郭沫言, 熊 晶, 汪漢成, 張 藝,蔡劉體, 陳興江, 史彩華

(1.長(zhǎng)江大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴陽 550081；3.貴州省煙草公司 畢節(jié)市公司，貴州 畢節(jié) 551700；4.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025)

煙草靶斑病(tobacco target spot)是煙草生產(chǎn)上一種嚴(yán)重影響煙葉質(zhì)量的真菌性病害，其病原菌無性世代為立枯絲核菌Rhizoctonia solani，有性世代為亡革菌Thanatephorus cucumeris，在煙草苗期至大田成熟期均可發(fā)生，可侵染葉片與莖稈[1]，常對(duì)煙葉生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。目前，施用化學(xué)藥劑是煙草靶斑病防治最經(jīng)濟(jì)有效的技術(shù)措施[2]。我國已登記用于防控由絲核菌引起的植物病害的藥劑主要有百菌清、多菌靈、嘧菌酯、吡唑醚菌酯等，然而，登記用于防控?zé)煵莅邪卟〉乃巹┓N類很少，僅有8%井崗霉素水劑1 種[3]。亞胺類殺菌劑菌核凈 (dimetachlone) 是防治煙草葉斑類病害的常用藥劑，具有廣譜、高效、內(nèi)吸、持效期長(zhǎng)等特點(diǎn)，對(duì)油菜菌核病[4-6]、煙草赤星病[7-8]、黃瓜灰霉病[9]等均有較好的防控效果。長(zhǎng)期以來，菌核凈作為煙草赤星病的主要防控藥劑在煙葉生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用，然而，關(guān)于其對(duì)發(fā)生期較赤星病早的煙草靶斑病的防控效果卻不甚清楚。

葉際微生物與植物的生長(zhǎng)發(fā)育和代謝活動(dòng)緊密相關(guān)[10-13]，其與宿主植物長(zhǎng)期處于動(dòng)態(tài)平衡過程中[14-16]。已有研究發(fā)現(xiàn)，煙草赤星病和由Didymella segeticola引起的葉斑病發(fā)生時(shí)，隨著葉際病原菌的大量增殖，葉際微生物的群落結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生顯著改變[17-18]；煙草白粉病發(fā)生時(shí)，葉際微生物中高氏白粉菌屬 (Golovinomyces) 相對(duì)豐度顯著增加，曲霉屬 (Aspergillus) 和鏈格孢屬 (Alternaria) 的相對(duì)豐度也有所增加[19]。與此同時(shí)，殺菌劑在防治植物病害的過程中，也會(huì)引起植物葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性的變化。比如，吡蟲啉的施用使得桃樹葉際微生物的種類和相對(duì)含量均顯著增加[20]；施用烯酰嗎啉后，葡萄葉際真菌群落之間的差異顯著增大，而細(xì)菌群落之間的差異減小[21]；敵敵畏的施用會(huì)導(dǎo)致草莓葉際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[22]；于煙草赤星病發(fā)生期施用菌核凈，可顯著影響煙葉葉際寡養(yǎng)單胞菌屬、鞘脂單胞菌屬、黃桿菌屬和沙雷氏菌屬等有益細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變[23]等。相比較而言，作為煙葉生產(chǎn)上的常用藥劑菌核凈，關(guān)于其對(duì)煙草靶斑病發(fā)生期煙葉葉際微生物的調(diào)控規(guī)律卻缺乏研究和認(rèn)識(shí)。

為評(píng)價(jià)菌核凈防控?zé)煵莅邪卟〉臐摿Γ奈⑸鷳B(tài)角度揭示菌核凈在煙草靶斑病發(fā)生期應(yīng)用時(shí)，其對(duì)包括病原菌在內(nèi)的葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的調(diào)控規(guī)律，本研究采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定了菌核凈對(duì)煙草靶斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性，并于施藥后不同時(shí)期采集煙葉組織，通過 Illumina Hiseq 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)煙葉葉際真菌和細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了分析，旨在從微觀層面揭示菌核凈對(duì)煙草靶斑病的防治效果及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株及培養(yǎng)基 煙草靶斑病致病菌 (立枯絲核菌Rhizoctonia solani) 菌株 (J136、B8-31、B1-40、1B-3、1B-4、B5-19、B1-42、IB-1、B9-33、J206、BMT6、TMB23、BYB6、J144 和BYB5)，保藏于貴州省煙草研究院真菌實(shí)驗(yàn)室。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，用蒸餾水定容至1000 mL，120℃高溫滅菌，備用。

