陳鈺,丁清鋒,隋雪松,高路,2,3*

自然流產(chǎn)約占全部妊娠的15%,且多數(shù)為早期流產(chǎn)(妊娠不足12周)。流產(chǎn)可分為偶發(fā)性流產(chǎn)和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA),歐洲人類生殖及胚胎學(xué)會(huì)(European Society of Human Reproduction and Embryology,ESHRE)指南將RSA定義為連續(xù)3次及以上的妊娠不足22周的流產(chǎn),其具體病因仍不明確,目前被認(rèn)為是多因素誘發(fā)的疾病[1]。

RSA的病因部分可由遺傳學(xué)因素解釋,例如夫婦染色體異常、女性關(guān)鍵基因突變或呈多態(tài)性等因素均可引起RSA[2-3]。但遺傳學(xué)對(duì)流產(chǎn)的預(yù)測(cè)能力與全球日益加重的流產(chǎn)負(fù)擔(dān)不相適應(yīng),仍有許多無法用遺傳學(xué)因素闡明的患病機(jī)制。

近年來,DNA甲基化作用于配子發(fā)生、胚胎發(fā)育和母胎界面形成等一系列生殖過程的研究不斷涌現(xiàn),DNA甲基化異常可能會(huì)通過抑制胚胎中某些關(guān)鍵基因的表達(dá),干擾胚胎的正常生長(zhǎng)發(fā)育,從而導(dǎo)致RSA。雖然目前關(guān)于RNA甲基化異常與流產(chǎn)發(fā)病機(jī)制的研究尚不多,但已有新近研究發(fā)現(xiàn)RSA患者胎盤絨毛等組織中RNA甲基化異?，F(xiàn)象。本文通過綜述DNA甲基化和RNA甲基化修飾在RSA中的研究進(jìn)展,加深對(duì)DNA甲基化和RNA甲基化修飾調(diào)控流產(chǎn)機(jī)制的理解,并有望為DNA甲基化和RNA甲基化修飾異常所致RSA的診治提供新視角。

1 DNA甲基化修飾在RSA中的研究進(jìn)展

DNA甲基化在表觀遺傳調(diào)控中發(fā)現(xiàn)最早、研究最深入,是哺乳動(dòng)物基因表達(dá)調(diào)控的主要表觀遺傳學(xué)形式。在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化作用下,以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基的供體,DNA序列上特定的堿基將通過共價(jià)鍵結(jié)合的方式獲得一個(gè)甲基基團(tuán),從而影響基因表達(dá),但DNA脫氧核苷酸的順序及其組成并未發(fā)生改變[4]。在胚胎發(fā)育過程中,配體甲基化模式在卵裂期至桑葚胚期被完全清除后,受精卵新甲基化模式進(jìn)行重建,使非組織相關(guān)基因以及有害基因等沉默,并通過控制不同發(fā)育階段以及不同組織器官內(nèi)的DNA甲基化水平及模式,協(xié)調(diào)細(xì)胞譜系分化和器官發(fā)生[5-6]。DNA去甲基化對(duì)相關(guān)基因調(diào)控序列起激活作用,而DNA甲基化扮演的是“鎖定”原先基因沉默效果的作用,防止已被沉默的基因發(fā)生“再激活”。因此,DNA甲基化異常的發(fā)現(xiàn)可以為機(jī)體健康與疾病提供理論基礎(chǔ)。

DNA甲基化作用于胚胎發(fā)育、母胎界面形成等生殖過程,DNA甲基化異常可能會(huì)抑制胚胎中某些關(guān)鍵基因的表達(dá),從而干擾胚胎的正常發(fā)育和生長(zhǎng),并導(dǎo)致RSA。

1.1 蛻膜中的DNA甲基化異常

多項(xiàng)研究表明,DNA甲基化異常在轉(zhuǎn)錄、翻譯等多個(gè)階段影響關(guān)鍵蛋白的表達(dá),進(jìn)而影響蛻膜化進(jìn)程,減少滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。Xie等[7]發(fā)現(xiàn),RSA蛻膜中長(zhǎng)非編碼RNA HZ08(long non-coding RNA,lncHZ08)啟動(dòng)子的DNA甲基化降低,介導(dǎo)lncHZ08轉(zhuǎn)錄的雌激素受體增加。lncHZ08表達(dá)增高抑制PI3K/pAKT/p-P21/CDK2通路,從而減少滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并進(jìn)一步誘導(dǎo)流產(chǎn)的發(fā)生。Fatima等[8]發(fā)現(xiàn)在RSA患者蛻膜的轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)水平上觀察到細(xì)胞凋亡與較高水平的p53表達(dá)之間呈正相關(guān),凋亡相關(guān)蛋白Bax上調(diào);而對(duì)照組DNA甲基化相關(guān)基因(dnmt1和g9a)以及p53甲基化水平高,抗凋亡蛋白Bcl-2上調(diào),從而維持正常妊娠。

