徐志偉,畢映燕,馮蕓梅,邊 娜,王寶才,李季文,杜偉鋒

1甘肅省中醫(yī)院,蘭州 730050;2蘭州市城關(guān)區(qū)白銀路街道衛(wèi)生社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心,蘭州 730030;3浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制技術(shù)研究中心,杭州 311401

當(dāng)歸是傘形科植物當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oliv)Diels)的干燥根,是“根分梢理論”的代表藥材,臨床常用以治療血虛萎黃、眩暈心悸、月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉痛經(jīng)、虛寒腹痛、風(fēng)濕痹痛、跌撲損傷、癰疽瘡瘍、腸燥便秘等癥[1]。傳統(tǒng)醫(yī)家認(rèn)為當(dāng)歸不同藥用部位應(yīng)分別入藥,如“當(dāng)歸頭止血上行,當(dāng)歸身補血中守,當(dāng)歸尾破血下流,全當(dāng)歸補血活血”(李杲《脾胃論》)。項目組前期研究,當(dāng)歸不同藥用部位兩兩配伍加熱回流提取(下簡稱“提取”)后,阿魏酸、綠原酸、歐前胡素、藁本內(nèi)酯的百分含量和當(dāng)歸尾藥材干膏率皆呈下降趨勢,表明有必要對當(dāng)歸不同藥用部位開展分別應(yīng)用與研究[2-4]。

文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn),目前當(dāng)歸的有關(guān)研究主要集中于當(dāng)歸整體的研究,尚缺乏對當(dāng)歸某一藥用部位的研究;此外,在臨床應(yīng)用及生產(chǎn)實踐中,也多以當(dāng)歸整體為對象開展相關(guān)工作,少有遵循古法,以當(dāng)歸某一藥用部位為對象的情況;長此以往,既不利于中醫(yī)藥“傳承、創(chuàng)新”的發(fā)展原則,也不利于當(dāng)歸全方位、深層次的研究。故本項目組擬以當(dāng)歸尾為主要研究對象,選取其中阿魏酸等4種主要化學(xué)成分百分含量和當(dāng)歸尾藥材干膏率為考察指標(biāo),選取提取次數(shù)、料液比、提取時間為考察因素,采用BP-ANN聯(lián)合CRITIC法系統(tǒng)研究當(dāng)歸尾的提取工藝[5-7],優(yōu)化相關(guān)工藝參數(shù),以期建立當(dāng)歸尾的最優(yōu)提取工藝,為當(dāng)歸尾后續(xù)深入研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 試驗用品

1.1 當(dāng)歸尾的處理

當(dāng)歸藥材采自甘肅隴西,經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制技術(shù)研究中心杜偉鋒副研究員鑒定為當(dāng)歸正品藥材。按傳統(tǒng)要求,除去當(dāng)歸根上端膨大、鈍圓,殘留葉鞘及莖基的當(dāng)歸頭;以及外形呈圓柱狀的當(dāng)歸身,即得當(dāng)歸尾。

1.2 設(shè)備與試藥

PerkinElmer A-10型HPLC(PerkinElmer公司);普利賽斯LX2200C型百分之一和LX120A型萬分之一電子分析天平(普利賽斯國際貿(mào)易有限公司)。

阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號:110773-201614)、綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號:110753-201817)、歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品(批號:111737-201910)、藁本內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品(批號:111737-201910)皆從中國食品藥品檢定研究院購買,純度皆滿足試驗要求;甲醇、乙腈為色譜純;水為娃哈哈純凈水。剩余試藥皆用分析純。

2 試驗流程及數(shù)據(jù)分析

2.1 化學(xué)成分檢測

2.1.1 配制樣品溶液

用萬分之一電子天平平行稱取當(dāng)歸尾藥材9份,每50 g一份放入燒瓶中,移液管取一定量娃哈哈水,參照表1開展正交試驗。過濾提取液,回收溶劑至干,加色譜純甲醇溶解殘渣,收集至25 mL容量瓶,定容,搖勻,過0.22 μm微孔濾膜即得。

