楊曉東,羅宇琴,吳文平,潘禮業(yè),劉曉琳,龐 偉,邢菊玲,李國(guó)衛(wèi)

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,佛山 528244

馬鞭草為馬鞭草科植物馬鞭草VerbenaofficinatisL.的干燥地上部分[1],始載于《名醫(yī)別錄》,列為下品。馬鞭草的化學(xué)成分主要為環(huán)烯醚萜苷類(lèi)[2]、黃酮類(lèi)[3]、甾醇類(lèi)、三萜類(lèi)、多酚類(lèi)和揮發(fā)油[4]、鞣質(zhì)、β-胡蘿卜素,咖啡酸,糖類(lèi)等。主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分[5]。其性涼,味苦,歸肝、脾經(jīng)。具有活血散瘀、解毒、利水、退黃、截瘧的功效。臨床用于癥瘕積聚,痛經(jīng)經(jīng)閉,喉痹,癰腫,水腫,黃疸,瘧疾。馬鞭草資源豐富[6],其中環(huán)烯醚萜苷類(lèi)[7]成分具有抗氧化、保肝、保護(hù)神經(jīng)[8]、保護(hù)心臟及腦缺血[9]、抗炎[10]等多種作用。中藥湯劑(標(biāo)準(zhǔn)湯劑)是中醫(yī)臨床最常用的中藥復(fù)方制劑,也是中醫(yī)歷史上應(yīng)用最久和最廣的制劑。無(wú)論是中藥傳統(tǒng)飲片,還是破壁飲片、中藥配方顆粒等中藥新型飲片,均是采用水煎服或者水沖服,因此,將標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究作為其他中藥制劑研究的首選對(duì)照具有十分重要的意義[11]。本研究通過(guò)闡明飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞規(guī)律,為馬鞭草中藥制劑工藝研究和質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

本研究以馬鞭草飲片為研究對(duì)象,建立其UPLC特征圖譜,結(jié)合化學(xué)模式分析圖譜信息并采用超高效液相色譜法聯(lián)合一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定馬鞭草中毛蕊花糖苷、5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷含量的方法,與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。并測(cè)定其標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、毛蕊花糖苷、5-羥基馬鞭草苷及馬鞭草苷含量,計(jì)算轉(zhuǎn)移率,以此為基礎(chǔ)進(jìn)行馬鞭草飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞研究,說(shuō)明各項(xiàng)質(zhì)量指標(biāo)設(shè)定的合理性。

1 材料

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(沃特世公司);Thermo Vanquish型超高效液相色譜儀(賽默飛科技有限公司);ME204E型萬(wàn)分之一天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2 試劑

甲醇(西隴科學(xué)股份有限公司)為分析純;液相用磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);乙腈(默克股份有限公司)為色譜純;水為超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.3 試藥

馬鞭草苷(成都瑞芬思生物科技有限公司,批號(hào):M-042-170613,含量:98.0%);5-羥基馬鞭草苷(維克奇生物科技有限公司,批號(hào):wkq18110104,含量:98.0%);毛蕊花糖苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院,批號(hào):111530-201713,含量:92.5%)。本次實(shí)驗(yàn)共收集18批馬鞭草藥材,產(chǎn)地信息(見(jiàn)表1),經(jīng)廣東一方制藥有限公司孫冬梅教授鑒定,均為馬鞭草科植物馬鞭草VerbenaofficinatisL.的干燥地上部分,并經(jīng)廣東一方制藥有限公司質(zhì)量中心鑒定合格,均符合2020版《中華人民共和國(guó)藥典》(后文簡(jiǎn)稱(chēng)《中國(guó)藥典》)馬鞭草項(xiàng)下的各項(xiàng)規(guī)定,并按2020版《中國(guó)藥典》馬鞭草飲片項(xiàng)下炮制成飲片,具體炮制方法為:取馬鞭草藥材,挑去非藥用部位和雜質(zhì),洗凈,稍潤(rùn),切成5～15 mm的段,60 ℃烘干。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)色譜柱;流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0～2 min,10% A;2～14 min,10%→18% A;14～16 min,18% A;16～25 min,18%→25% A;25～28 min,25%→95% A);流速為0.3 mL/min;柱溫為35 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm;進(jìn)樣量為1 μL。

2.2 對(duì)照品及供試品溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液配制

取馬鞭草苷對(duì)照品、5-羥基馬鞭草苷對(duì)照品、毛蕊花糖苷對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,置量瓶中,加甲醇制成每1 mL含馬鞭草苷30 μg,5-羥基馬鞭草苷76 μg,毛蕊花糖苷22 μg的混合溶液,即得。

2.2.2 飲片供試品溶液制備

取馬鞭草飲片粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1 g,精密稱(chēng)定,置錐形瓶中,精密加入80%甲醇50 mL,稱(chēng)定重量,加熱回流120 min,放冷,再稱(chēng)定重量,用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液制備