1.1.2 藥劑 90%菌核凈 (dimetachlone) 原藥及40%菌核凈可濕性粉劑 (dimetachlone 40% WP)，浙江禾益農(nóng)化有限公司生產(chǎn)。用丙酮作為溶劑將90%菌核凈原藥配制為1 × 104μg/mL 的母液，于4 ℃保存，備用。

1.1.3 試驗(yàn)地點(diǎn)及煙草品種 供試煙草品種為 ‘云煙87’，為貴州省煙葉產(chǎn)區(qū)主栽品種。試驗(yàn)于2020 年7 月14 日至8 月11 日在貴州省畢節(jié)市黔西縣高坡鄉(xiāng)村開展。

1.1.4 其他供試材料 DNA 提取試劑盒(Fast DNA? Spin Kit for Soil)，由MP Biomedicals 生物醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)；DNA 回收試劑盒，由Qiagen 公司生產(chǎn)；TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒，由 Illumina 公司生產(chǎn)。DSF01A-20-100 多功能噴霧施肥器，購自貴州黔豐源農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司。

1.2 菌核凈對(duì)煙草靶斑病菌菌絲的抑制效果測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[24]測(cè)定。在菌落邊緣打制直徑6 mm 的菌碟，分別接種于含不同質(zhì)量濃度菌核凈的PDA 平板上，以不加藥的PDA 平板為對(duì)照。菌核凈最終試驗(yàn)質(zhì)量濃度分別為0、0.1875、0.375、0.75、1.5、3 和6 μg/mL，每處理設(shè)4 個(gè)重復(fù)。接菌后將PDA 平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對(duì)照組菌落長(zhǎng)至2/3 平皿時(shí)，采用“十字交叉”法量取菌落直徑，計(jì)算藥劑不同劑量下的抑制率。以藥劑濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、抑制率幾率值為縱坐標(biāo)，建立毒力回歸方程[25]，計(jì)算EC50及EC90值。

1.3 施藥后不同時(shí)期葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析

1.3.1 試驗(yàn)方法 選取煙株長(zhǎng)勢(shì)一致的煙田劃分試驗(yàn)小區(qū)，每小區(qū)20 株，小區(qū)四周設(shè)保護(hù)行，每處理3 次重復(fù)，待靶斑病病葉率達(dá)10%時(shí)開始試驗(yàn)。參照藥劑施用說明，40% 菌核凈WP 有效成分用量約為4200 g/hm2，用水量900 L/hm2。采用多功能噴霧器對(duì)煙株正、反葉面均勻噴施至藥液開始流失。

1.3.2 樣品采集 分別于施藥前及施藥后1、3、9 和18 d 隨機(jī)進(jìn)行采樣。選取同一小區(qū)不同煙草植株，采用經(jīng)無菌消毒處理的剪刀剪取中下部成熟葉片 (同一葉片上取健康組織和感病組織)，10 g為一個(gè)樣本，裝入50 mL 無菌離心管中，于 - 80 ℃保存，備用。樣品采集信息具體如表1 所示，每處理3 次重復(fù)。試驗(yàn)后期因部分標(biāo)記煙葉被采烤，可供采集樣品的葉片數(shù)量有限，故施藥后9 d和18 d 的感病組織樣品為混合樣品。

1.3.3 煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與代謝功能分析

運(yùn)用CTAB 法提取所采集煙葉樣本的基因組DNA，取適量樣本DNA 加無菌水稀釋至1 ng/μL，以稀釋后的基因組DNA 為模板，使用特異性引物ITS5-1F-F (5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、ITS1-1F-R (5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′) 和515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)、806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)分別對(duì)葉際真菌和細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶采用Qiagen 公司提供的回收試劑盒回收。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 和Q-PCR 定量，采用NovaSeq6000 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，真菌和細(xì)菌分別通過UNITE (7.2) 數(shù)據(jù)庫和SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋。全過程在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

