史艷 肖雅茹 李麗霞 李梅蘭

關(guān)鍵詞：黃瓜；F-box基因家族；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

植物在生長過程中常受環(huán)境帶來的脅迫傷害，在此過程中進(jìn)化出多種調(diào)節(jié)機(jī)制來保障其生命活動的正常進(jìn)行，其中，F(xiàn)-box蛋白參與的泛素-蛋白酶體途徑（UPP）是最重要的調(diào)節(jié)機(jī)制之一[1]，可參與細(xì)胞內(nèi)80%以上蛋白質(zhì)的降解，從而防御和緩解脅迫帶來的損傷[2]。由Skp1、Cullin1、F-box構(gòu)成的E3泛素連接酶復(fù)合物（SCF）是UPP途徑關(guān)鍵組分[3]，其中含有F-box結(jié)構(gòu)域的F-box蛋白可特異性識別底物并與之結(jié)合，參與調(diào)控胞內(nèi)蛋白降解、受體識別、信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程[4-6]。

F-box基因廣泛存在于各種植物中，其家族鑒定的重要標(biāo)識是F-box結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在物種進(jìn)化中較為保守，由位于N端的40～50個氨基酸組成，可與C端其他結(jié)構(gòu)域結(jié)合共同發(fā)揮作用[7]。隨著第1個F-box基因UFO（Unusualfloralorgans）在擬南芥中被鑒定[8]，對F-box基因的研究越來越深入，例如，F(xiàn)-box蛋白ACRE189/ACIF1通過調(diào)節(jié)茉莉酸和脫落酸的基因表達(dá)來參與防御反應(yīng)[9]；葡萄中分離出的F-box基因（BIG-24.1）在葡萄葉片感染灰霉病期間高表達(dá)，使植株表現(xiàn)出抗性增強(qiáng)[10]；水稻F-box蛋白MoFwd1與MoSkp1相互作用，抑制分生孢子萌發(fā)，從而降低稻瘟病菌的致病性[11]。目前F-box基因家族已經(jīng)在玉米[12]、小麥[13]、陸地棉[14]、番茄[15]、蠶豆[16]等作物中進(jìn)行了全基因組鑒定及詳細(xì)分析，但在主要蔬菜作物黃瓜（CucumissativusL.）中的研究較少。

本研究基于黃瓜基因組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法鑒定黃瓜F-box基因家族成員，系統(tǒng)分析了其基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、保守基序、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)、順式作用元件及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系等特性，以及在不同生物脅迫下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步探究黃瓜F-box家族基因功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 黃瓜F-box基因家族獲取與鑒定

從Pfam數(shù)據(jù)庫查找下載擬南芥F-box保守結(jié)構(gòu)域（Pfam號：PF00646）文件，在葫蘆科作物基因組網(wǎng)站（http：//cucurbitgenomics.org/）下載黃瓜的全基因組數(shù)據(jù)（cucumber_ChineseLong_v2_genome.fa）和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)（cucumber_ChineseLong_v2_pep.fa）。通過HMMER3.0軟件查找含有F-box保守結(jié)構(gòu)域的黃瓜基因，設(shè)置E-value<10-5，作為F-box基因家族的候選成員。利用TBtools軟件調(diào)取候選家族成員的氨基酸序列，通過NCBI中的CD-search功能鑒定候選成員保守結(jié)構(gòu)域的完整性并去除冗余，具有完整F-box結(jié)構(gòu)域的候選基因即為黃瓜F-box基因家族成員。

1.2 黃瓜F-box基因染色體定位分析

從葫蘆科作物基因組網(wǎng)站下載黃瓜基因的gff文件，通過TBtools軟件調(diào)取基因位置信息，利用在線網(wǎng)站MG2C-v2.0（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）繪制染色體定位圖并進(jìn)行修飾。

1.3 黃瓜F-box基因結(jié)構(gòu)和Motif分析

將F-box家族基因的CDS和基因全長的fasta文件導(dǎo)入GSDS2.0（http：//gsds.gao-lab.org/index.php）進(jìn)行黃瓜F-box基因結(jié)構(gòu)分析。使用在線網(wǎng)站MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）進(jìn)行保守基序分析，Motif參數(shù)設(shè)置為10[17]，并利用TBtools軟件對黃瓜F-box蛋白的保守基序進(jìn)行可視化。

1.4 黃瓜F-box蛋白理化性質(zhì)分析

將篩選出的F-box家族成員通過TBtools軟件調(diào)取其氨基酸序列，并利用在線網(wǎng)站ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行理化性質(zhì)的分析。

1.5 黃瓜F-box基因家族亞細(xì)胞定位與二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過在線網(wǎng)站Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）對黃瓜F-box基因家族蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。利用SPOMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在線分析工具分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。通過在線網(wǎng)站SWISS-MODEL（https：//swissmodel.Expasy.org/）對黃瓜F-box基因家族的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測。

