胡慈銀, 王錦鵬, 肖永欣, 李俊凱*,,2

(1.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)藥研究所，湖北 荊州 434025)

農(nóng)作物病蟲草害是制約糧食安全生產(chǎn)的重要因素。化學(xué)防治是預(yù)防植物病蟲草害發(fā)生并對(duì)其進(jìn)行管控的有效手段，但農(nóng)藥不合理使用難免對(duì)糧食生產(chǎn)及質(zhì)量造成不利影響[1]。因此，創(chuàng)制具有高活性、高選擇性、低風(fēng)險(xiǎn)、無(wú)殘留及清潔生產(chǎn)的綠色農(nóng)藥是未來(lái)中國(guó)農(nóng)藥發(fā)展的主要趨勢(shì)。近年研究表明，天然產(chǎn)物在綠色農(nóng)藥研究領(lǐng)域潛力巨大，一些植物、微生物或海洋生物的提取物展現(xiàn)出良好的殺蟲、殺菌及除草效果。例如：利用植物苦皮藤Celastrus angulatusMaxim.制成的殺蟲劑能夠高效作用于鱗翅目昆蟲靶標(biāo)Na+/K+-adenosine triphosphatase (ATPase)[2]；從假單胞菌和鏈霉菌等微生物中提取的申嗪霉素 (phenazine-1-carboxylic acid)已被登記為防治水稻紋枯病的高效殺菌劑[3]。此外，海洋天然產(chǎn)物蘆竹堿 (gramines) 類似物和匹普利寧 (pimprinine) 生物堿等也具有良好的抗病毒活性[4-5]。

大黃酸 (Rhein，4,5-dihydroxyanthraquinone-2-carboxylic acid) 屬于單核蒽醌類衍生物，主要從藥用植物大黃、虎杖及何首烏等多種傳統(tǒng)中藥材中分離提取[6-7]，具有抗炎、抑菌、抗腫瘤、抗病毒和抗氧化等活性[8-11]。以往對(duì)大黃酸的研究多集中在醫(yī)藥領(lǐng)域。大黃酸也是雙醋瑞因 (diacerein) 的活性代謝物，Boileau 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，雙醋瑞因的作用機(jī)理是其代謝物大黃酸能夠抑制胞外信號(hào)相關(guān)激酶ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinase-1/2) 和p38 的活性，進(jìn)而減少骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織中白細(xì)胞介素1β(interleukin-1-beta) 誘導(dǎo)的金屬蛋白 (metalloprotease-13) 和組織蛋白酶K(cathepsin K) 的合成，從而影響非正常軟骨組織的代謝及破骨組織的分化。Yang 等[13]對(duì)大黃酸3 號(hào)位上的羧基進(jìn)行取代，分別合成了具有苯環(huán)結(jié)構(gòu)和酰胺結(jié)構(gòu)的兩個(gè)系列衍生物。生物活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，這些衍生物對(duì)Hela 和Molt4 等腫瘤細(xì)胞具有較好療效。王興達(dá)等[14]在大黃酸羧基酰胺化的基礎(chǔ)上繼續(xù)對(duì)蒽醌母核C7 位進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，通過(guò)微孔板法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在大黃酸蒽醌母核C7 位取代基上引入未取代雜環(huán)，可增強(qiáng)其對(duì)大腸桿菌的抑制作用。在農(nóng)用活性研究方面，朱祥等[15]對(duì)大黃酸進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造，將其與氨基酸耦合，嘗試從得到的系列衍生物中篩選到既具有良好的生物活性又具有韌皮部傳導(dǎo)性的耦合物。生物活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，4,5-二甲氧基大黃酸氨基酸酯耦合物在離體條件下，對(duì)水稻紋枯病菌具有較好的殺菌活性，但其殺蟲和除草效果不佳，且不具備韌皮部傳導(dǎo)性。

