陳金鵬, 謝 佳, 趙 柯, 胡 展, 張 羲, 南曉慧, 孫然鋒

(海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228)

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda屬于鱗翅目夜蛾科灰翅夜蛾屬，原產(chǎn)于南美洲與北美洲的南部與中部，于2019 年1 月首次從云南省侵入我國(guó)，其寄主范圍廣泛，同時(shí)還具有強(qiáng)大的遷飛能力和繁殖能力，可致使農(nóng)作物大幅度減產(chǎn)并造成難以估量的經(jīng)濟(jì)損失[1]。傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥在對(duì)草地貪夜蛾的防治中仍占據(jù)重要地位，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的用于草地貪夜蛾應(yīng)急防治的化學(xué)農(nóng)藥單劑共有11 種，分別為：甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽、茚蟲(chóng)威、四氯蟲(chóng)酰胺、氯蟲(chóng)苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯、乙酰甲胺磷、虱螨脲和蟲(chóng)螨腈 (http://www.gov.cn/xinwen/2019-06/10/content_5398774.htm)，其中，虱螨脲屬于苯甲酰脲類(lèi)殺蟲(chóng)劑，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖式1。作為幾丁質(zhì)合成抑制劑，苯甲酰脲類(lèi)殺蟲(chóng)劑因具有獨(dú)特的作用機(jī)制、較高的環(huán)境安全性及對(duì)鱗翅目高效的殺蟲(chóng)活性等特點(diǎn)得到了廣泛關(guān)注和應(yīng)用及對(duì)此類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)改造一直是農(nóng)藥學(xué)研究的熱點(diǎn)[2]。

目前對(duì)苯甲酰脲類(lèi)化合物的改造主要圍繞苯甲?；糠?(A 環(huán))、脲橋 (C) 和苯基部分 (B 環(huán))3 部分進(jìn)行[3](圖式1)，通過(guò)改造各部分的取代基，使其電子效應(yīng)、空間位阻發(fā)生改變，從而影響殺蟲(chóng)活性[4-6]。多數(shù)研究表明，在A 環(huán)部分，2,6-二氟取代優(yōu)于2,6-二氯取代，如2,6-二氟苯甲酰脲的殺蟲(chóng)活性是2,6-二氯苯甲酰脲的20 倍；而苯甲酰環(huán)被芳香雜環(huán)或環(huán)烷基取代，其殺蟲(chóng)活性會(huì)降低[7-9]；在B 環(huán)部分，2,6 位上有大分子基團(tuán)不利于殺蟲(chóng)活性，4 位上有吸電子基團(tuán)則有利于殺蟲(chóng)活性[3]。

圖式1 苯甲酰脲類(lèi)化合物和虱螨脲的結(jié)構(gòu)Scheme 1 Structures of benzoylurea compounds and lufenuron

Wang 等報(bào)道了肟醚類(lèi)苯甲酰脲類(lèi)化合物NK-17 (圖式2) 對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)具有優(yōu)異的殺蟲(chóng)活性[10]。為了提高其脂溶性以便于其更好地開(kāi)發(fā)利用，本研究設(shè)計(jì)合成了化合物(E)-N-((4-((叔丁氧亞氨基)甲基)苯基)甲氨基甲?；?-2,6-二氟苯甲酰胺(HN-21)，并評(píng)價(jià)了其對(duì)草地貪葉蛾幼蟲(chóng)的生物活性。目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)見(jiàn)圖式2，合成路線(xiàn)見(jiàn)圖式3。