采用數(shù)據(jù)庫注釋后的初始數(shù)據(jù)對(duì)OTU 序列進(jìn)行物種注釋，利用Uparse v7.0.1001 軟件對(duì)所有樣本有效序列進(jìn)行聚類分析，通過Qiime 軟件(Version 1.9.1) 進(jìn)行各水平 (門、綱、目、科、屬)物種注釋分析和Alpha 多樣性分析、Beta 多樣性分析以及多樣本組間分析。使用Excel 2019 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理、通過DPS (V9.01) 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用Adobe Photoshop CS5 進(jìn)行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌核凈對(duì)煙草靶斑病菌的抑制效果

結(jié)果 (表2) 表明，菌核凈對(duì)15 株不同煙草靶斑病菌菌絲生長(zhǎng)均具有較強(qiáng)的抑制活性，且隨藥劑質(zhì)量濃度增加，抑制效果逐漸增強(qiáng)，6.47 μg/mL下可完全抑制菌絲生長(zhǎng)。不同菌株間對(duì)菌核凈的敏感性不同，其平均EC50與EC90值分別為1.20 和6.47 μg/mL。

表2 菌核凈對(duì)煙草靶斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性Table 2 Inhibition activity of dimetachlone to the mycelial growth of Rhizoctonia solani

2.2 施藥后不同時(shí)期健康與感病組織葉際微生物群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 煙葉葉際微生物測(cè)序深度 從樣本中隨機(jī)抽取一定測(cè)序量的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)其所代表的物種數(shù)目 (即OTU 數(shù)目)，構(gòu)建稀釋曲線 (圖1)。當(dāng)真菌測(cè)序深度達(dá)到500、細(xì)菌測(cè)序深度達(dá)到1400 時(shí)，稀釋曲線趨于平緩，表明其測(cè)序深度已涵蓋樣品中絕大多數(shù)真菌和細(xì)菌，測(cè)序結(jié)果可信度較高，可對(duì)其進(jìn)行下一步分析。

圖1 煙葉葉際真菌(A)和細(xì)菌(B)物種數(shù)目 (OTU) 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of specie number (OTU) of tobacco phyllosphere fungi (A) and bacteria (B)

2.2.2 健康與感病組織葉際微生物OTU 聚類 花瓣圖 (圖2) 分析表明：在可操作分類單元水平下，所有樣本的真菌與細(xì)菌共有OTU 數(shù)分別為6 種和18 種。施藥前及施藥后1、3、9 和18 d，健康組織的真菌OTU 數(shù)均高于感病組織，施藥前健康與感病組織真菌獨(dú)有OTU 數(shù)分別為12 種和2 種，且均在施藥后9 d 下降至最低值；施藥前健康與感病組織細(xì)菌獨(dú)有OTU 數(shù)分別為11 種和18 種，且均在施藥后1 d 顯著下降，在施藥后3 d開始上升，健康組織細(xì)菌獨(dú)有OTU 數(shù)在施藥后9 d 達(dá)到最大值，而感病組織細(xì)菌獨(dú)有OTU 數(shù)在施藥后3 d 達(dá)到最大值，健康組織細(xì)菌OTU 數(shù)高于感病組織。

2.2.3 健康與感病組織葉際微生物Alpha 多樣性

Alpha 多樣性分析結(jié)果 (表3、表4) 表明，真菌群落和細(xì)菌群落的覆蓋度均達(dá)到0.99 以上，表明本研究對(duì)群落結(jié)構(gòu)的測(cè)序數(shù)據(jù)可以充分合理地反映微生物群落的多樣性和豐富度。表中Shannon指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映群落的多樣性，ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)反映群落的豐富度。

表3 煙葉葉際真菌Alpha 多樣性變化Table 3 The variety of Alpha diversity of phyllosphere fungi in tobacco

表4 煙葉葉際細(xì)菌Alpha 多樣性變化Table 4 The variety of Alpha diversity of phyllosphere bacterial in tobacco