β-氨基丁酸 (β-aminobutyric acid，BABA) 是一種植物體內(nèi)次生非蛋白質(zhì)氨基酸，可激活植物自身免疫系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)植物對(duì)多種生物和非生物脅迫做出防御反應(yīng)來(lái)提高自身免疫能力[16-18]。作為一種極具潛力的廣譜性植物誘抗劑，BABA 不僅能夠提高不同植物對(duì)霜霉病、白粉病和軟腐病等病害的抗病性，而且能誘導(dǎo)植物對(duì)煙草花葉病毒、細(xì)菌、卵菌和線蟲等產(chǎn)生局部和系統(tǒng)抗性[19]。已有研究表明，以植物內(nèi)源物質(zhì)如糖或氨基酸等為導(dǎo)向基團(tuán)，通過(guò)其與農(nóng)藥活性成分耦合，得到的衍生物具有韌皮部傳導(dǎo)性[20-21]。本研究擬將BABA作為導(dǎo)向基團(tuán)，將其與先導(dǎo)化合物大黃酸耦合，設(shè)計(jì)、合成一系列衍生物，以期篩選到既保留大黃酸的生物活性和BABA 的誘導(dǎo)抗性，又具有韌皮部傳導(dǎo)性等性質(zhì)的內(nèi)吸傳導(dǎo)型誘抗殺菌劑。

目標(biāo)化合物3a、3b、4a 和4b 的合成路線分別見(jiàn)圖式1 和圖式2。

圖式1 目標(biāo)化合物3a 和3b 的合成線路Scheme 1 Synthesis routes of target compounds 3a and 3b

圖式2 目標(biāo)化合物4a 和4b 的合成線路Scheme 2 Synthesis routes of target compounds 4a and 4b

1 材料與方法

1.1 儀器與藥劑

Bruker Avance DPX400 型核磁共振儀 (以TMS 作內(nèi)標(biāo)物，CDCl3或DMSO-d6作溶劑，德國(guó)-瑞士布魯克光譜公司)；Thermo Scientific QExactive 型高分辨率質(zhì)譜儀 (ESI-MS，賽默飛世爾科技有限公司)；WRR 熔點(diǎn)測(cè)定儀 (上海精密科學(xué)儀器有限公司)；K2025 高效液相色譜儀 (山東悟空儀器有限公司)；Sorvall Legend Micro 21R 型微量冷凍離心機(jī) (賽默飛世爾科技有限公司)；SENSE 425-301 型多功能酶標(biāo)儀 (芬蘭Hidex 公司)。

大黃酸原藥、β-氨基丁酸乙酯鹽酸鹽和DL-β-氨基丁酸 (純度均為98%)，購(gòu)自上海晶純生化科技股份有限公司；過(guò)氧化物酶 (POD) 活性檢測(cè)試劑盒和苯丙氨酸解氨酶 (PAL) 活性檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。其他化學(xué)試劑均為市售國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 供試材料

供試病原菌：水稻紋枯病菌Rhizoctonie solaniKühn、小麥赤霉病菌Fusarium graminearum、油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum、玉米小斑病菌Cochlibolus heterostrophus、小麥莖基腐病菌F u s a r i u m p s e d o g r a m i n e a r u m和辣椒疫霉Phytophthora capsici，均由長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

供試植物：小麥Triticum aestivum品種為“京雙16”，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所提供。蓖麻Ricinus communisL.，由山東省淄博市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.3 目標(biāo)化合物的合成

中間體β-氨基丁酸乙酯溶液的制備：稱取1.15 gβ-氨基丁酸乙酯鹽酸鹽于100 mL 圓底燒瓶中，加入30 mL 二氯甲烷超聲溶解，再加入3.5 g三乙胺常溫?cái)嚢?，反?yīng)3 h 后即可獲得β-氨基丁酸乙酯溶液。