圖式2 化合物HN-21 的設(shè)計(jì)Scheme 2 Design of compound HN-21

另外，苯甲酰脲類(lèi)化合物通過(guò)抑制昆蟲(chóng)體內(nèi)幾丁質(zhì)的合成和沉積影響昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程已十分確定，處理受試?yán)ハx(chóng)后使其體內(nèi)幾丁質(zhì)含量降低，在蛻皮過(guò)程中死亡[3,11-13]。對(duì)其候選分子靶標(biāo)之一幾丁質(zhì)合成酶1 (chitin synthase 1，CHS1)的影響的研究顯示，除蟲(chóng)脲對(duì)廄螫蠅Stomoxys calcitrans蛹的CHS 活力幾乎沒(méi)有影響[14]；而用0.5 mg/L 除蟲(chóng)脲處理四斑按蚊Anopheles quadrimaculatus24 h 后CHS1的表達(dá)量顯著升高[15]；用除蟲(chóng)脲、氟鈴脲和氟苯脲處理鮭魚(yú)虱Lepeophtheirussalmonis若蟲(chóng)后CHS1表達(dá)量卻在中期微弱下調(diào)[16]。表明不同化合物對(duì)不同生物幾丁質(zhì)合成的影響存在差異，而不同活性的化合物對(duì)昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成通路的影響差異卻鮮有系統(tǒng)研究。因此，本研究以新型苯甲酰脲類(lèi)化合物HN-21 為例，探究其對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性，并從海藻糖含量、幾丁質(zhì)含量和基因表達(dá)量等多個(gè)層面與推薦用藥虱螨脲對(duì)幾丁質(zhì)合成過(guò)程的影響進(jìn)行比較，旨在闡明殺蟲(chóng)機(jī)理與殺蟲(chóng)活性之間的關(guān)聯(lián)，為苯甲酰脲類(lèi)化合物更好地開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

圖式3 化合物HN-21 合成路線(xiàn)Scheme 3 Synthetic route of compound HN-21

1 材料與方法

1.1 昆蟲(chóng)飼養(yǎng)

供試草地貪夜蛾源自于海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，飼養(yǎng)于海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物測(cè)定中心。飼養(yǎng)環(huán)境條件為溫度 (27 ± 1) ℃，相對(duì)濕度 (70 ± 5)%，光照周期為16L : 8D。幼蟲(chóng)飼喂改良的人工飼料[17]，成蟲(chóng)以10%蜂蜜水喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自西隴化工有限公司；生物試劑，均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；虱螨脲 (lufenuron，有效成分含量5%，劑型：乳油)，購(gòu)自欣豐農(nóng)業(yè)科技有限公司。

主要儀器：ABI Q5 型熒光定量PCR 儀 (美國(guó)賽默飛世爾科技公司)；Infinite M200 PRO 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 (瑞士TECAN 公司)；HC110-Pro 型金屬浴 (北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司)；X-4 型數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)儀 (北京泰克儀器有限公司)；Bruker Avance 400 型核磁共振分析儀 (瑞士Bruker 公司)；質(zhì)譜分析儀Agilent 6210 ESI/TOF MS (美國(guó)安捷倫科技公司)。

1.3 HN-21 的合成及溶解能力測(cè)定

1.3.1 4-硝基苯甲醛肟 (a) 的合成 參考文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行。在250 mL 三口燒瓶中加入80 mmol對(duì)硝基苯甲醛，加入80 mL 無(wú)水四氫呋喃使其溶解，再加入96 mmol 鹽酸羥胺，用恒壓滴液漏斗緩慢加入88 mmol 吡啶。滴加完畢，室溫?cái)嚢? h，薄層色譜 (TLC，V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 5 : 1)監(jiān)測(cè)至原料反應(yīng)完全。加水停止反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取。有機(jī)相依次用2%稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓旋除溶劑后得黃色固體。用V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = (10～20) : 1 混合溶劑重結(jié)晶得淡黃色針狀晶體a，收率為90.5%。

1.3.2 (E)-O-叔丁基-4-硝基苯甲醛肟 (b) 的合成參考文獻(xiàn)[18]的方法，在250 mL 三口瓶中加入19.2 mmol 化合物a，用10 mL 無(wú)水四氫呋喃溶解后加入50 mL 氯仿，升溫至50～60 ℃，通入新制得的異丁烯氣體，緩慢滴加1.8 mL 濃硫酸。滴加完畢，保持該溫度反應(yīng)，TLC (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 10 : 1) 監(jiān)測(cè)至原料反應(yīng)完全。停止反應(yīng)，冷卻至室溫，用水洗滌2 次，有機(jī)相用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌至中性，無(wú)水硫酸鈉干燥。經(jīng)柱層析 (石油醚) 分離出黃色固體b，產(chǎn)率為85.4%。