表1 因素與水平Table 1 Factor and level

2.1.2 配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液

萬分之一電子天平分別稱取阿魏酸等四種化合物標(biāo)準(zhǔn)品一定量,放入10 mL容量瓶,色譜純甲醇定容,搖勻,即得上述四種化合物標(biāo)準(zhǔn)品溶液;其質(zhì)量濃度依次為0.73 mg/mL(綠原酸)、0.33 mg/mL(阿魏酸)、0.25 mg/mL(歐前胡素)和2 mg/mL(藁本內(nèi)酯)。

2.1.3 色譜條件

采用Waters Symmetry Shield RP-C18(250 mm×4.6 mm,5.0 μm)柱為色譜柱,DAD為檢測器,乙腈與0.1%磷酸水溶液為流動性,洗脫梯度為:0～10 min,12%→12%乙腈;10～15 min,12%→25%乙腈;15～22 min,25%→28%乙腈;22～25 min,28%→60%乙腈;25～30 min,60%→70%乙腈;30～40 min,70%→12%乙腈;流動相流量為1 mL/min,色譜柱溫度為25 ℃,檢測波長350 nm;每次進(jìn)樣10 μL。標(biāo)準(zhǔn)品、樣品色譜峰見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(A)以及樣品溶液(B)的HPLC圖Fig.1 HPLC of mixed reference solution (A) and samples (B)注:1-綠原酸;2-阿魏酸;3-歐前胡素;4-藁本內(nèi)酯。Note:1-Chlorogenic acid;2-Ferulic acid;3-Imperatorin;4-Butenyl phthalide.

2.1.4 回歸線方程計算

移液管量取一定量“2.1.2”項下制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,成比例稀釋并配制成6種不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品,加一定量色譜純甲醇定容并混勻,按“2.1.3”項下條件進(jìn)樣10 μL。設(shè)橫坐標(biāo)(X)表示質(zhì)量濃度,縱坐標(biāo)(Y)表示峰面積,計算綠原酸、阿魏酸、歐前胡素、藁本內(nèi)酯的線性回歸方程依次是Y=499 557X-1 299.7、Y=1.9×107X-6 009.5、Y=1.9×106X-9 909.2、Y=499 951X-6 029.3,表示上述四種化學(xué)成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度考察

移液管量取一已知含量樣品溶液10 μL,連續(xù)6次按“2.1.3”項下條件進(jìn)樣,統(tǒng)計阿魏酸等四種化學(xué)成分色譜峰面積,并計算其RSD依次是0.98%、0.97%、0.99%、0.95%,表示儀器精密度滿足試驗要求。

2.1.6 重復(fù)性考察

萬分之一電子天平平行稱取當(dāng)歸尾藥材6份,按“2.1.1”項所述方法配制樣品溶液;并按“2.1.3”項下條件檢測阿魏酸等四種化學(xué)成分百分含量,并計算其RSD依次是0.92%、1.25%、0.71%、0.86%,表示此方法滿足試驗重復(fù)性要求。

2.1.7 穩(wěn)定性考察

取一已知含量樣品溶液,按“2.1.3”項下條件,分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,計算阿魏酸等四種化學(xué)成分對應(yīng)的峰面積,并計算其RSD依次是0.93%、0.98%、1.19%、1.24%,表示樣品溶液在24 h內(nèi)滿足試驗穩(wěn)定性要求。

2.1.8 加樣回收率試驗

移液管移取已知含量的樣品溶液6份,每份2.5mL,并分別用移液管加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液一定量。按“2.1.3”項下條件進(jìn)樣測定;計算阿魏酸等四種化學(xué)成分的平均加樣回收率依次是99.92%、101.21%、99.96%、100.19%,RSD依次0.29%、0.17%、0.69%、0.81%。表示該含測方法滿足試驗準(zhǔn)確度要求。

2.1.9 樣品含量測定

按“2.1.3”項下條件,對經(jīng)正交提取的當(dāng)歸尾9組樣品中阿魏酸等四種化學(xué)成分色譜峰面積進(jìn)行測定,并算出各成分相應(yīng)百分含量,依次記為Y1、Y2、Y3、Y4(見表2)。