1.6 黃瓜F-box基因家族啟動子順式作用元件分析

利用在線分析網(wǎng)站PlantCARE（http：//bioin?formatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）中的SearchforCARE功能對黃瓜F-box基因家族起始密碼子ATG上游2000bp的序列進(jìn)行啟動子順式作用元件分析。

1.7 黃瓜F-box基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將黃瓜F-box基因家族的氨基酸序列使用MEGA7.0軟件利用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap設(shè)為1000[18]。利用在線網(wǎng)站iTOL（https：//itol.embl.de/）對進(jìn)化樹進(jìn)行美化。

1.8 黃瓜F-box基因的表達(dá)模式分析

利用前人報道的黃瓜RNA-seq數(shù)據(jù)信息，獲取黃瓜在霜霉菌[19]和丁香假單胞菌[20]脅迫下F-box家族基因的表達(dá)量（每百萬reads中來自某基因每千堿基長度的reads數(shù)，RPKM）信息，進(jìn)行基因表達(dá)模式分析，以探討F-box家族基因在防御生物脅迫方面的調(diào)節(jié)機(jī)制。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜F-box基因家族成員鑒定與染色體定位分析

根據(jù)擬南芥F-box保守結(jié)構(gòu)域信息在黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫篩選，并驗證候選基因蛋白序列的保守性，結(jié)果顯示，有22個與F-box保守結(jié)構(gòu)序列高度匹配的蛋白序列（E-value<10-5），且不均勻分布在黃瓜7條染色體上（圖1）。其中，4號染色體上被定位的基因最多，為6個，其次是3號染色體上有4個基因，1號、5號和6號染色體分別含有3個基因，2號染色體有2個基因，7號染色體有1個基因。依據(jù)22個基因在染色體上的排列順序，依次命名為CsF-box01～CsF-box22。

2.2 黃瓜F-box基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分析

對22個家族成員進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析，由圖2可知，不同基因的長短各異，所含的外顯子和內(nèi)含子的數(shù)目和位置也存在差異。其中，有8個基因為斷裂基因，外顯子數(shù)目為2～10個；CsF-box12基因長度最長，且外顯子個數(shù)最多；除基因CsF-box13、CsF-box11外，其余基因兩端均含有上游或下游結(jié)構(gòu)。對黃瓜22個F-box基因進(jìn)行多重序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析后，22個F-box基因劃分為3類。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系的遠(yuǎn)近分析，位于同一分支上的基因結(jié)構(gòu)具有相似性，例如第一類（CsF-box02、CsF-box06、CsF-box08、CsF-box10、CsF-box15、CsF-box17、CsF-box20、CsF-box21）的基因均只含有1個外顯子無內(nèi)含子，除基因CsF-box02外，其余基因兩端均含有上游和下游結(jié)構(gòu)。這說明黃瓜F-box基因家族在進(jìn)化過程中是相對保守的。

對黃瓜F-box基因家族成員的保守基序進(jìn)行分析，共鑒定出10個保守基序（圖2），命名為Motif1～Motif10。除CsF-box13外，其余家族成員均含有Motif1，說明F-box基因家族相對保守。基于進(jìn)化關(guān)系，家族成員可分為3類，每一類的基因保守基序具有相似性，第1類基因含有的Motif種類最多，為4～8個；第2類種類最少，除CsFbox09、CsF-box13外，均只含有Motif1和Motif10；第3類中，除CsF-box11只含有Motif1外，其余均含有Motif10、Motif4和Motif2。

2.3 黃瓜F-box蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

對黃瓜F-box基因家族的編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示（表1），黃瓜F-box基因家族的編碼蛋白的氨基酸數(shù)目和分子質(zhì)量變化一致，其中，CsF-box14氨基酸數(shù)和分子質(zhì)量最小，最大的是CsF-box19；等電點為5.10～9.71，有12個酸性蛋白，10個堿性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為33.59～62.59，其中，CsF-box01、CsF-box15、CsF-box21的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，其余均為不穩(wěn)定蛋白；親水系數(shù)顯示，有20個家族成員的親水系數(shù)為負(fù)值，編碼蛋白為親水蛋白，2個成員為正值，為疏水蛋白。

2.4 黃瓜F-box蛋白亞細(xì)胞定位及二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

對黃瓜F-box基因家族編碼蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果分析（表2），發(fā)現(xiàn)有5個家族成員的編碼蛋白被定位到細(xì)胞核中，12個被定位到細(xì)胞質(zhì)中，3個被定位到線粒體中，CsF-box06編碼蛋白被定位到細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，CsF-box10編碼蛋白被定位到細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。對F-box基因家族成員進(jìn)行了二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（表2），結(jié)果顯示，55%家族成員的二級結(jié)構(gòu)主要由延伸鏈和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，45%的家族成員主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成。為了探討蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的準(zhǔn)確性，對22個家族成員的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行模型預(yù)測，結(jié)果如圖3所示，預(yù)測的蛋白三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)基本一致。