1.3.3 (E)-O-叔丁基-4-氨基苯甲醛肟 (c) 的合成

參考文獻(xiàn)[19] 的方法，在100 mL 三口瓶中，加入6.8 mmol 化合物b、30 mL 乙醇和5 mL 水，加熱使其溶解，在60～70 ℃下加入1 mL 濃鹽酸，并分4 批加入23.8 mmol 還原鐵粉，每隔20 min 補(bǔ)加50 μL 濃鹽酸，使溶液保持酸性，TLC (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 3 : 1) 檢測(cè)至原料反應(yīng)完全。停止加熱，趁熱過(guò)濾，用乙醇洗滌固體，濾液用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至9～10，有深藍(lán)色沉淀析出；再次過(guò)濾，濾液加水后用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥。經(jīng)柱層析(V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 3 : 1) 分離，得紅色液體c，產(chǎn)率為78.9%。

1.3.4 (E)-N-甲基-O-叔丁基-4-氨基苯甲醛肟 (d)的合成 在250 mL 三口瓶中，加入10.6 mmol 化合物c 和70 mL 無(wú)水甲醇，再加入53 mmol 甲醇鈉，室溫?cái)嚢柘录尤?3 mmol 多聚甲醛，加熱回流2 h。冷卻至室溫，加入53 mmol 硼氫化鈉，加熱回流2 h，停止反應(yīng)。冷卻，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分甲醇，加入飽和碳酸氫鈉溶液，用乙醚萃取3 次，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，過(guò)濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，經(jīng)柱層析 (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 4 : 1) 分離得到化合物d，收率為72.8%。

1.3.5 目標(biāo)化合物HN-21 的合成 在50 mL 三口瓶中，加入5.4 mmol 化合物d 和10 mL 二氯甲烷，室溫下用恒壓滴液漏斗緩慢加入含有5.6 mmol 2,6-二氟苯甲?；惽杷狨サ亩燃淄槿芤?。滴加完畢，室溫?cái)嚢? h 至反應(yīng)完全。先經(jīng)柱層析(V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 3 : 1) 分離，再用V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = (10～20) :1 混合溶劑重結(jié)晶得到化合物HN-21，收率為73.1%。隨后測(cè)定化合物HN-21 溶解能力，并與NK-17 的溶解能力作比較。

1.4 生物活性測(cè)定

采用葉片藥膜法[20]測(cè)定化合物HN-21 對(duì)于草地貪夜蛾2 齡1 d 幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性。準(zhǔn)確稱(chēng)量5 mg HN-21，用1 mLN,N-二甲基甲酰胺 (DMF) 溶解，得到5000 mg/L 的HN-21 母液，備用。

用體積分?jǐn)?shù)為0.2‰ 的DMF 水溶液將HN-21母液稀釋至1.5、1.0、0.50、0.25、0.10 mg/L，將合適大小的玉米葉片在藥劑中浸泡20 s，取出晾干，置于培養(yǎng)皿中，并接入饑餓處理后的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)1 頭，每處理組20 頭幼蟲(chóng)，每處理重復(fù)3 次。以無(wú)菌水為空白對(duì)照組，以0.2‰ DMF 水溶液為陰性對(duì)照組，以10.052 mg/L (經(jīng)測(cè)定所得虱螨脲的致死中濃度 (LC50值) ) 的虱螨脲溶液為陽(yáng)性對(duì)照組。每隔12 h 觀察一次結(jié)果，用毛筆輕觸試蟲(chóng)，試蟲(chóng)無(wú)反應(yīng)視為死亡。所測(cè)數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 26 求得毒力回歸方程，并計(jì)算LC50值。

1.5 草地貪夜蛾幼蟲(chóng)總RNA 的提取及cDNA 的合成

以無(wú)菌水為空白對(duì)照，以體積分?jǐn)?shù)為0.2‰ 的DMF 水溶液為陰性對(duì)照，分別以虱螨脲0.681 mg/L(化合物HN-21 LC50同等濃度)、虱螨脲10.052 mg/L作為陽(yáng)性對(duì)照-1 組和陽(yáng)性對(duì)照-2 組，以HN-21 0.681 mg/L (HN-21 LC50)為待測(cè)藥劑對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)進(jìn)行處理。