表2 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results

2.2 當(dāng)歸尾藥材干膏率的測定

移液管量取“2.1.1”項下樣品溶液10 mL,放入干燥至最后兩次質(zhì)量差小于0.3 mg的蒸發(fā)皿中,回收溶劑至干,105 ℃下加熱3 h,干燥器中靜置30 min,稱重、記數(shù),記為YG(見表2)。

2.3 當(dāng)歸尾提取工藝優(yōu)化

參照預(yù)試驗結(jié)果,擬定當(dāng)歸尾提取工藝優(yōu)化正交試驗方案。以提取次數(shù)(A)、料液比(B)、提取時間(C)為考查因素,并各設(shè)3個水平,見表1;以阿魏酸等4種化學(xué)成分百分含量和當(dāng)歸尾藥材干膏率為評價指標(biāo),安排L9(34)正交試驗(見表2);方差分析及相應(yīng)結(jié)果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.4 CRITIC法計算權(quán)重

將表2中的試驗數(shù)據(jù)經(jīng)過線性插值處理,得指標(biāo)成分標(biāo)準(zhǔn)化值=(實測值-最小值)/(最大值-最小值)×100。

運用MATLAB R2012a軟件對當(dāng)歸尾中阿魏酸等4種化學(xué)成分含量及浸出物的正交試驗結(jié)果進(jìn)行編程,并結(jié)合CRITIC法,參照公式(1)、(2)、(3)計算相應(yīng)權(quán)重。

(1)

(2)

(3)

其中Rj代表j個指標(biāo)含有的信息量,rij代表i和j兩指標(biāo)相關(guān)系數(shù);σj表示標(biāo)準(zhǔn)化后列向量的標(biāo)準(zhǔn)差。經(jīng)CRITIC法計算,阿魏酸等四種化學(xué)成分百分含量和當(dāng)歸尾藥材干膏率的客觀權(quán)重分別為0.288 9、0.217 7、0.145 5、0.157 3、0.190 6。綜合評分=(Y1/Y1max)×0.288 9+(Y2/Y2max)×0.217 7+(Y3/Y3max)×0.145 5+(Y4/Y4max)×0.157 3+(YG/YGmax)×0.190 6×100。結(jié)果見表2,即當(dāng)歸尾的提取工藝為加入藥材重量的10倍量體積提取液,提取3次,每次提取90 min。

2.5 BP-ANN

2.5.1 模型構(gòu)建

以BP-ANN 3層結(jié)構(gòu)構(gòu)建相應(yīng)模型,設(shè)輸入節(jié)點數(shù)為上述三種考察因素,輸出節(jié)點數(shù)為綜合評分。

2.5.2 相關(guān)參數(shù)的網(wǎng)絡(luò)模擬訓(xùn)練

借助MATLAB R2012a編程軟件,建立“2.5.1”中模型,經(jīng)訓(xùn)練得到3-10-1網(wǎng)絡(luò)模型,可擬合各因素水平與綜合評分間映射關(guān)系。賦值提取次數(shù)、料液比、提取時間,借助上述模型進(jìn)行訓(xùn)練,得相應(yīng)均方差曲線見圖2,開展提取工藝相關(guān)參數(shù)優(yōu)化,比較模擬值與測定值。數(shù)據(jù)證明,上述兩值相關(guān)系數(shù)r=0.998 64,即該模型滿足試驗要求。

圖2 訓(xùn)練及結(jié)果Fig.2 Training and results

2.5.3 模擬結(jié)果

隨機選取并固定提取次數(shù)、料液比、提取時間中某兩因素水平值,其余因素水平值按一定比例增減,運用α=sim (net,β)(α為模擬值,β為上述因素各水平值組合)進(jìn)行模擬測試,以找出當(dāng)歸尾提取工藝相關(guān)參數(shù)的最優(yōu)值。通過上述方法建立的當(dāng)歸尾最優(yōu)提取工藝為:加入當(dāng)歸尾質(zhì)量9.6倍體積娃哈哈純凈水,進(jìn)行3次加熱回流提取,提取時間為67 min/次;上述提取工藝下所得最大綜合評分是98.36。