蛻膜在免疫耐受和維持妊娠之間保持微妙的平衡,DNA甲基化異常干擾蛻膜相關(guān)基因的表達(dá),導(dǎo)致免疫耐受性下降、浸潤(rùn)失敗和子宮螺旋動(dòng)脈重構(gòu)不良,可能引起植入不當(dāng)、炎癥和胎盤發(fā)育異常[9]。RSA蛻膜的DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn),cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白5(cAMP responsive element binding protein 5,CREB5)基因的低甲基化導(dǎo)致CREB5和血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶3過度表達(dá),可能通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)促進(jìn)RSA的發(fā)生[10]。此外,研究發(fā)現(xiàn)RSA患者叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)基因及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)特異性去甲基化區(qū)的甲基化水平顯著高于對(duì)照組,可能是RSA患者CD4+T細(xì)胞中Foxp3基因的轉(zhuǎn)錄水平降低和Treg比例降低的原因之一[11]。

1.2 胎盤絨毛中的DNA甲基化異常

研究發(fā)現(xiàn)RSA患者的絨毛組織是低甲基化的,并伴有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT 1/3a/3b等)的下調(diào)和DNA去甲基化酶(ten-eleven translocation 1/2/3,TET1/2/3)的上調(diào)。DNMT1和DNMT3a的表達(dá)降低會(huì)使滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖受到抑制,最終導(dǎo)致胚胎植入率顯著降低;而TET1和TET2在發(fā)育過程中通過影響細(xì)胞周期蛋白B1的表達(dá),調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的完整性和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制周期,對(duì)胎兒的發(fā)育有重要影響[12]。由此導(dǎo)致的母胎界面胎盤絨毛中某些特異性基因的DNA甲基化異?？赡芘cRSA的發(fā)生密切相關(guān)。比如,Wang等[13]發(fā)現(xiàn)RSA患者琥珀酸脫氫酶復(fù)合物鐵硫亞基DNA甲基化減少,導(dǎo)致胚胎植入率降低;Du等[14]證明含PR域蛋白1啟動(dòng)子的低甲基化誘導(dǎo)GATA2-FOXA1復(fù)合物的募集,促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和凋亡;Wu等[15]提出胎盤絨毛中胰島素生長(zhǎng)因子2的DNA低甲基化可能影響早期妊娠的穩(wěn)定性等。此外,胎盤的形成和定位是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和細(xì)胞外基質(zhì)分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)之間平衡的結(jié)果,MMPs/TIMPs啟動(dòng)子甲基化水平升高會(huì)使MMPs/TIMPs失衡,從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜基質(zhì)過度降解和RSA發(fā)生[16]。盡管RSA患者的絨毛組織DNA總體上是甲基化的,但這并不代表所有與RSA相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵蛋白DNA及其作用元件都是低甲基化。Matsumoto等[17]發(fā)現(xiàn)RSA患者絨毛膜中精子發(fā)生相關(guān)富含絲氨酸2樣蛋白(spermatogenesis associated serine rich 2 like protein,SPATS2L)基因的增強(qiáng)子區(qū)域甲基化程度明顯高于對(duì)照組,導(dǎo)致SPATS2L蛋白在前者的表達(dá)降低,影響侵襲和遷移能力,降低胚胎發(fā)育率。