取馬鞭草標(biāo)準(zhǔn)湯劑約0.1 g,精密稱(chēng)定,置錐形瓶中,精密加入80%甲醇20 mL,稱(chēng)定重量,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱(chēng)定重量,用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。

2.3 馬鞭草UPLC特征圖譜建立

2.3.1 特征圖譜方法學(xué)考察

2.3.1.1 精密度考察

取馬鞭草飲片粉末(過(guò)三號(hào)篩,編號(hào):S1),按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,以毛蕊花糖苷峰為參照峰,各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于2.0%,表明儀器精密度良好。

2.3.1.2 重復(fù)性考察

取馬鞭草飲片粉末(過(guò)三號(hào)篩,編號(hào):S1),按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以毛蕊花糖苷峰為參照峰,各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于2.5%,表明樣品制備方法重復(fù)性良好。

2.3.1.3 穩(wěn)定性考察

取馬鞭草飲片粉末(過(guò)三號(hào)篩,編號(hào):S1),按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別與0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定。以毛蕊花糖苷峰為參照峰,各特征峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于2.1%,表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.2 特征圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

取18批馬鞭草飲片按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。將色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012年版),設(shè)定S1為參照?qǐng)D譜,自動(dòng)匹配后多點(diǎn)校正,進(jìn)行全譜峰匹配,得到18批樣品疊加圖,共確認(rèn)5個(gè)特征峰(見(jiàn)圖1)。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012年版)計(jì)算18批馬鞭草飲片特征圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度。結(jié)果顯示,18批樣品的相似度均不低于0.83(見(jiàn)表2)。

圖1 18批馬鞭草特征圖譜Fig.1 Characteristic chromatogram of 18 batches of Verbenae Herba

表2 相似度結(jié)果Table 2 Results of the similarity

2.3.3 共有峰指認(rèn)

為考察特征圖譜是否具有代表性及能否表征待測(cè)成分的專(zhuān)屬性,通過(guò)與對(duì)照品對(duì)照,指認(rèn)其中3個(gè)特征峰,峰1為5-羥基馬鞭草苷、峰2為馬鞭草苷、峰3為毛蕊花糖苷(見(jiàn)圖2)。

圖2 特征圖譜共有峰的指認(rèn)Fig.2 Identification of common peaks in characteristic chromatogram注:A:供試品;B:混合對(duì)照品。1:5-羥基馬鞭草苷;2:馬鞭草苷;3:毛蕊花糖苷。Note:A:Sample;B:Mixed reference substance.1:Hastatoside;2:Cornin;3:Verbascoside.

2.3.4 主成分分析

以18批馬鞭草飲片特征圖譜中的5個(gè)共有峰峰面積為數(shù)據(jù),用SPSS 20.0軟件對(duì)其進(jìn)行主成分分析,得出相關(guān)矩陣的特征值及其方差(見(jiàn)表3),碎石圖(見(jiàn)圖3),由表3可知,根據(jù)特征值大于1,得到兩個(gè)主成分,對(duì)總方差的累計(jì)貢獻(xiàn)度達(dá)80.766%,具有很好的代表性,可代表馬鞭草特征圖譜共有峰的大部分信息。成分矩陣(見(jiàn)表4),由表4可知,第1主成分主要反應(yīng)了峰3(毛蕊花糖苷)和峰5的信息,第二主成分反映了峰1(5-羥基馬鞭草苷)、峰2(馬鞭草苷)的信息。

圖3 主成分分析碎石圖Fig.3 Scree plot of principal component analysis

表3 特征值及累積方差貢獻(xiàn)率Table 3 Eigenvalue and cumulative variance contribution rate

表4 主成分分析矩陣Table 4 Matrix of principal component analysis

2.4 一測(cè)多評(píng)法建立

根據(jù)主成分分析結(jié)果,以峰3(毛蕊花糖苷)、峰1(5-羥基馬鞭草苷)、峰2(馬鞭草苷)對(duì)馬鞭草飲片整體質(zhì)量影響較大。三者光譜特性基本一致且響應(yīng)值比例接近,因此,以毛蕊花糖苷為內(nèi)參物,馬鞭草苷和5-羥基馬鞭草苷為待測(cè)成分,建立上述三種成分的一測(cè)多評(píng)定量表征方法。

2.4.1 一測(cè)多評(píng)法方法學(xué)考察

2.4.1.1 精密度考察

取馬鞭草飲片粉末(過(guò)三號(hào)篩,編號(hào):S1),按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次、5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷峰面積RSD分別為0.27%、0.56%、0.70%,表明儀器精密度良好。