1.3.1 目標(biāo)化合物3a 和3b 的合成 參考文獻(xiàn)的方法[15]合成。稱取1.31 g 大黃酸于150 mL 圓底燒瓶中，加入50 mL 二氯甲烷，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹尤? mLN,N-二甲基甲酰胺 (DMF)，緩慢滴加1.26 g 草酰氯，升溫至50 ℃回流，反應(yīng)12 h，用薄層色譜 (TLC,V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 4 : 1)監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完畢，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到中間體1 用于下一步反應(yīng)。向化合物1 中加入15 mL 二氯甲烷，使其完全溶解。在冰浴條件下，將β-氨基丁酸乙酯溶液轉(zhuǎn)移至恒壓滴液漏斗中，緩慢滴加到反應(yīng)液中，室溫反應(yīng)2 h。減壓濃縮，加入二氯甲烷100 mL 溶解并用飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥后，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，通過(guò)柱層析 (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =8 : 1) 分離純化，得到目標(biāo)化合物3a (4-乙氧羰基-2-丁基氨基大黃酸酰胺，簡(jiǎn)稱β-氨基丁酸-大黃酸乙酯)。

稱取1.0 g 化合物3a 于150 mL 圓底燒瓶中，加入1,4-二氧六環(huán) (1,4-dioxane) 50 mL，常溫充分?jǐn)嚢枞芙?，緩慢滴?.38 g 氫氧化鋰溶于5 mL 水的溶液，室溫?cái)嚢?4 h (反應(yīng)液由黃色變?yōu)榧t褐色)，用TLC (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 6 : 1) 監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完畢。滴加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至5.0，析出固體后抽濾，加入二氯甲烷50 mL 溶解并用飽和氯化鈉溶液洗滌3 次，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，烘干得到目標(biāo)化合物3b (4-羧基-2-丁基氨基大黃酸酰胺，簡(jiǎn)稱β-氨基丁酸-大黃酸)。

1.3.2 目標(biāo)化合物4a 和4b 的合成 參考文獻(xiàn)的方法[15]制備，稱取1.47 g 大黃酸于250 mL 圓底燒瓶中，加入80 mL 無(wú)水甲醇充分溶解后，室溫下緩慢滴加5 mL 二氯亞砜，升溫至回流，反應(yīng)24 h。TLC (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 4 : 1) 監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完畢。將反應(yīng)液倒入500 mL 冷水中充分?jǐn)嚢?，析出黃色固體，抽濾，烘干后得到中間體A。

稱取1.43 g 中間體A 于250 mL 圓底燒瓶中，加入80 mL DMF 溶解。冰浴條件下，加入0.32 g氫氧化鈉，攪拌10 min，緩慢滴加8.4 g 碘甲烷，升溫至回流反應(yīng)1 h，TLC (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 4 : 1) 監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完畢。向反應(yīng)液中緩慢滴加稀鹽酸，調(diào)節(jié)溶液pH 至7.0，加水?dāng)嚢?0 min，抽濾，烘干，得到中間體B。

稱取1.85 g 中間體B 于150 mL 圓底燒瓶中，加入30 mL 乙醇充分溶解后，稱取0.32 g 氫氧化鈉溶解于30 mL 水中，將其緩慢滴加入反應(yīng)液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1 h，TLC (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 6:1) 監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完畢。緩慢滴加稀鹽酸于反應(yīng)液中，調(diào)節(jié)pH 至3.0，加水逐漸有固體析出，抽濾，將固體用甲醇溶解，減壓濃縮，烘干，得到中間體C (甲氧基大黃酸)。

稱取1.47 g 中間體C 于150 mL 圓底燒瓶中，加入50 mL 二氯甲烷充分溶解后，加入1 mL DMF，緩慢滴加1.28 g 草酰氯，升溫至50 ℃回流，反應(yīng)10 h，TLC (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =4 : 1) 監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完畢。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑后加入30 mL 二氯甲烷，使其完全溶解。冰浴條件下，將β-氨基丁酸乙酯溶液緩慢滴加到圓底燒瓶反應(yīng)液中，室溫反應(yīng)2 h。TLC (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 4 : 1) 監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完畢。減壓濃縮，加入二氯甲烷100 mL 溶解并用飽和氯化鈉水溶液洗滌3 次，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥后，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，用柱層析 (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) =8 : 1) 分離純化，得到目標(biāo)化合物4a (4-乙氧羰基-2-丁基氨基-4,5-二甲氧基大黃酸酰胺，簡(jiǎn)稱β-氨基丁酸-甲氧基大黃酸乙酯)。