分別取不同處理0、24、48 和72 h 后的草地貪夜蛾幼蟲(chóng) (有表型且為存活狀態(tài))，使用Trizol試劑盒進(jìn)行RNA 的提取，以3 只為一組，每處理重復(fù)3 次。提取后用1% 的瓊脂糖檢測(cè)RNA 質(zhì)量，使用微量核酸測(cè)定儀 NanoPhotometer?測(cè)定提取 RNA 的濃度及純度。使用試劑HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR( + gDNA wiper)進(jìn)行 cDNA 第一鏈的合成。試驗(yàn)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 幾丁質(zhì)合成通路相關(guān)基因表達(dá)量的測(cè)定

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR) 分析了不同處理組試蟲(chóng)體內(nèi)與幾丁質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)水平[19]，包括：海藻糖酶1 (TRE1)、海藻糖酶2(TRE2)、己糖激酶 (hexokinase，HK)、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶 (glucose-6-phosphate isomerase，G6PI)、6-磷酸果糖轉(zhuǎn)氨酶 (fructose-6-phosphate transaminase，GFAT)、氨基葡萄糖-磷酸N-乙酰轉(zhuǎn)移酶 (glucosaminephosphate N-acetyltransferase，GNPNA)、磷酸乙酰氨基葡萄糖變位酶 (phosphoacetylglucosamine mutase，PAGM)、二磷酸尿核苷-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶 (UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase，UAP)、幾丁質(zhì)合成酶1 (CHS1)、幾丁質(zhì)合成酶2 (CHS2)等[21]。以核糖體蛋白基因L7(ribosomal protein L7,RPL7) 為內(nèi)參基因[22]，PCR引物見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)基因引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR detection

準(zhǔn)備qRT-PCR 反應(yīng)體系 (10 μL)：Primer F(10 μmol/L) 0.25 μL、Primer R (10 μmol/L) 0.25 μL、模板cDNA 樣品1 μL、ddH2O 3.5 μL、熒光定量試劑Hieff?qPCR SYBR?Green Master Mix(Low Rox Plus) 5 μL。

設(shè)置PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸32 s，40 個(gè)循環(huán)。qRT-PCR 數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。計(jì)算公式：2-ΔΔCT= 2-[(CT待測(cè)組-CT 待測(cè)RPL7)-(CT 對(duì)照組-CT 對(duì)照 RPL7)][23]。

1.7 海藻糖含量的測(cè)定

以無(wú)菌水為空白對(duì)照，以0.2‰ DMF 水溶液為陰性對(duì)照，分別以虱螨脲0.681 mg/L 和10.052 mg/L 作為陽(yáng)性對(duì)照-1 組和陽(yáng)性對(duì)照-2 組，以HN-21 0.681 mg/L 為處理組，對(duì)2 齡草地貪夜蛾幼蟲(chóng)進(jìn)行處理。

將不同處理后的5 只草地貪夜蛾幼蟲(chóng)放入1.5 mL 離心管中，加入200 μL 生理鹽水，用研磨杵充分研磨后再加入800 μL 生理鹽水。在4 ℃、5000 r/min 下離心15 min，取上清液用于海藻糖含量的測(cè)定，沉淀留待備用。試驗(yàn)進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。采用蒽酮法測(cè)定海藻糖含量[24-25]。

1.8 幾丁質(zhì)含量的測(cè)定

取1.7 節(jié)中離心后的沉淀，測(cè)定幾丁質(zhì)含量[15]。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%十二烷基硫酸鈉溶液重新懸浮沉淀后用蒸餾水清洗；根據(jù)樣品質(zhì)量加入適量飽和氫氧化鉀溶液，于130 ℃鼓風(fēng)干燥箱中懸浮沉淀；于冰上冷卻，加入75% (體積分?jǐn)?shù)) 冰乙醇；加入Celite 混懸液后用40% 冰乙醇和蒸餾水清洗沉淀；加入0.5 mL 蒸餾水懸浮沉淀，并吸取混合液至新的EP 管中；加入50 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaNO2和10%的KHSO4，在4 ℃、4500 r/min 下離心15 min；吸取60 μL 上清液至離心管中，加入新鮮的3-甲基苯并噻唑酮腙鹽酸鹽溶液，100 ℃金屬浴5 min，室溫冷卻；加入20 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.83%的FeCl3溶液，靜置，檢測(cè)650 nm的OD 值。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所得數(shù)據(jù)采用 IBM SPSS Statistics 26 軟件中單因素方差分析turkey HSD 分析差異顯著性 (P≤0.05)，數(shù)值用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，并使用GraphPad Prism 7 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物HN-21 的結(jié)構(gòu)鑒定及溶解能力