從 表3 中可看出：施藥后3 d，健康組織樣本(QJJH3) 的真菌群落多樣性指數(shù)(Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)) 分別達(dá)到最低值0.80 和0.18；施藥后9 d，感病組織樣本的真菌群落多樣性指數(shù)分別上升至最大值(4.30 和0.92)；施藥后18 d，健康組織樣本 (QJJH5) 的真菌群落多樣性指數(shù)較施藥前呈上升狀態(tài)，而感病組織樣本的真菌群落多樣性指數(shù)則有所下降。施藥前后，真菌群落的豐富度指數(shù) (Chao1 指數(shù)和ACE 指數(shù)) 無顯著性差異。

從 表4 中可看出：健康組織樣本 (QJJH2) 的細(xì)菌群落多樣性指數(shù)均在施藥后1 d 達(dá)到最大值，后隨施藥時(shí)間延長(zhǎng)而下降，感病組織樣本 (QBJH3)的細(xì)菌群落多樣性指數(shù)在施藥后3 d 達(dá)到最大值；而施藥前后細(xì)菌群落的豐富度指數(shù)并無顯著性差異，健康組織與感病組織樣本的細(xì)菌群落豐富度指數(shù)亦無顯著性差異，施藥后18 d，其物種豐富度均呈上升趨勢(shì)。

2.2.4 健康與感病組織葉際微生物群落組成 經(jīng)不同濃度菌核凈處理后，不同時(shí)期內(nèi)煙葉健康與感病組織的葉際真菌和細(xì)菌群落組成均存在差異。其中，真菌類的優(yōu)勢(shì)菌門為擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、子囊菌門 (Ascomycota) 和被孢霉門 (Mortierellomycota) (圖3A)，優(yōu)勢(shì)屬為亡革菌屬 (Thanatephorus)、鏈格孢屬、鐮刀菌屬(Fusarium)、小布整球殼屬 (Plectosphaerella)、尾孢屬 (Cercospora)、莖點(diǎn)霉屬 (Phoma)、Hannaella屬、亞隔孢殼屬 (Didymella)、枝孢霉屬 (Cladosporium)和Boeremia屬 (圖3B)。藥劑處理前，健康和感病組織上均存在大量亡革菌屬真菌，且感病組織亡革菌屬的相對(duì)豐度 (88.31%) 高于健康組織 (54.86%)，藥劑處理后3、9 和18 d，健康與感病組織亡革菌屬的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為下降-上升-下降，健康組織亡革菌屬相對(duì)豐度在施藥后18 d達(dá)到最低值(5.93%)，感病組織亡革菌屬相對(duì)豐度在施藥后3 d 達(dá)到最低值 (22.00%)；健康與感病組織鏈格孢屬相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為上升-下降-上升，其相對(duì)豐度在施藥前最低，均為0.12%，施藥后18 d 達(dá)到最大值，分別為26.56%和3.06%；健康組織鐮刀菌屬相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為上升-下降-上升-下降，在施藥后9 d達(dá)到最大值(13.85%)，在施藥前相對(duì)豐度最低 (0)，感病組織鐮刀菌屬相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為上升-下降，施藥后1 d 相對(duì)豐度達(dá)到最高(0.06%)。

圖3 煙葉葉際真菌 (A、B) 和細(xì)菌 (C、D) 門和屬水平群落組成Fig.3 Phyllosphere fungal (A, B) and bacterial (C, D) community composition in tobacco based on phyla and genus level