2.4.1.2 重復(fù)性考察

取馬鞭草飲片粉末(過(guò)三號(hào)篩,編號(hào):S1),按照“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算馬鞭草中5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷的含量,3種成分含量RSD均小于3%,表明樣品制備方法重復(fù)性良好。

2.4.1.3 穩(wěn)定性考察

取馬鞭草飲片粉末(過(guò)三號(hào)篩,編號(hào):S1),按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定。5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷峰面積RSD均小于1%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.1.4 線性關(guān)系考察

取馬鞭草苷對(duì)照品、5-羥基馬鞭草苷對(duì)照品、毛蕊花糖苷對(duì)照品適量,精密稱(chēng)定,置量瓶中,加甲醇制成5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷濃度分別為757.305、463.932、1038.220 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

精密吸取上述混合儲(chǔ)備液1 mL至2、5、10、20、50、100 mL量瓶,加甲醇定容至刻度,同上述對(duì)照品儲(chǔ)備液分別按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜峰峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(y),對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(x),并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)表5)。結(jié)果表明,3種成分在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表5 回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 5 Linear equation and correlation coefficient

2.4.1.5 加樣回收率考察

取已測(cè)定含量馬鞭草(S1)飲片粉末約0.5 g,精密稱(chēng)定,平行3組,每組3份,分別按1∶0.5、1∶1、1∶1.5加入5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷對(duì)照品;按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算加樣回收率,3種成分平均加樣回收率在94.4%～102.04%范圍內(nèi)。RSD均小于3.0%,均符合2020年版《中國(guó)藥典》四部通則9101的規(guī)定。表明該測(cè)定方法準(zhǔn)確度良好。

2.4.2 一測(cè)多評(píng)法建立

2.4.2.1 相對(duì)校正因子計(jì)算

因毛蕊花糖苷含量相對(duì)較高,且其對(duì)照品較易獲得,本研究以毛蕊花糖苷為內(nèi)參物(s)與其他待測(cè)成分為(i)的相對(duì)校正因子的計(jì)算公示為

(1)

其中,RCF代表相對(duì)校正因子、s代表內(nèi)參物、i代表其他待測(cè)成分、A為峰面積、C為相應(yīng)對(duì)照品濃度。

2.4.2.2 耐用性考察

利用相對(duì)保留時(shí)間法,以毛蕊花糖苷峰為參照峰,計(jì)算5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷的相對(duì)保留時(shí)間ris=tRi/tRs(式中,tRs為參照峰的保留時(shí)間,tRi為待測(cè)成分的保留時(shí)間)。對(duì)各色譜峰進(jìn)行定位。精密吸取“2.4.1.1”項(xiàng)下樣品溶液,分別考察不同柱溫(33、35、37 ℃)、流速(0.28、0.30、0.32 mL/min)、色譜柱(YMC Triart、Waters HSS T3)、色譜儀(Waters H-Class、Thermo Vanquish)對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響(見(jiàn)表6),RSD小于2%。

表6 耐用性考察(相對(duì)保留時(shí)間)Table 6 Durability investigation(relative retention time)

2.4.2.3 相對(duì)校正因子重現(xiàn)性考察

分別對(duì)柱溫(33、35、37 ℃)、流速(0.28、0.30、0.32 mL/min)、色譜柱(YMC Triart、Waters HSS T3)、色譜儀(Waters H-Class、Thermo Vanquish)進(jìn)行耐用性考察,取“2.4.1.1”項(xiàng)下樣品,按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷的相對(duì)校正因子(見(jiàn)表7),RSD小于2%。

表7 不同條件對(duì)相對(duì)校正因子的影響Table 7 Effects of different conditions on relative correction factors (RCF)

2.4.2.4 樣品測(cè)定

取18批馬鞭草飲片樣品,按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,平行兩份,按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積。以毛蕊花糖苷為參照物,按照一測(cè)多評(píng)法計(jì)算5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷的含量。并與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果(毛蕊花糖苷除外)進(jìn)行比較,計(jì)算相對(duì)誤差RE=(WQAMS-WESM)/WESM×100%(式中,除WESM為外標(biāo)法測(cè)得的成分含量,WQAMS為一測(cè)多評(píng)法測(cè)得的成分含量)[12]。結(jié)果顯示,18批樣品兩種方法測(cè)定結(jié)果的RE%均小于3%范圍內(nèi),表明兩者無(wú)明顯差異(見(jiàn)表8),所建立的一測(cè)多評(píng)法可以用于馬鞭草質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。

表8 各成分含量測(cè)定結(jié)果Table 8 Results of content determination of various constituents

2.5 標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞研究

2.5.1 馬鞭草標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備

按《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》制備18批馬鞭草標(biāo)準(zhǔn)湯劑,取馬鞭草飲片各100 g,煎煮2次,一煎加水12倍,浸泡30 min,武火煮沸,文火保持微沸30 min,用350目篩網(wǎng)趁熱過(guò)濾;二煎加水10倍,武火煮沸,文火保持微沸25 min,用350目篩網(wǎng)趁熱過(guò)濾;合并2次煎液,65 ℃真空減壓濃縮至100 mL,冷凍干燥即得。