白色固體，產(chǎn)率73%，m.p.131～132 ℃。1H NMR(400 MHz, Chloroform-d)δ8.06 (s, 1H), 7.71 (d,J=8.5 Hz, 3H) 7.38 (tt,J= 8.4, 6.4 Hz, 1H),7.29 (d,J=8.5 Hz, 2H), 6.94 (dd,J= 8.5, 7.7 Hz, 2H),3.26 (s,3H), 1.38 (s, 9H).13C NMR(101 MHz, Chloroform-d)δ161.68, 160.59, 160.52, 158.08, 158.02, 150.61,145.57, 141.65, 133.77, 133.75, 131.91, 131.81,131.71, 128.73, 127.32, 114.36, 114.16, 113.97,111.69, 111.67, 111.50, 111.47, 111.45, 79.74, 77.38,77.06, 76.74, 37.56, 27.59; ESI-HRMS:m/z[M +H]+: C20H22F2N3O3, 計(jì)算值：390.1551, 測(cè)量值：390.1657 (圖S1，圖S2，圖S3)。溶解能力檢測(cè)結(jié)果顯示，化合物NK-17 在0.1% DMF 水溶液中的溶解能力為 76.67 mg/L，而結(jié)構(gòu)改造后的化合物HN-21 則為148.33 mg/L，為NK-17 的1.93 倍(圖S4)。

2.2 藥劑處理后試蟲(chóng)死亡率及癥狀

生物測(cè)定結(jié)果顯示，虱螨脲與HN-21 均呈現(xiàn)出明顯殺蟲(chóng)效果，中毒試蟲(chóng)表現(xiàn)為頭胸蛻裂線(xiàn)開(kāi)裂，但舊表皮無(wú)法成功蛻去，導(dǎo)致蛻皮過(guò)程受阻而死亡 (圖1，表2)。其中，虱螨脲對(duì)草地貪夜蛾2 齡幼蟲(chóng)72 h 的LC50值為10.052 mg/L，而HN-21 的LC50值為0.681 mg/L，約為虱螨脲LC50值的1/15，表明化合物HN-21 對(duì)草地貪夜蛾具有更高的致死毒性 (圖2)。

圖1 各處理組草地貪夜蛾幼蟲(chóng)表型 (Bar = 0.5 cm)Fig.1 Phenotypes of S.frugiperda larvae in each treatment group

圖2 各處理組草地貪夜蛾幼蟲(chóng)死亡率Fig.2 Mortality of S.frugiperda larvae in each treatment group

表2 供試藥劑對(duì)草地貪夜蛾的殺蟲(chóng)活性 (72 h)Table 2 Toxicities of lufenuron and HN-21 against S.frugiperda (72 h)

2.3 藥劑處理后海藻糖含量變化

在2 齡草地貪夜蛾1～3 d 的發(fā)育期內(nèi)，CK 組體內(nèi)的海藻糖含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。虱螨脲0.681 mg/L 組、10.052 mg/L 組和HN-21 0.681 mg/L 組試蟲(chóng)體內(nèi)海藻糖含量與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異 (圖3)。

圖3 各處理組草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)海藻糖含量Fig.3 Trehalose content in S.frugiperda larvae in each treatment group