菌核凈處理前后，煙葉葉際細(xì)菌類的優(yōu)勢(shì)菌門均為變形菌門 (Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門 (Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes) 和梭桿菌門 (Fusobacteria)，其中健康組織與感病組織共有的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、厚壁菌門和放線菌門 (圖3C)。細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬為假單胞菌屬 (Pseudomonas)、葡萄球菌屬 (Staphylococcus)、鞘氨醇單胞菌屬 (Sphingomonas)、甲基桿菌屬 (Methylobacterium)、馬賽菌屬 (Massilia)、梭桿菌屬 (Fusobacterium)、土地桿菌屬 (Pedobacter)、根瘤菌屬 (Rhizobiaceae)、黃單胞菌屬(Xanthomonas) 和奧雷單胞菌屬 (Aureimonas)(圖3D)。藥劑處理前，感病組織的假單胞菌屬相對(duì)豐度 (15.07%) 高于健康組織 (0.59%)，藥劑處理3、9 和18 d 后，其相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為上升-下降-上升，健康與感病組織假單胞菌屬均在施藥后1 d 達(dá)到最大值，分別為60.16%和21.75%；健康與感病組織葡萄球菌屬在施藥前相對(duì)豐度均為0，施藥后總體變化趨勢(shì)為先上升再下降，感病組織葡萄球菌屬相對(duì)豐度在施藥后3 d 達(dá)到最大值(24.85%)，健康組織葡萄球菌屬相對(duì)豐度在施藥后1 d 達(dá)到最大值 (4.63%)；健康組織鞘氨醇單胞菌屬相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為上升-下降-上升，施藥前相對(duì)豐度為1.07%，在施藥后1 d 相對(duì)豐度達(dá)到最大值 (8.46%)，感病組織鞘氨醇單胞菌屬相對(duì)豐度變化趨勢(shì)為下降-上升-下降-上升，施藥前相對(duì)豐度為1.88%，施藥后1 d 相對(duì)豐度達(dá)到最低值(0.5 4%)，施藥后3 d 相對(duì)豐度達(dá)到最高值(15.34%)。

2.2.5 煙葉葉際微生物種群相關(guān)性 對(duì)藥劑處理后的葉際微生物進(jìn)行屬水平TOP 50 的相關(guān)系數(shù)計(jì)算。結(jié)果表明：施藥后，煙葉葉際真菌屬之間主要呈現(xiàn)正相關(guān)性，僅部分菌群之間呈負(fù)相關(guān)，如亡革菌屬與Stagonosporopsis屬、Boeremia屬、莖點(diǎn)霉屬 、鏈格孢屬、亞隔孢殼屬、枝孢屬(Cladosporium)、Symmetrospora屬、Strelitziana屬和Golovinomyces屬呈負(fù)相關(guān)關(guān)系 (圖4A)。細(xì)菌各屬之間絕大部分也呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性，僅葡萄球菌屬與黃桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬 與Ruminococcaceae屬、黃桿菌屬與Blautia屬、奧雷單胞菌屬與Agathobacter屬、新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium) 與乳酸桿菌屬 (Lactobacillus)之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系 (圖4B)。

圖4 煙葉葉際真菌(A)和細(xì)菌(B)屬水平TOP 50 相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Analysis of the TOP 50 correlation network between phyllosphere fungal (A) and bacterial (B) in tobacco

2.2.6 煙葉葉際微生物功能組成分析 真菌群落FUNGuild 功能預(yù)測(cè)結(jié)果 (圖5A) 顯示：菌核凈處理前，煙葉健康和感病組織葉際真菌優(yōu)勢(shì)功能群均為植物病原菌類群 (plant pathogen) 和動(dòng)物病原菌-內(nèi)生菌-植物病原菌-木質(zhì)腐生菌類群(animal pathogen-endophyte-plant pathogen-wood saprotroph)，且感病組織的植物病原菌類群相對(duì)豐度高于健康組織；施藥后1、3 和9 d，健康和感病組織植物病原菌類群相對(duì)豐度均逐漸下降；施藥后18 d，健康和感病組織的植物病原菌類群相對(duì)豐度均達(dá)到最低。

圖5 FUNGuild 葉際真菌(A)和細(xì)菌(B)功能注釋聚類熱圖Fig.5 FUNGuild heatmap of functional prediction of phyllosphere fungi(A) and bacteria(B) in tobacco

細(xì)菌群落FUNGuild 功能預(yù)測(cè)結(jié)果 (圖5B) 顯示：煙葉健康和感病組織葉際細(xì)菌優(yōu)勢(shì)功能群在藥劑處理前后并未發(fā)生明顯變化，其優(yōu)勢(shì)功能群為新陳代謝類群 (metabolism)、遺傳信息處理類群(genetic information processing)、未分類類群(unclassified)、環(huán)境信息處理類群 (environmental information processing)、細(xì)胞過程類群 (cellular processes)、人類疾病類群(human diseases)和有機(jī)體系統(tǒng)類群 (organismal systems)；菌核凈處理后18 d，感病組織細(xì)胞過程類群和遺傳信息處理類群的相對(duì)豐度均呈上升趨勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