2.5 啟動子順式作用元件分析

為了探究黃瓜F-box基因家族的功能，進(jìn)行了啟動子順式作用元件分析，共鑒定出18個啟動子順式作用元件（圖4）。根據(jù)功能不同分為4類，分別為光響應(yīng)元件（3個）、激素響應(yīng)元件（5個）、生長發(fā)育相關(guān)元件（5個）、脅迫響應(yīng)相關(guān)元件（5個）。對啟動子的分析表明，黃瓜F-box基因家族可參與調(diào)控黃瓜生長發(fā)育和抗逆反應(yīng)緊密相關(guān)的多個代謝通路。

2.6 黃瓜F-box基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

蛋白的氨基酸序列，與黃瓜22個F-box蛋白序列一起構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，以探討黃瓜F-box基因家族與其他物種的親緣關(guān)系。如圖5所示，黃瓜F-box基因家族可分為4個亞組，分別將其命名為第Ⅰ～Ⅳ亞族，每個亞組分別含有3、6、5、8個基因。從整體來看，黃瓜F-box家族成員與擬南芥的親緣關(guān)系最近。在第Ⅰ亞組中，CsF-box09與AtF-box18、CsF-box05與AtF-box16分別聚為一小支，親緣關(guān)系較近；第Ⅱ亞組中，CsF-box11與AtF-box05、CsF-box13與AtF-box01、CsF-box04與AtF-box12具有很強(qiáng)的同源性；第Ⅲ亞組中，CsF-box01、CsFbox03、CsF-box07、CsF-box22和SmF-box08關(guān)系緊密；第Ⅳ亞組中，CsF-box20與SlF-box06、CsFbox17與SmF-box05、CsF-box19與SmF-box04分別聚合在一個分支。

2.7 黃瓜F-box基因在生物脅迫下的表達(dá)模式分析

利用前人發(fā)表的黃瓜RNA-seq數(shù)據(jù)庫，提取F-box家族基因表達(dá)信息，用于分析黃瓜F-box家族基因?qū)λ共〉捻憫?yīng)模式。結(jié)果表明，在霜霉菌脅迫下有8個F-box家族基因在抗性品系IL51（R）和易感品系IL53（S）中差異表達(dá)（圖6-A），其中，CsF-box08、CsF-box12、CsF-box21這3個基因隨霜霉菌處理時間增長呈現(xiàn)表達(dá)量升高的趨勢，相反地，基因CsF-box01、CsF-box09、CsF-box20和CsFbox14則隨處理時間增長呈現(xiàn)出表達(dá)量下降的趨勢。這說明該家族基因參與了霜霉菌侵染早期的響應(yīng)途徑，但其響應(yīng)模式存在較大差異，基因間還可能存在拮抗作用。值得注意的是，基因CsFbox04只在抗性品系中表達(dá)量較高，而在易感品系中表達(dá)量較低，且在同品系內(nèi)霜霉菌處理后的差異并不明顯，因此，推測該基因可能是導(dǎo)致IL51和IL53對霜霉菌產(chǎn)生不同抗性的原因之一。

根據(jù)已發(fā)表的黃瓜細(xì)菌性葉斑病的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，提取丁香假單胞菌接種0、1d抗性品系Gy14和感病品系B10的基因表達(dá)信息，以探討F-box家族基因在丁香假單胞菌脅迫早期的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有2個F-box家族基因在抗性品系Gy14和感病品系B10中差異表達(dá)（圖6-B）。其中，CsF-box09基因在Gy14和B10未接種丁香假單胞菌時表達(dá)量較高，但在接種1d時表達(dá)量較低；相反地，CsFbox10基因在未接種丁香假單胞菌時表達(dá)量較低，而接種1d時表達(dá)量較高。因此，推測CsF-box09可能負(fù)向調(diào)控黃瓜對細(xì)菌性葉斑病的抗性，而基因CsF-box10則與之相反，可能在調(diào)控黃瓜細(xì)菌性葉斑病抗性方面起積極作用。