稱取1.1 g 化合物4a 于150 mL 圓底燒瓶中，加入50 mL 1,4-二氧六環(huán)常溫充分?jǐn)嚢枞芙?，再稱取0.15 g 氫氧化鋰溶解于5 mL 水中，將氫氧化鋰水溶液緩慢加入反應(yīng)體系中，室溫?cái)嚢? h 后，反應(yīng)液由黃色變?yōu)榧t褐色，TLC (V(石油醚) :V(乙酸乙酯) = 6 : 1) 監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完畢。滴加稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 至5.0，析出固體后抽濾，加入二氯甲烷50 mL 溶解并用飽和氯化鈉溶液洗滌3 次，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥后，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，烘干得到目標(biāo)化合物4b (4-羧基-2-丁基氨基-4,5-二甲氧基大黃酸酰胺，簡(jiǎn)稱β-氨基丁酸-甲氧基大黃酸)。

1.4 生物活性測(cè)定方法

1.4.1 離體抑菌活性測(cè)定方法 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[22]測(cè)定4 個(gè)目標(biāo)化合物對(duì)6 種植物病原真菌的離體抑菌活性。稱量對(duì)應(yīng)質(zhì)量的目標(biāo)化合物，用1 mL 二甲基亞砜 (DMSO) 溶解，然后使用含有0.2% 吐溫80 的雙蒸水定容至50 mL，備用。向PDA 培養(yǎng)基中加入等體積的供試藥液，充分混勻 (各組分終濃度：供試藥劑為0.2 mmol/L 或0.5 mmol/L，DMSO 為1%，吐溫80 約為0.1%)后制成含藥平板 (Φ= 90 mm)。以大黃酸為對(duì)照藥劑，以含1% DMSO 和0.1% 吐溫80 的雙蒸水處理為空白對(duì)照。使用直徑為6 mm 的打孔器在活化菌培養(yǎng)基上制備菌餅，接種至含供試藥劑的培養(yǎng)基中央，28 ℃黑暗培養(yǎng)72 h。每處理設(shè)置3 次生物學(xué)重復(fù)。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。按公式（1）計(jì)算各處理藥劑對(duì)供試病原菌的菌絲增長(zhǎng)抑制率（I）。

式中：DCK為空白對(duì)照PDA 培養(yǎng)基上菌絲平均直徑，mm；DPT為處理后PDA 培養(yǎng)基上菌絲平均直徑，mm。

1.4.2 誘導(dǎo)抗性相關(guān)酶活性測(cè)定方法 參考文獻(xiàn)方法[23]進(jìn)行。以大黃酸和DL-β-氨基丁酸為對(duì)照藥劑，以含1% DMSO 及0.1%吐溫80 的無(wú)菌水作為空白對(duì)照，供試藥劑的濃度為10 mmol/L。稱量對(duì)應(yīng)質(zhì)量的目標(biāo)化合物，用5 mL DMSO 溶解后，使用含有0.5% 吐溫80 的雙蒸水稀釋至500 mL，備用。采用葉面噴霧的方式對(duì)抽穗期小麥進(jìn)行噴霧處理。每20 株為一組處理，每處理設(shè)置3 次重復(fù)。分別在施藥1、3、5、7 和9 d 后采集小麥旗葉，用液氮速凍后放入 -80 ℃冰箱備用。分別使用PAL 活性檢測(cè)試劑盒和POD 活性檢測(cè)試劑盒按照說(shuō)明書以96 孔板法測(cè)定PAL 和POD 活性。