本研究測(cè)定了不同濃度菌核凈對(duì)煙草靶斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性，其EC50值為1.20 μg/mL，在質(zhì)量濃度為6.47 μg/mL 下即可完全抑制菌絲生長(zhǎng)。該結(jié)果與汪漢成等[26]和孫美麗等[27]報(bào)道的菌核凈對(duì)煙草立枯絲核菌的抑制活性結(jié)果相似，其EC50值分別在1.15～1.46 μg/mL 之間和1.57～2.00 μg/mL 之間。在較低的劑量下，菌核凈對(duì)靶斑病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性較強(qiáng)，據(jù)此推測(cè)菌核凈對(duì)煙草靶斑病應(yīng)具有較好的治療作用活性。除此之外，靶斑病菌還可產(chǎn)生大量的擔(dān)孢子進(jìn)行傳播，且傳播速度快，但菌核凈對(duì)其擔(dān)孢子產(chǎn)生與萌發(fā)的活性尚不清楚，有待下一步深入研究，以明確菌核凈對(duì)煙草靶斑病的預(yù)防作用活性。

本研究表明，靶斑病發(fā)生時(shí)，煙葉健康與感病組織的葉際優(yōu)勢(shì)真菌屬均為亡革菌屬、鏈格孢屬與鐮刀菌屬，這與孫美麗等[28]報(bào)道的煙草靶斑病不同病級(jí)煙葉葉際微生物優(yōu)勢(shì)真菌屬為亡革菌屬和鏈格孢屬的研究結(jié)果類似，盡管兩者取樣的時(shí)間和地點(diǎn)各不相同，但均發(fā)現(xiàn)感病組織的亡革菌屬相對(duì)豐度高于健康組織，而健康組織鏈格孢屬與鐮刀菌屬相對(duì)豐度高于感病組織，據(jù)此可推測(cè)煙草靶斑病發(fā)生時(shí)期，亡革菌屬、鏈格孢屬及鐮刀菌屬為煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，煙草靶斑病葉際微生物中有尾孢屬和亞格孢殼屬等葉際常見真菌的存在，而前人的研究結(jié)果表明，尾孢屬為煙草蛙眼病病原菌[29]，亞格孢殼屬則可造成煙草葉斑病的發(fā)生[30]。施用菌核凈后3 d，健康與感病組織亡革菌屬相對(duì)豐度顯著下降，鐮刀菌屬和鏈格孢屬相對(duì)豐度升高，表明菌核凈對(duì)煙草靶斑病病原菌亡革菌屬具有較好的速效性，可迅速抑制其種群數(shù)量；施藥后9 d，感病組織亡革菌屬相對(duì)豐度升高，而鏈格孢屬相對(duì)豐度下降，推測(cè)菌核凈的持效期有限，當(dāng)藥劑降解后病原菌仍有增殖的風(fēng)險(xiǎn)。

葉際菌屬相關(guān)性分析表明，亡革菌屬與鏈格孢屬呈負(fù)相關(guān)。在功能類群上二者均屬于煙葉致病菌，而預(yù)測(cè)分析卻并未表現(xiàn)出相加的致病性結(jié)果，據(jù)此推測(cè)煙草上的病原真菌共存時(shí)可能存在營養(yǎng)、空間等競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系而表現(xiàn)出負(fù)相關(guān)作用，但這一相關(guān)性假設(shè)還有待通過活體試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。而亡革菌屬與鐮刀菌屬、尾孢屬和亞格孢殼屬等致病菌在相關(guān)性分析中顯示無互作關(guān)系，這可能與各病原菌的種群豐度有關(guān)，這些病原菌共存時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)性、適合度及環(huán)境適應(yīng)力等值得深入研究。

