號的傳導(dǎo)。所以AD認(rèn)知功能受損傷程度與AChE含量負(fù)相關(guān)[17]。

中藥多糖的抗AD作用取得了很大的進(jìn)展,并得到了廣泛關(guān)注。胡文繼[18]發(fā)現(xiàn)猴頭菌發(fā)酵菌絲體純化多糖能夠改善AD小鼠在行為學(xué)測試中的表現(xiàn),可改善AD小鼠腦中的神經(jīng)元損傷,且對其他臟器無不良反應(yīng),同時該多糖還減少了小鼠海馬區(qū)的Aβ1-42的沉積和Tau蛋白的過度磷酸化。研究表明,碳水化合物在蛋白質(zhì)折疊、分泌、生物大分子識別和相互作用等過程中發(fā)揮著重要作用。因此,它們影響細(xì)胞的生長和分化、形態(tài)發(fā)生、遷移和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等[19]。從忍冬花中分離到的均質(zhì)多糖LJW0F2,它能以劑量依賴性的方式抑制Aβ42的聚集,并減弱在SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中由Aβ42聚集誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[20]。

SHIN等[9]發(fā)現(xiàn)紅參多糖顯著減輕了5XFAD小鼠AD模型下丘細(xì)胞中Aβ的積累、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)元丟失和線粒體功能障礙,改善了Aβ處理的HT22細(xì)胞的線粒體缺陷。同時,紅參多糖顯著增加了健康和AD大腦中神經(jīng)干細(xì)胞的成人海馬神經(jīng)發(fā)生,顯著增加了HT22細(xì)胞的增殖,增強(qiáng)和恢復(fù)了AD小鼠的認(rèn)知功能。其認(rèn)為紅參多糖參與老年大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織維持的蛋白質(zhì)的改變,并改善了AD的病理狀況,認(rèn)為紅參多糖可能是衰老和AD治療的潛在候選藥物。

課題組前期實驗發(fā)現(xiàn),紅參較人參有更好的防治AD作用,推測紅參中多糖以及皂苷的變化可能是增強(qiáng)防治AD的活性基礎(chǔ)[13]。以往對于紅參的研究主要集中在皂苷上,尤其是稀有皂苷[21]。研究表明紅參皂苷對衰老和年齡相關(guān)神經(jīng)退行性疾病具有療效,然而目前關(guān)于紅參多糖在衰老和AD大腦中的治療應(yīng)用和可能的作用機(jī)制研究較少。課題組前期通過對紅參中的多糖含量進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)其含量較高(約為30%)[22],且中藥多糖對抗AD的作用取得了很大的進(jìn)展,故開展本研究以探討紅參多糖對于AD的治療作用。

本研究從果蠅攀爬能力實驗,嗅覺記憶實驗,果蠅腦組織Aβ1-42、SOD、MDA、cMAP及AChE的水平論證了紅參多糖對于AD果蠅的治療作用。實驗結(jié)果表明,紅參多糖可顯著提高Aβ42轉(zhuǎn)基因果蠅的CI以及進(jìn)入無障礙可食管的數(shù)量。嗅覺短期記憶能力實驗發(fā)現(xiàn),果蠅可以憑借敏銳的嗅覺來辨認(rèn)氣味的方向,經(jīng)過多次練習(xí)后,最后能趨向可以吃到的食物,避開不能吃到的食物。此外,紅參多糖可降低果蠅腦組織Aβ1-42、MDA、cAMP、AChE的含量,提高果蠅腦組織SOD活性。由此得出,紅參多糖對AD確有治療作用,包括提高果蠅的運動能力、學(xué)習(xí)記憶能力、改善認(rèn)知功能障礙。其作用機(jī)制可能與其改善果蠅腦組織Aβ蛋白沉積、抗氧化、改善神經(jīng)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面有關(guān),這一結(jié)論為紅參的開發(fā)利用提供了又一可靠思路。

利益沖突聲明:無。