3 結(jié)論與討論

本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，黃瓜F-box基因家族編碼蛋白絕大多數(shù)為不穩(wěn)定的親水蛋白，且45%F-box蛋白顯示為堿性，這與油菜[21]和茶樹[22]F-box蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。F-box蛋白亞細(xì)胞定位主要位于細(xì)胞質(zhì)中，可能參與了細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)的合成與降解，而蘋果[23]和蠶豆[24]中的F-box蛋白主要定位到細(xì)胞外，可能參與了胞外某些特定的生物學(xué)過程，這種差異可能是由于基因在不同物種進(jìn)化過程中產(chǎn)生了某種特定功能的分化造成的。根據(jù)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，位于同一類別的基因結(jié)構(gòu)與保守基序具有相似性，由此推測F-box基因家族成員之間具有較高的保守性。啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，黃瓜F-box基因家族含有大量激素響應(yīng)相關(guān)作用元件，其中，茉莉酸甲酯[25-26]、脫落酸[27-28]、水楊酸[29-30]、生長素[31]、赤霉素[32]是植物獲得抗性的重要調(diào)節(jié)劑，F(xiàn)-box基因可能是通過參與植物激素信號傳導(dǎo)過程，來響應(yīng)脅迫反應(yīng)[33]。

黃瓜在生產(chǎn)過程中常遭遇各種脅迫，其中以霜霉病、細(xì)菌性葉斑病、白粉病為代表的葉片病害尤為常見。在病害暴發(fā)時，黃瓜輕則減產(chǎn)20%～30%，重則造成毀滅性損害。為探究黃瓜F-box基因在生物脅迫下的作用，對其進(jìn)行了表達(dá)模式分析，結(jié)果表明，F(xiàn)-box基因參與了霜霉菌和丁香假單胞菌脅迫下黃瓜的防御途徑，在一定程度上緩解了生物脅迫帶來的損傷。由進(jìn)化樹可知，CsF-box01與SmF-box08、CsF-box14與SmF-box02、CsF-box21與SmF-box07親緣關(guān)系較近，推測其結(jié)構(gòu)與功能可能存在相似性。其中SmF-box08（Kelch結(jié)構(gòu)域）是茄子對細(xì)菌性葉斑病抗性起正調(diào)控作用的候選基因[34]；SmF-box02編碼EBF1蛋白[34]，EBF1可抑制乙烯（Eth）的信號傳導(dǎo)[35]；SmF-box07（LRR結(jié)構(gòu)域）在茄子對細(xì)菌性葉斑病抗性起負(fù)調(diào)控作用[34]?；駽sF-box01（含有Kelch結(jié)構(gòu)域）、CsF-box14（編碼EBF1蛋白）、CsF-box21（LRR結(jié)構(gòu)域）在霜霉菌脅迫下差異性表達(dá)，因此，推測CsF-box01正向調(diào)控黃瓜對霜霉病的抗性，CsF-box14可能通過抑制乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來調(diào)控黃瓜對霜霉病的抗性，CsF-box21可能在黃瓜霜霉病抗性方面起負(fù)調(diào)控作用。AtF-box18基因編碼EID1蛋白為脫落酸的信號傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)控因子，可增強(qiáng)植物對溫度、干旱、鹽引起的非生物脅迫的抗性[36]。由進(jìn)化樹可知，基因CsF-box09與AtF-box18聚為一支，具有高度同源性。且CsF-box09在霜霉菌和丁香假單胞菌脅迫下差異表達(dá)，并含有脫落酸反應(yīng)元件，因此，推測基因CsF-box09可能負(fù)調(diào)控脫落酸的信號傳導(dǎo)來增強(qiáng)對霜霉病和葉斑病的抗性。CsF-box04同源基因AtF-box12編碼的F-box-Nictaba蛋白被證明是一種可結(jié)合N-乙酰乳糖胺的功能性凝集素，可參與水楊酸相關(guān)通路的植物防御反應(yīng)，在擬南芥中過表達(dá)該基因可減輕由丁香假單胞菌脅迫造成的傷害[37]。CsF-box04基因含有水楊酸反應(yīng)元件，并在抗性品系中表達(dá)量較高，因此，推測該基因是通過參與水楊酸相關(guān)防御通路來增強(qiáng)對病原菌的抗性。

本研究通過生物信息學(xué)的方法共鑒定出22個CsF-boxes，其分布在7條染色體上，均含有F-box（PF00646）結(jié)構(gòu)域，大多數(shù)成員含有Motif1基序，且在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布。CsF-boxes啟動子區(qū)存在大量與激素響應(yīng)、生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)相關(guān)順式作用元件。對霜霉菌和丁香假單胞菌脅迫后葉片中CsF-boxes基因表達(dá)模式進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)分別有8、2個F-boxes基因在病原菌脅迫下差異性表達(dá)，其表達(dá)模式多樣。其中，CsF-box09與AtFbox18、CsF-box04與AtF-box12為同源基因，且CsF-box09和CsF-box04分別含有脫落酸、水楊酸反應(yīng)元件，因此，推測CsF-box09負(fù)調(diào)控脫落酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來增強(qiáng)抗病性，CsF-box04則是通過參與水楊酸相關(guān)防御通路正向調(diào)控黃瓜霜霉病抗性。該結(jié)果為深入研究黃瓜F-box基因的生物學(xué)功能及響應(yīng)生物脅迫機(jī)制提供了參考。