基因組印記是父代等位基因通過配子傳遞給后代的過程,在發(fā)育過程中印記基因的甲基化狀態(tài)具有組織特異性和階段特異性。超過50%的已知印記基因在胎盤中表達(dá),印記基因印記控制區(qū)的DNA甲基化異常可導(dǎo)致印記障礙或缺失,影響胎兒新陳代謝和神經(jīng)發(fā)育,進(jìn)而影響胚胎發(fā)育并導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局。Sazhenova等[18]對(duì)120例RSA患者和134例偶發(fā)性流產(chǎn)患者絨毛膜細(xì)胞滋養(yǎng)層和胚胎外中胚層樣本中7個(gè)印記基因的表觀突變進(jìn)行檢測(cè),并將100例人工流產(chǎn)樣本作為對(duì)照組,結(jié)果表明RSA患者胎盤組織中印記基因的表觀突變?cè)龆?導(dǎo)致RSA患者多位點(diǎn)印記障礙增多。其中NLRP7、KHDC3L、NLRP5、NLRP2和PADI6突變均會(huì)引起多位點(diǎn)印記障礙和胎兒發(fā)育停滯。在檢測(cè)RSA絨毛樣本中母代遺傳印記基因GRB10和父代遺傳印跡基因IGF2和PEG3的DNA甲基化模式時(shí),Liu等[19]報(bào)告稱兩者均呈現(xiàn)顯著的高DNA甲基化,其中PEG3的缺失和突變可能導(dǎo)致胎盤營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸不足和子代生長(zhǎng)遲緩,從而可能導(dǎo)致子代死亡。人類絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)在胚胎發(fā)育和妊娠維持中發(fā)揮重要作用,其編碼基因絨毛促性腺素β肽5(chorionic gonadotropin β 5,CGB5)和CGB8攜帶胎盤表達(dá)的印記位點(diǎn)。當(dāng)CREB5啟動(dòng)子在RSA中半甲基化時(shí),hCG分泌減少,流產(chǎn)率顯著增加[10]。亦有實(shí)驗(yàn)表明,RSA胎盤絨毛中其他眾多印記基因(如H19/PEG1/LIT1/SNRPN)的甲基化水平顯著高于對(duì)照組,可見胎盤絨毛中印記基因的異常高DNA甲基化從不同方面影響胎兒生長(zhǎng)發(fā)育,誘導(dǎo)RSA的發(fā)生[20-21]。

1.3 RSA患者配偶精子中的DNA甲基化異常

除了母源因素外,RSA患者配偶精子的DNA甲基化異常會(huì)干擾精子發(fā)生和胚胎發(fā)育,導(dǎo)致著床異常,進(jìn)而引起RSA。Camprubí等[22]分析了不育男性和對(duì)照組精子中H19-ICR、KvDMR、SNRPN-ICR、IG-DMR和MEG3-DMR的DNA甲基化譜,發(fā)現(xiàn)不育患者比正常組有更多的異常印記。El等[23]發(fā)現(xiàn),流產(chǎn)組配偶精子內(nèi)ALU重復(fù)序列的甲基化水平明顯低于正常組。

1.4 非整倍體因素與DNA甲基化異常的相互作用

Vasilyev等[24]發(fā)現(xiàn)表觀遺傳機(jī)制與非整倍體發(fā)生之間可能存在關(guān)聯(lián)。研究檢測(cè)了流產(chǎn)患者絨毛膜中的19個(gè)長(zhǎng)穿插核元件1(long interspersed nuclear elements,LINE-1)啟動(dòng)子CpG位點(diǎn)甲基化水平,結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,三體和X單體流產(chǎn)絨毛膜絨毛的LINE-1甲基化水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,LINE-1甲基化水平對(duì)不同非整倍體的流產(chǎn)具有特異性,且LINE-1甲基化水平隨胎齡增加。Tolmacheva等[25]研究也確定了16三體流產(chǎn)絨毛膜中DNA甲基化的變化,發(fā)現(xiàn)在16三體流產(chǎn)中特定基因的啟動(dòng)子高甲基化具有特異性,且大多數(shù)差異DNA甲基化基因編碼分泌蛋白、信號(hào)肽和具有二硫鍵的受體,其中某些基因在胎盤和胚胎發(fā)育(GATA3-AS1、TRPV6、SCL13A4、CALCB)及有絲分裂紡錘體的形成中發(fā)揮作用。