1.4.3 目標(biāo)化合物韌皮部傳導(dǎo)性測(cè)定方法 參考文獻(xiàn)[24-25]的方法，采用蓖麻幼苗體系測(cè)定目標(biāo)化合物的韌皮部傳導(dǎo)性。以L型纈氨酸-申嗪霉素耦合物 (L-Val-PCA) 為對(duì)照藥劑，設(shè)置供試藥劑濃度為0.2 mmol/L。首先將蓖麻種子置于自來(lái)水中在室溫下浸泡過(guò)夜，27°C 催芽48 h。挑選發(fā)芽一致的種子播種于蛭石內(nèi)培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)條件：溫度27°C、相對(duì)濕度80%。挑選16 株長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗 (下胚軸長(zhǎng)約25 mm、胚乳直徑約20 mm) 剝除胚乳洗凈，將子葉浸泡于MES 緩沖液 (20 mmol/L MES、0.25 mmol/L MgCl2和0.5 mmol/L CaCl2，pH5.6)、胚根于0.5 mmol/L CaCl2溶液中同時(shí)預(yù)孵育2 h。用刀片在距離子葉同胚軸交際處約20 mm的彎鉤處小心切斷，然后向MES 緩沖液中補(bǔ)充供試藥劑使其終濃度為0.2 mmol/L[26]。每隔1 h 于切口處收集韌皮部滲出液，連續(xù)收集5 h。使用雙蒸水對(duì)收集的滲出液按照V(雙蒸水) :V(滲出液) =2 : 1 的比例進(jìn)行稀釋，用0.22 μm 濾膜過(guò)濾，高效液相色譜 (HPLC) 檢測(cè)。每處理設(shè)置3 次重復(fù)。

化合物3b 色譜檢測(cè)條件：色譜柱為Venusil XBP C18反相色譜柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)，柱溫為35℃，流動(dòng)相為V[甲醇(A)] :V[0.1%甲酸水(B)] = 70 : 30，流速為0.9 mL/min，檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為229 nm，進(jìn)樣量為10 μL。化合物4b 色譜檢測(cè)條件與3b 基本一致，色譜柱為Venusil XBP C18反相色譜柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)，柱溫為35℃，流動(dòng)相為V[甲醇(A)] :V[0.1%甲酸水溶液(B)] = 65 : 35，流速為0.8 mL/min，檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為226 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 目標(biāo)化合物的物理性質(zhì)及結(jié)構(gòu)表征

4-乙氧羰基-2-丁基氨基大黃酸酰胺 (3a)：黃色固體，收率72.7%，m.p.201 ～ 203°C.1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ12.04 (s, 1H), 12.00 (s, 1H), 8.12 (d,J= 1.6 Hz, 1H), 7.88(dd,J= 7.6, 1.2 Hz, 1H), 7.77 ～ 7.69 (m, 2H), 7.34 (dd,J=8.4, 1.2 Hz, 1H), 4.20 (qd,J= 7.2, 1.2 Hz, 2H), 2.66 (qd,J=16.0, 5.2 Hz, 2H), 1.38 (d,J= 6.8 Hz, 3H), 1.30 (t,J= 7.2 Hz,3H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ192.02, 181.69,171.18, 163.77, 161.86, 161.57, 142.30, 138.03, 134.12,133.85, 125.02, 122.94, 119.92, 118.13, 118.04, 116.65, 60.38,43.35, 40.85, 20.58, 14.55.HRMS, 計(jì)算值 C21H19NO7[M +H]+: 398.1234, 實(shí)測(cè)值 398.1239.

4-羧基-2-丁基氨基大黃酸酰胺 (3b)：黃色固體，收率81.5%，m.p.234 ～ 235℃.1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ12.25 (s, 1H), 11.89 (d,J= 3.6 Hz, 2H), 8.78 (d,J= 8.0 Hz,1H), 8.11 (d,J= 1.6 Hz, 1H), 7.87 ～ 7.78 (m, 1H), 7.77 ～ 7.70(m, 2H), 7.43 ～ 7.37 (m, 1H), 4.41 ～ 4.31 (m, 1H), 2.61 (dd,J= 15.6, 7.2 Hz, 1H), 2.45 (dd,J= 15.6, 7.2 Hz, 1H), 1.21 (d,J= 6.4 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ191.98,181.61, 172.85, 163.63, 161.84, 161.57, 142.30, 138.03,134.04, 133.78, 125.00, 122.95, 119.91, 118.08, 118.02,116.56, 43.31, 40.85, 20.62.HRMS, 計(jì)算值 C19H15NO7[M +H]+: 370.0921, 實(shí)測(cè)值 370.0924.