2.4 藥劑處理后幾丁質(zhì)含量的變化

經(jīng)處理24～72 h 期間，CK 組的試蟲(chóng)體內(nèi)幾丁質(zhì)含量逐漸上升，虱螨脲0.681 mg/L 組試蟲(chóng)幾丁質(zhì)含量與CK 組相比無(wú)顯著差異，而虱螨脲10.052 mg/L組和HN-21 0.681 mg/L 組試蟲(chóng)體內(nèi)幾丁質(zhì)含量分別下降至CK 的49.6%和76.3%；處理48～72 h 后，虱螨脲10.052 mg/L 組和HN-21 0.681 mg/L組之間已無(wú)顯著差異，幾丁質(zhì)含量在48 h 時(shí)分別下降至CK 的12.3%和18.6%，而72 h 時(shí)下降至10.5%和8.7% (圖4)。

圖4 各處理組草地貪夜蛾幼蟲(chóng)體內(nèi)幾丁質(zhì)含量Fig.4 Chitin content of S.frugiperda larvae in each treatment group

2.5 藥劑處理對(duì)幾丁質(zhì)合成通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響

與CK 組與0.2‰ DMF 組相比，虱螨脲0.681 mg/L組試蟲(chóng)體內(nèi)幾丁質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)量在所測(cè)時(shí)間點(diǎn)均無(wú)顯著差異；處理24 h 后，虱螨脲10.052 mg/L 組試蟲(chóng)sfTRE1、sfHK、sfG6PI、sfGFAT、sfGNPNA、sfCHS1和sfCHS2的表達(dá)量顯著下降。而HN-21 0.681 mg/L 組則在48 h 時(shí)出現(xiàn)了多個(gè)基因的表達(dá)量下調(diào)，大多數(shù)基因下調(diào)倍數(shù)與虱螨脲10.052 mg/L 組無(wú)顯著性差異；另外，在24～72 h 內(nèi)，與CK 組及0.2‰ DMF 組相比，虱螨脲10.052 mg/L 組試蟲(chóng)體內(nèi)sfPAGM的表達(dá)量無(wú)顯著差異，sfUAP的表達(dá)量顯著下降；而HN-21 0.681 mg/L 組試蟲(chóng)體內(nèi)sfPAGM表達(dá)量顯著上升，sfUAP表達(dá)量無(wú)顯著差異 (圖5)。

圖5 各處理組草地貪夜蛾幼蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.5 Gene expression of chitin synthesis-related genes in S.frugiperda larvae in each treatment group

3 討論

3.1 HN-21 對(duì)草地貪夜蛾2 齡幼蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性

隨著人們對(duì)環(huán)境安全性的重視，低毒高效的苯甲酰脲類(lèi)殺蟲(chóng)劑脫穎而出，在近40 年來(lái)得到了較好的應(yīng)用。目前為止，已得到專(zhuān)利報(bào)道的此類(lèi)化合物有上千種，且有20 多個(gè)商品化學(xué)品種廣泛應(yīng)用于田間防治，如除蟲(chóng)脲、啶蟲(chóng)隆、氟鈴脲及虱螨脲等[26-28]，可用于防治鱗翅目、雙翅目、鞘翅目類(lèi)等多種農(nóng)林業(yè)害蟲(chóng)[3,29-30]。研究表明，作為苯甲酰脲類(lèi)第一大產(chǎn)品，虱螨脲在對(duì)甜菜夜蛾Spodoptera exigua、小菜蛾P(guān)lutella xylostella、草地貪夜蛾、蘋(píng)淺褐卷蛾Epiphyas postvittana和梨小食心蟲(chóng)Grapholita molesta等鱗翅目害蟲(chóng)的殺蟲(chóng)活性尤為優(yōu)越，在玉米、棉花、蔬菜、果樹(shù)等作物上得到了較好的應(yīng)用[2,31-34]。采用葉片藥膜法測(cè)定虱螨脲對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的室內(nèi)毒力，不同處理組的結(jié)果有一定的差異，如蘇豪、呂勝蘭等報(bào)道，其對(duì)草地貪夜蛾2 或3 齡幼蟲(chóng)24 h 的LC50值分別為4.66 mg/L 和0.062 mg/L[21,35]，本研究結(jié)果顯示，虱螨脲對(duì)草地貪夜蛾2 齡幼蟲(chóng)的72 h LC50值為10.052 mg/L，介于前兩者與Chen 等測(cè)得的20.706 mg/L 之間[36]，這可能與各地的草地貪夜蛾種群敏感性差異有關(guān)。在本研究中，通過(guò)以2,6-二氟取代模式以及經(jīng)過(guò)生物電子等排和亞結(jié)構(gòu)連接法[3]設(shè)計(jì)的含有肟醚結(jié)構(gòu)的苯甲酰脲類(lèi)化合物HN-21，不僅溶解能力相比較NK-17 有了顯著的提升，其對(duì)草地貪夜蛾的LC50值也僅為0.681 mg/L，殺蟲(chóng)活性顯著優(yōu)于商品推薦用藥虱螨脲?；衔颒N-21含有的肟醚結(jié)構(gòu)為親脂基團(tuán)，在其與作用靶標(biāo)結(jié)合時(shí)可能具有雙作用位點(diǎn)，從而使毒力增加[3]。受試?yán)ハx(chóng)表現(xiàn)出明顯的昆蟲(chóng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中毒癥狀，無(wú)法正常完成蛻皮過(guò)程，最終死亡。