2 RNA甲基化修飾在RSA中的研究進(jìn)展

與DNA甲基化類似,RNA甲基化也是基因表達(dá)的關(guān)鍵表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制,目前已發(fā)現(xiàn)的RNA甲基化修飾包括6-甲基腺嘌呤(m6A)、5-甲基胞嘧啶和N1-甲基腺嘌呤等幾種類型,其中尤以m6A修飾最具特征。RNA m6A甲基化修飾占總腺苷殘基的0.1%～0.4%,普遍存在于RNA的DRACH保守序列(其中D=A、G或U;R=A或G;H=A、C或U)[26]。目前已經(jīng)證實(shí)影響m6A修飾的三類蛋白質(zhì):甲基轉(zhuǎn)移酶類(“書寫”蛋白)、去甲基轉(zhuǎn)移酶類(“擦除”蛋白)和甲基結(jié)合蛋白類(“讀取”蛋白)。m6A甲基轉(zhuǎn)移酶是一種復(fù)合物,由METTL3(methyltransferase-like protein 3)、METTL14、WTAP(Wilms’ tumor 1-associated protein)和VIRMA (vir-like m6A methyltransferase-associated protein) 等多組分共同構(gòu)成,并在RNA甲基化中發(fā)揮催化作用。m6A去甲基轉(zhuǎn)移酶FTO(fat mass and obesity-associated protein)和ALKBH5(alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase homolog 5)的發(fā)現(xiàn),證明了m6A修飾是可逆的,可通過甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基轉(zhuǎn)移酶動(dòng)態(tài)調(diào)控m6A 修飾的甲基化過程[27-28]。RNA m6A修飾發(fā)揮生物學(xué)作用還需要結(jié)合相應(yīng)的蛋白質(zhì),即m6A甲基結(jié)合蛋白,如YTHDC1(YTH domain-containing protein 1)、YTHDC2、YTHDF1(YTH domain-containing family protein 1)、YTHDF2和YTHDF3等[29]。RNA m6A修飾在一系列生物學(xué)過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,包括RNA新陳代謝、生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞自噬和分裂、免疫調(diào)節(jié)和多種疾病等。新近研究表明RNA m6A修飾在流產(chǎn)中也發(fā)揮重要作用[30]。

Li等[31]發(fā)現(xiàn)RSA患者的胎盤絨毛組織中m6A甲基化水平顯著降低,并通過絨毛外植體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明了在人滋養(yǎng)層細(xì)胞中ALKBH5基因敲除促進(jìn)滋養(yǎng)層侵襲,而ALKBH5的過表達(dá)則抑制侵襲。進(jìn)一步分析表明,滋養(yǎng)層中ALKBH5表達(dá)降低延長(zhǎng)了半胱氨酸豐富血管生成誘導(dǎo)因子61(cysteine-rich angiogenic inducer 61,CYR61)mRNA的半衰期,增加了CYR61 mRNA的穩(wěn)定性,從而促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲。然而,Zheng等[32]發(fā)現(xiàn), ALKBH5在缺氧處理時(shí)從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì),通過消除SMAD1/5的m6A修飾來增強(qiáng)其表達(dá),反而促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的活性。Qiu等[33]發(fā)現(xiàn)自然流產(chǎn)患者絨毛膜中FTO表達(dá)相對(duì)降低,導(dǎo)致RNA甲基化異常和氧化應(yīng)激,破壞了母胎界面的免疫耐受和血管生成,最終導(dǎo)致流產(chǎn)。Huang等[34]發(fā)現(xiàn) m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3在RSA組中顯著降低;,通過在HTR-8細(xì)胞系中敲低METTL3,發(fā)現(xiàn)了METTL3的一個(gè)靶標(biāo)鋅指和含BTB域4(zinc finger and BTB domain containing 4,ZBTB4),揭示METTL3通過影響RNA m6A甲基化調(diào)控ZBTB4的穩(wěn)定性和表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)RSA患者滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移與侵襲。

3 總結(jié)

在配子發(fā)生、胚胎發(fā)育和母胎界面形成等一系列生殖過程中,關(guān)鍵蛋白DNA或RNA發(fā)生甲基化異常,通過激活或抑制蛋白表達(dá),均可導(dǎo)致流產(chǎn)。DNA甲基化異常在轉(zhuǎn)錄、翻譯等多個(gè)階段或影響蛻膜化進(jìn)程中關(guān)鍵蛋白的表達(dá),或減少滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,或破壞免疫耐受和妊娠維持之間的平衡;母胎界面胎盤絨毛中某些印記基因的DNA甲基化異常在不同方面影響胎兒生長(zhǎng)發(fā)育;精子DNA甲基化異常及其與胎兒非整倍體基因的相互作用等,都可誘導(dǎo)RSA的發(fā)生。此外,臍血中的一些關(guān)鍵DNA或RNA甲基化異常已被證實(shí)與流產(chǎn)有著密切聯(lián)系,有望作為預(yù)測(cè)RSA的生物標(biāo)志物。

然而,相比于DNA甲基化修飾在RSA中的研究,RNA甲基化修飾與RSA病因和發(fā)病機(jī)制關(guān)系的研究尚處于起步階段,有待更多的科研工作者進(jìn)行深入探索,以期為相關(guān)疾病的診治提供新的理論依據(jù)。