4-乙氧羰基-2-丁基氨基-4,5-二甲氧基大黃酸酰胺(4a)：黃色固體，收率83.7%，m.p.157 ～ 158℃.1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ8.03 (d,J= 1.2 Hz, 1H), 7.88 (d,J= 1.2 Hz,1H), 7.83 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 7.65 (t,J= 8.0 Hz, 1H), 7.31 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.19 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 4.65 ～ 4.52 (m, 1H),4.19 (q,J= 7.2 Hz, 2H), 4.06 (s, 3H), 4.00 (s, 3H), 2.73 ～ 2.60(m, 2H), 1.38 (d,J= 6.8 Hz, 3H), 1.29 (t,J= 7.2 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, CDCl3)δ183.52, 182.27, 171.66, 164.48,159.98, 159.59, 139.15, 134.83, 134.56, 134.19, 125.67,123.84, 119.03, 118.30, 117.30, 115.47, 60.89, 56.80, 56.55,42.89, 39.77, 20.03, 14.23.HRMS, 計(jì)算值 C23H23NO7[M +H]+: 426.1547, 實(shí)測(cè)值 426.1554.

4-羧基-2-丁基氨基-4,5-二甲氧基大黃酸酰胺 (4b)：黃色固體，收率53.5 %，m.p.205 ～ 206℃.1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ8.78 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 8.15 (d,J= 1.2 Hz,1H), 7.85 (d,J= 1.2 Hz, 1H), 7.81 ～ 7.68 (m, 2H), 7.59 ～ 7.52(m, 1H), 4.38 (dt,J= 14.0, 7.0 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.92 (s,3H), 2.62 (dd,J= 15.6, 7.0 Hz, 1H), 2.48 ～ 2.41 (m, 1H), 1.22(d,J= 6.4 Hz, 3H).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6)δ183.47,181.44, 172.89, 164.17, 159.21 (2C), 139.75, 134.93, 134.65,134.56, 125.51, 123.89, 119.50, 118.66, 117.53, 117.18, 56.97,56.82, 43.31, 40.94, 20.69.HRMS, 計(jì)算值 C21H19NO7[M +H]+: 398.1234, 實(shí)測(cè)值 398.1236.

2.2 目標(biāo)化合物的生物活性

2.2.1 離體抑菌活性 測(cè)定結(jié)果 (表1) 顯示：在藥劑濃度為0.2 mmol/L 時(shí)，目標(biāo)化合物3b 對(duì)水稻紋枯病菌 (抑制率40.2%) 和油菜菌核病菌 (41.6%)的抑制作用優(yōu)于對(duì)照藥劑大黃酸 (28.5%和24.0%)。當(dāng)藥劑濃度調(diào)整為0.5 mmol/L 時(shí)，化合物3b 對(duì)水稻紋枯病菌 (62.6%)和小麥赤霉病菌 (41.3%) 的抑制作用優(yōu)于對(duì)照藥劑大黃酸。此外，化合物4b 對(duì)水稻紋枯病菌 (53.5%) 和小麥赤霉病菌 (40.2%) 的抑制作用也優(yōu)于對(duì)照藥劑大黃酸。表明在0.5 mmol/L時(shí)化合物3b 和4b 對(duì)水稻紋枯病菌和小麥赤霉病菌均具有較好的抑制作用。

表4 目標(biāo)化合物對(duì)6 種植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 1 Inhibition of target compounds against six pathogens in vitro