3.2 藥劑處理對(duì)海藻糖及幾丁質(zhì)含量的影響

幾丁質(zhì)合成通路始于海藻糖酶 (TRE)，終于幾丁質(zhì)合成酶 (CHS)。海藻糖代謝與幾丁質(zhì)代謝息息相關(guān)，直接影響著昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。多種化學(xué)藥劑會(huì)引起海藻糖含量與幾丁質(zhì)含量失調(diào)，進(jìn)而產(chǎn)生高比例的昆蟲(chóng)個(gè)體死亡。如黃地老虎Agrotis segetum在經(jīng)氯蟲(chóng)苯甲酰胺處理后，海藻糖含量減少[37]，受井岡霉素處理后，斜紋夜蛾Spodoptera litura體內(nèi)海藻糖含量顯著上升，幾丁質(zhì)含量下降[19]，均使昆蟲(chóng)無(wú)法完成正常的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程。

作為幾丁質(zhì)合成抑制劑，苯甲酰脲類(lèi)化合物處理后，受試?yán)ハx(chóng)體內(nèi)的幾丁質(zhì)含量通常會(huì)減少，進(jìn)而抑制昆蟲(chóng)正常的表皮形成和生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致試蟲(chóng)蛻皮困難而死亡：氟苯脲的攝入可顯著降低馬鈴薯甲蟲(chóng)Leptinotarsa decemlineata整體 (無(wú)中腸) 和表皮中的幾丁質(zhì)含量，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)效應(yīng)[38]；綠盲蝽Apolygus lucorum經(jīng)氟鈴脲處理12～72 h 后，幾丁質(zhì)含量下降，海藻糖含量增加[39]，此現(xiàn)象在氟鈴脲處理斜紋夜蛾幼蟲(chóng)96 h 也有發(fā)現(xiàn)[40]。在本研究中，在經(jīng)HN-21 和高劑量虱螨脲處理后，幼蟲(chóng)體內(nèi)幾丁質(zhì)含量從24 h 開(kāi)始出現(xiàn)下降，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，HN-21 對(duì)幾丁質(zhì)含量降低的影響更加顯著，到72 h 時(shí)其對(duì)受試?yán)ハx(chóng)幾丁質(zhì)含量的影響程度甚至大于高劑量的虱螨脲。這可能與不同藥劑在葉片的滲透或蟲(chóng)體的傳遞速率有關(guān)。藥劑對(duì)幾丁質(zhì)含量的影響程度和受試?yán)ハx(chóng)的表型表現(xiàn)出一致：HN-21 和高劑量的虱螨脲均會(huì)導(dǎo)致受試?yán)ハx(chóng)在蛻皮時(shí)死亡，但表型出現(xiàn)時(shí)間有一定差異。高劑量虱螨脲處理的受試?yán)ハx(chóng)在24 h 時(shí)生長(zhǎng)發(fā)育便受到抑制，HN-21 則在48 h 時(shí)使多數(shù)受試?yán)ハx(chóng)生長(zhǎng)明顯受到阻滯，到72 h 時(shí)兩者已無(wú)明顯差異。另外，在本研究中，HN-21 和高劑量虱螨脲處理后，受試?yán)ハx(chóng)體內(nèi)的海藻糖含量未出現(xiàn)變化，可能與不同昆蟲(chóng)不同的響應(yīng)機(jī)制有關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和分析。