高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙葉健康與感病組織葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌均為假單胞菌屬、葡萄球菌屬和鞘氨醇單胞菌屬，與孫美麗等[28]報(bào)道的煙草靶斑病葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為假單胞屬、泛菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬和Lelliottia屬的結(jié)果存在些許差異，與徐慧等[31]報(bào)道的煙草健康葉片葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為假單胞菌屬、葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬的結(jié)果同樣存在少許差異。說明煙葉葉際細(xì)菌的種類相對(duì)穩(wěn)定，假單胞菌屬和葡萄球菌屬等細(xì)菌為煙葉葉際習(xí)居菌，但少量差異細(xì)菌的存在可能與煙葉品種、采集地點(diǎn)、環(huán)境及煙草生育期等不同有關(guān)。已有的研究發(fā)現(xiàn)，植物葉際微生物來源復(fù)雜且呈動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)受到植物內(nèi)在因素和環(huán)境條件的影響[32]。菌核凈施用后3 d，健康與感病組織假單胞菌屬、葡萄球菌屬與鞘氨醇單孢菌屬相對(duì)豐度均上升；施藥后9 d，其相對(duì)豐度均下降；而在施藥后18 d，假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬相對(duì)豐度上升，葡萄球菌屬相對(duì)豐度則下降。盡管菌核凈屬于防控真菌性病害的藥劑，但其應(yīng)用同時(shí)可顯著改變?nèi)~際細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)，該結(jié)果與孫美麗等[33]報(bào)道的醚菌酯引起煙葉葉際細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)變化的結(jié)果類似。這一方面可能是由于菌核凈等殺菌劑對(duì)細(xì)菌的直接作用，另一方面也有可能是由于殺菌劑在改變?nèi)~際真菌種群結(jié)構(gòu)時(shí)所產(chǎn)生的間接作用。在對(duì)煙葉葉際細(xì)菌相關(guān)性的分析中發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬之間存在正相關(guān)關(guān)系，這可能與其功能類群相同有關(guān)。至于葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與煙草靶斑病病原菌亡革菌屬之間是否存在互作關(guān)系目前尚不清楚。

本研究所用的擴(kuò)增子高通量測(cè)序技術(shù)尚不能對(duì)真菌與細(xì)菌間的互作關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，還有待通過致病性表型試驗(yàn)等進(jìn)一步深入研究。假單胞菌屬是一類廣泛存在于環(huán)境、植物及空氣中的細(xì)菌，其丁香假單胞桿菌煙草致病變種Pseudomonas syringanpv.tabaci和丁香假單胞桿菌角斑?；蚉.syringaepv.angula分別為煙草野火病和細(xì)菌性角斑病的致病菌，可引起煙草細(xì)菌性病害的發(fā)生[34-36]；而泛菌屬與鞘氨醇單胞菌屬等非致病菌與植物的抗逆性息息相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，煙葉葉際假單胞菌屬細(xì)菌為煙草靶斑病為害期的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，該類細(xì)菌與煙草上同屬的上述2 種致病型丁香假單胞菌在煙葉上的定植規(guī)律、致病力差異等有待繼續(xù)開展研究。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了煙葉葉際鞘氨醇單胞菌屬及泛菌屬等優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。Li 等[37]的研究表明，鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌對(duì)柑橘黑點(diǎn)病間座殼菌Diaporthe citri表現(xiàn)出強(qiáng)烈的拮抗作用，而泛菌屬細(xì)菌能有效抑制柑橘黑點(diǎn)病菌孢子萌發(fā)與菌絲生長(zhǎng)。推測(cè)這些葉際細(xì)菌為煙葉葉際益生菌，然而其具體種類尚不清楚，有待通過分離鑒定明確其準(zhǔn)確種類，以便開展深入的功能研究。本研究發(fā)現(xiàn)菌核凈同時(shí)對(duì)假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬的種群結(jié)構(gòu)存在影響，結(jié)果與Chen 等[38]研究菌核菌對(duì)煙草赤星病防控作用時(shí)發(fā)現(xiàn)其對(duì)這兩種菌屬的影響結(jié)果類似，推測(cè)菌核凈可能對(duì)煙草葉際益生菌具有調(diào)控作用，進(jìn)而影響煙草靶斑病的發(fā)生。