2.2.2 誘導(dǎo)抗性 如圖1A 所示，在藥劑供試濃度為10 mmol/L 時(shí)，使用大黃酸處理小麥葉片1、3、5、7 和9 d 后，同CK 相比PAL 活性變化無(wú)顯著性差異。使用BABA 處理后的1、5 和7 d 后，酶活性變化同CK 相比顯著增高，其中，處理3 d后PAL 活性極顯著增高。但在BABA 處理9 d后，PAL 活性同CK 相比無(wú)顯著性差異。使用化合物3b 處理小麥葉片后，僅在第3 天檢測(cè)到PAL活性呈顯著上升，其他時(shí)間同CK 相比PAL 活性變化無(wú)顯著性差異。化合物4b 處理小麥葉片1、5 和7 d 后，酶活性變化同CK 相比顯著增高，其中，在處理3 d 后PAL 活性呈極顯著增高。如圖1B 所示，對(duì)于POD 活性來(lái)說(shuō)，使用大黃酸處理小麥葉片1 和3 d 后，同CK 相比酶活性變化無(wú)顯著性差異。處理5 d 后POD 活性極顯著降低，處理7 d 后酶活性變化同CK 相比無(wú)顯著性差異，處理9 d 后，同對(duì)照相比POD 活性變化又顯著降低。使用BABA 處理小麥1、3、5、7 和9 d 后，POD 活性同CK 相比顯著上升。然而，在化合物3b 處理小麥葉片后的任意時(shí)間段，POD 活性同CK 相比都無(wú)顯著性差異。使用化合物4b 處理小麥1 d 后POD 活性無(wú)顯著性變化，處理3 和5 d后活性顯著上升，但在7 d 后活性無(wú)顯著性變化，甚至在第9 天后POD 活性出現(xiàn)顯著下降。使用化合物4b 處理小麥葉片后PAL 和POD 的活性變化趨勢(shì)與激活劑BABA 基本一致表明4b 可能在誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性方面發(fā)揮重要作用。

圖1 不同化合物 (Rhein、BABA、3b 和4b) 處理小麥植株后的酶活性檢測(cè)(＊: P ＜ 0.05, ＊＊: P ＜ 0.01, ＊＊＊: P ＜ 0.001)Fig.1 Detection of the enzyme activity after the treatment of wheat leaves by the different compounds (Rhein, BABA, 3b 和4b) (＊: P ＜ 0.05, ＊＊: P ＜ 0.01, ＊＊＊: P ＜ 0.001).

2.3 目標(biāo)化合物的韌皮部傳導(dǎo)性

蓖麻幼苗體系檢測(cè)供試化合物的韌皮部傳導(dǎo)性發(fā)現(xiàn)：在蓖麻韌皮部滲出液中未檢測(cè)到大黃酸、化合物3a 和4a，說(shuō)明三者不具備韌皮部傳導(dǎo)性。對(duì)照藥劑L-Val-PCA 在蓖麻幼苗韌皮部滲出液中的濃度為26.9 μmol/L。HPLC測(cè)試目標(biāo)化合物3b 和4b 的韌皮部滲出液濃度分別為1.7 和15.1 μmol/L (圖2)，說(shuō)明二者具有韌皮部傳導(dǎo)性?；衔?b 標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積與濃度之間的回歸方程為y= 11.5041x+ 2.1869，相關(guān)系數(shù)為r=0.9998；化合物4b 的回歸方程為y= 22.7776x+7.6147，相關(guān)系數(shù)為r= 0.9999；對(duì)照樣品L-Val-PCA 的回歸方程為y= 0.1181x+ 5.6624，相關(guān)系數(shù)為r= 0.9987。

圖2 HPLC 測(cè)試目標(biāo)化合物3b 和4b 的韌皮部傳導(dǎo)性Fig.2 HPLC test of the phloem translocation of target compounds 3b and 4b