3.3 藥劑處理對(duì)幾丁質(zhì)合成通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響

昆蟲(chóng)體內(nèi)幾丁質(zhì)合成由8 個(gè)基因參與調(diào)控，始于海藻糖酶TRE，經(jīng)過(guò)糖酵解途徑的2 種酶、己糖胺通路的4 種酶，最后終止于幾丁質(zhì)合成酶CHS。其中某一過(guò)程代謝異常即會(huì)影響昆蟲(chóng)正常的生長(zhǎng)發(fā)育。研究表明，TRE基因表達(dá)量下降會(huì)使豌豆蚜Acyrthosiphon pisum畸形[41]；在棉蚜Aphis gossypiiGlover、赤擬谷盜Tribolium castaneum等多種昆蟲(chóng)中，RNA 干擾介導(dǎo)的CHS1基因使受試?yán)ハx(chóng)發(fā)育停滯而死亡[42-44]。同樣，HK、G6PI、GFAT、GNPNA、PAGM和UAP等基因的異常表達(dá)[45-49]也會(huì)直接導(dǎo)致昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成過(guò)程受阻，最終導(dǎo)致昆蟲(chóng)畸形，甚至死亡。

在本研究中，經(jīng)HN-21 處理后，幼蟲(chóng)體內(nèi)sfTRE1、sfHK、sfG6PI、sfGFAT、sfCHS1和sfCHS2等基因表達(dá)量均顯著下調(diào)，使試蟲(chóng)無(wú)法正常完成幾丁質(zhì)合成過(guò)程?；衔颒 N-2 1 對(duì)sfUAP的表達(dá)沒(méi)有顯著影響，而sfPAGM表達(dá)量顯著上調(diào)。這一現(xiàn)象在其他藥劑的研究中也有報(bào)道，如受除蟲(chóng)脲處理的柑橘木虱Diaphorina citri體內(nèi)，幾丁質(zhì)合成酶基因相對(duì)表達(dá)水平顯著上調(diào)[50]；經(jīng)過(guò)井岡霉素處理24 h 后，柑橘木虱海藻糖酶基因顯著上調(diào)[51]；斜紋夜蛾在受到井岡霉素處理后，其體內(nèi)多個(gè)幾丁質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)量同樣會(huì)顯著上調(diào)[19]。這表明有可能存在一種反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，受試?yán)ハx(chóng)幾丁質(zhì)含量的缺失刺激了部分相關(guān)基因被進(jìn)一步激活，試圖通過(guò)此過(guò)程來(lái)補(bǔ)償幾丁質(zhì)含量不足。另外，HN-21 處理后的幾丁質(zhì)合成通路大多數(shù)基因的表達(dá)量變化時(shí)間 (48 h)同樣是稍晚于高劑量虱螨脲處理組 (24 h)，但在72 h 時(shí)兩組已無(wú)明顯差異，與生物學(xué)表型、幾丁質(zhì)含量的變化趨勢(shì)一致。

4 結(jié)論與展望

新型苯甲酰脲類(lèi)化合物HN-21 相較于NK-17溶解能力明顯提升，且其對(duì)草地貪夜蛾的殺蟲(chóng)活性遠(yuǎn)高于推薦用藥虱螨脲，LC50值約為虱螨脲LC50值的1/15；高劑量的虱螨脲對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響的時(shí)間略早于HN-21，但兩者最終在對(duì)草地貪夜蛾幾丁質(zhì)通路相關(guān)基因的表達(dá)量、幾丁質(zhì)含量等方面的下降影響程度上無(wú)明顯差異。本研究為苯甲酰脲類(lèi)對(duì)昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成的具體調(diào)控過(guò)程提供理論依據(jù)，同時(shí)HN-21 高效的殺蟲(chóng)活性也為綠色殺蟲(chóng)劑研發(fā)提供了理論支撐。