2.6 驗證試驗

萬分之一電子天平稱取當(dāng)歸尾藥材,平行6份,各50 g,參照BP-ANN模型和正交試驗所得最優(yōu)工藝參數(shù)開展試驗驗證,測定當(dāng)歸尾中阿魏酸等4種化學(xué)成分百分含量和當(dāng)歸尾藥材干膏率,并計算各自綜合評分,見表4;結(jié)果顯示,參照BP-ANN模型優(yōu)化工藝開展的3批驗證試驗,其綜合評分結(jié)果均高于以正交試驗結(jié)果為參照開展的3批驗證試驗所得綜合評分結(jié)果,且前者綜合評分均值98.77也高于后者的98.17,表明采用BP-ANN模型優(yōu)化的當(dāng)歸尾提取工藝參數(shù)好于正交試驗。即提取工藝最優(yōu)參數(shù)是加入當(dāng)歸尾質(zhì)量9.6倍體積娃哈哈純凈水,進(jìn)行3次加熱回流提取,提取時間為67 min/次。

表4 驗證結(jié)果與比較Table 4 Verification results and comparison

3 討論與結(jié)論

3.1 考察指標(biāo)的選擇

文獻(xiàn)研究表明,文中所涉阿魏酸、綠原酸及藁本內(nèi)酯是目前當(dāng)歸研究中出現(xiàn)頻次較多的化學(xué)成分;阿魏酸是《藥典》規(guī)定的當(dāng)歸指標(biāo)性成分,同時具有抗血小板聚集、抑制血小板5-羥色胺釋放等作用;綠原酸是當(dāng)歸中重要的酚酸類成分,臨床研究表明其不僅可以興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng),同時還能抗病毒、抗菌;藁本內(nèi)酯作為當(dāng)歸重要的揮發(fā)油類活性成分之一,能夠解痙、鎮(zhèn)靜、治哮喘;歐前胡素是當(dāng)歸中重要的香豆素類成分,且因產(chǎn)區(qū)不同存在較大差異,但少有以其作為當(dāng)歸指標(biāo)成分的相關(guān)研究[8,9]。

綜上,并結(jié)合前期研究,本文以上述4種化學(xué)成分百分含量和當(dāng)歸尾藥材干膏率為考察指標(biāo),可使本研究結(jié)果更科學(xué)、更精準(zhǔn),同時滿足中醫(yī)臨床用藥通道、靶點繁多,病程層次復(fù)雜等特點。

3.2 權(quán)重系數(shù)計算方法的選擇

眾所周知,中藥藥效成分復(fù)雜且藥理作用廣泛,對其進(jìn)行多指標(biāo)成分研究時常需明確各指標(biāo)成分權(quán)重系數(shù)。CRITIC法是利用評價指標(biāo)本身標(biāo)準(zhǔn)偏差和相關(guān)系數(shù),以綜合衡量相關(guān)權(quán)重的客觀賦權(quán)方法,其所得權(quán)重系數(shù)受研究者知識、閱歷等諸多因素影響較少,其所得相關(guān)權(quán)重相較于主觀賦權(quán)、AHP賦權(quán)等賦權(quán)方法更具科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性。

3.3 BP-ANN

BP-ANN是一種可模擬人腦組織結(jié)構(gòu)和其運轉(zhuǎn)機制的智能系統(tǒng),其不僅具有自組織、自適應(yīng)、自學(xué)習(xí)能力,同時還有良好的函數(shù)逼近能力。BP-ANN可較好地進(jìn)行擬合與預(yù)測,以便找出限定范圍內(nèi)的最優(yōu)值,較之正交試驗、響應(yīng)面等試驗設(shè)計方法,其可經(jīng)自主學(xué)習(xí)找出限定范圍內(nèi)的最優(yōu)提取工藝參數(shù),在減少試驗次數(shù)的同時使所得條件更精準(zhǔn);同時符合中藥提取的復(fù)雜性與多元化性[10-13]。

綜上,本試驗運用BP-ANN結(jié)合CRITIC法優(yōu)化當(dāng)歸尾提取工藝參數(shù),其結(jié)果更具科學(xué)性、嚴(yán)謹(jǐn)性、準(zhǔn)確性;可為當(dāng)歸尾后續(xù)的系統(tǒng)化、體系化研究提供數(shù)據(jù)支撐,為當(dāng)歸的進(jìn)一步深化研究提供新的思路。