3 討論與結(jié)論

以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造，通過(guò)耦合植物內(nèi)源物質(zhì)如糖或氨基酸的方式來(lái)增加母體的韌皮部傳導(dǎo)能力，是改善農(nóng)藥內(nèi)吸性的有效手段之一。Yu 等[27]以PCA 為先導(dǎo)化合物合成了一系列氨基酸-申嗪霉素耦合物，其中，L-Val-PCA不僅保留了部分對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌活性，而且具有良好的韌皮部傳導(dǎo)性。本研究以大黃酸為先導(dǎo)化合物，以BABA 為導(dǎo)向基團(tuán)，合成了4 個(gè)BABA-大黃酸耦合物，其中化合物3b 和4b 在0.5 mmol/L 時(shí)對(duì)水稻紋枯病菌和小麥赤霉病菌的抑制效果優(yōu)于對(duì)照大黃酸。這說(shuō)明以植物次生代謝物質(zhì)為導(dǎo)向基團(tuán)對(duì)天然產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造具有可行性。雖然4b 對(duì)水稻紋枯病菌的生長(zhǎng)抑制作用(53.5%) 低于3b (62.6%)，但從誘導(dǎo)抗性檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，在使用化合物4b 處理小麥葉片后近一周的時(shí)間內(nèi)，PAL 和POD 一直保持較高活性，誘導(dǎo)效果強(qiáng)于3b。從蓖麻幼苗韌皮部滲出液中檢測(cè)到的濃度來(lái)看，4b 的韌皮部傳導(dǎo)能力 (韌皮部滲出液中含量15.1 μmol/L) 遠(yuǎn)大于3b (1.7 μmol/L)，說(shuō)明將大黃酸的羥基基團(tuán)改變?yōu)榧籽趸鶊F(tuán)能夠提高其自身的誘導(dǎo)抗性及韌皮部傳導(dǎo)能力。此外，蓖麻幼苗作為一種模式植物被廣泛用于定性、定量地檢測(cè)農(nóng)藥的韌皮部傳導(dǎo)性[26]。開(kāi)發(fā)具有韌皮部傳導(dǎo)性的農(nóng)藥可實(shí)現(xiàn)藥劑被葉片吸收之后向下輸導(dǎo)，有利于對(duì)維管束病害的防治。本研究發(fā)現(xiàn)，在供試化合物濃度為0.5 mmol/L 時(shí)，除了3b 和4b 對(duì)水稻紋枯病菌和小麥赤霉病菌的抑制效果優(yōu)于對(duì)照大黃酸外，其他化合物對(duì)6 種供試植物病原菌的抑菌效果并不明顯，甚至低于大黃酸。Kleier等[28]曾指出，前體農(nóng)藥 (pro-pesticide) 往往不能兼具良好的“生物活性”和“韌皮部傳導(dǎo)性”，這種現(xiàn)象在合成的糖基-氟蟲腈耦合物[29]、拌種咯衍生物[30-31]和氨基酸-申嗪霉素耦合物[27,32]中也有報(bào)道。Yang 等[29]采用D-葡萄糖-氟蟲腈耦合物處理4 葉期蓖麻幼苗子葉，待其吸收7 h 后，通過(guò)高效液相色譜-質(zhì)譜 (HPLC-MS)聯(lián)用儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，蓖麻幼苗韌皮部滲出液中該耦合物的濃度可達(dá)90 μmol/L，但同時(shí)發(fā)現(xiàn)，耦合物對(duì)3 齡小菜蛾P(guān)lutella xylostella幼蟲的LC50值 (167.28 mg/L) 顯著高于對(duì)照氟蟲腈 (21.39 mg/L)。待D-葡萄糖-氟蟲腈耦合物經(jīng)蓖麻成株葉片吸收48～72 h 后，通過(guò)HPLC-MS 檢測(cè)其在根部和下端莖中的含量發(fā)現(xiàn)，該耦合物可發(fā)生降解作用，從而將先導(dǎo)化合物氟蟲腈釋放出來(lái)，發(fā)揮殺蟲作用，實(shí)現(xiàn)防控效果。β-氨基丁酸-大黃酸耦合物是否存在水解作用以及如何保持較高的生物活性，并能擁有良好的韌皮部傳導(dǎo)性有待進(jìn)一步研究。

本研究以天然產(chǎn)物大黃酸為先導(dǎo)化合物，以BABA 為導(dǎo)向基團(tuán)，合成了4 個(gè)目標(biāo)化合物，且4 個(gè)目標(biāo)化合物均保留了先導(dǎo)化合物的部分抑菌活性。BABA 是一種植物次生代謝產(chǎn)物。作為非蛋白氨基酸，其自身具有誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性且能在植物體內(nèi)傳導(dǎo)等性質(zhì)，在農(nóng)藥分子中引入該基團(tuán)，既能保留農(nóng)藥本身的活性，又能賦予耦合物傳導(dǎo)性和誘導(dǎo)抗性，這對(duì)于內(nèi)吸傳導(dǎo)型誘抗殺菌劑的分子設(shè)計(jì)具有重要意義。