2.5.2 馬鞭草標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量、出膏率測(cè)定及轉(zhuǎn)移率計(jì)算

馬鞭草標(biāo)準(zhǔn)湯劑批號(hào)對(duì)應(yīng)飲片批號(hào)分別為B1～B18,計(jì)算出膏率(出膏率=凍干粉重量/飲片重量×100%),18批馬鞭草標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率波動(dòng)范圍為10.94%～22.25%,平均出膏率為16.68%;測(cè)定毛蕊花糖苷、5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷含量,并計(jì)算轉(zhuǎn)移率(外標(biāo)法)[13](見(jiàn)表9)。毛蕊花糖苷轉(zhuǎn)移率的波動(dòng)范圍為7.9%～36.3%;5-羥基馬鞭草苷轉(zhuǎn)移率的波動(dòng)范圍為35.0%～113.4%;馬鞭草苷轉(zhuǎn)移率的波動(dòng)范圍為52.1%～109.2%。

表9 馬鞭草標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、含量及轉(zhuǎn)移率Table 9 Dry extract rate,content and transfer rate of Verbenae Herba standard decoction

3 討論與結(jié)論

馬鞭草樣品特征圖譜等度洗脫無(wú)法實(shí)現(xiàn)基線分離,故采用梯度洗脫,在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中,本研究對(duì)比了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液等流動(dòng)相,最終選定乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相,在上述色譜條件下,色譜峰分離度、理論板數(shù)及峰型等參數(shù)均較好。本研究借助單因素實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)考察了提取溶劑、提取方法及時(shí)間、料液比對(duì)提取效率的影響,結(jié)果顯示,當(dāng)提取溶劑為80%甲醇、料液比為1∶50(g/mL)、回流提取120分鐘時(shí),提取效率最高,故以上述方法為馬鞭草飲片的提取方法。

中藥多指標(biāo)成分整體質(zhì)量控制已成為中藥質(zhì)量控制必然發(fā)展趨勢(shì)[14],特征/指紋圖譜是一種有效的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法,將其與一測(cè)多評(píng)分析方法相結(jié)合可實(shí)現(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)的整體性和準(zhǔn)確性。本研究建立了馬鞭草飲片UPLC特征圖譜,確定了5個(gè)特征共有峰并指認(rèn)了其中3個(gè)成分,分析時(shí)間比HPLC有明顯縮短,且色譜條件可用于5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷及毛蕊花糖苷含量測(cè)定。對(duì)特征峰峰面積進(jìn)行主成分分析,該主成分綜合評(píng)價(jià)模型進(jìn)一步完善了馬鞭草質(zhì)量評(píng)價(jià)分析方法。

2020年《中國(guó)藥典》中馬鞭草的含量測(cè)定指標(biāo)為齊墩果酸和熊果酸總量,均為三萜類(lèi)化合物,極性小,水溶性較低,前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,馬鞭草標(biāo)準(zhǔn)湯劑中齊墩果酸和熊果酸的總含量低于2.0 mg/g,轉(zhuǎn)移率低于6%。因此,基于特征圖譜,建立了5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷及毛蕊花糖苷3種成分含量一測(cè)多評(píng)測(cè)定方法。馬鞭草的極性成分以環(huán)烯醚萜類(lèi)物質(zhì)為主,其中馬鞭草苷和5-羥基馬鞭草苷為含量最高的主要成分,標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率較高。部分批次轉(zhuǎn)移率超100%,而5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷總量的總轉(zhuǎn)移范圍在56.6%～91.2%?？赡茉?yàn)橥?lèi)成分在加熱煎煮等過(guò)程中發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。18批馬鞭草標(biāo)準(zhǔn)湯劑中毛蕊花糖苷、5-羥基馬鞭草苷和馬鞭草苷含量和轉(zhuǎn)移率批間存在差異,可能與飲片含量、飲片的質(zhì)地有關(guān),部分飲片顏色較淺,存放時(shí)間較久,炮制時(shí),碎屑較多,可能是導(dǎo)致其含量和轉(zhuǎn)移率波動(dòng)較大的原因。所選的3種成分在馬鞭草中含量較高,在抗氧化、保肝、保護(hù)神經(jīng)、保護(hù)心臟及腦缺血、抗炎等方面具有較好的藥理活性,是馬鞭草發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定結(jié)果與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異,可用于馬鞭草中多種成分定量分析。UPLC特征圖譜結(jié)合多指標(biāo)成分一測(cè)多評(píng)定量分析法可為馬鞭草及馬鞭草中藥制劑工藝研究和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。