梁伊菲 王春偉

關(guān)鍵詞：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）；尖孢鐮刀菌；黃芪；根腐病；可視化；快速檢測(cè)

由于輪作周期縮短、連作面積連續(xù)增加，黃芪根腐病在山西、甘肅、內(nèi)蒙古等黃芪主產(chǎn)區(qū)已普遍發(fā)生[1]，嚴(yán)重制約黃芪產(chǎn)業(yè)持續(xù)性發(fā)展[2-4]。高芬等[1]調(diào)查表明，黃芪在整個(gè)種植季會(huì)受到多種鐮刀菌的侵染，其中，尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）是主要病原菌之一。尖孢鐮刀菌是世界性分布的土傳病原真菌，有多種?；秃蜕硇》N，不同生理小種致病力有差異，存在生理小種分化[5]，可引起甘草、西瓜、番茄、草莓、香蕉及花卉等100多種植物發(fā)病[6-11]。

目前，對(duì)尖孢鐮刀菌的鑒定多通過PCR、熒光定量PCR技術(shù)[12]實(shí)現(xiàn)，伍文憲等[11]通過PCR方法針對(duì)鐮刀菌核糖體DNA中IGS序列間的差異，設(shè)計(jì)了1對(duì)特異性引物P_1/P_2，通過該檢測(cè)方法可從尖孢鐮刀菌中擴(kuò)增出條帶，同時(shí)測(cè)定出尖孢鐮刀菌的檢測(cè)閾值為100pg。但PCR技術(shù)所用時(shí)間較長(zhǎng)，需要通過凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果判定需要3～4h才能完成。黃懷冬等[12]改進(jìn)了測(cè)定土壤中尖孢鐮刀菌的熒光定量PCR方法，用尖孢鐮刀菌的孢子懸浮液和連續(xù)栽種的稻土制作成帶菌土，使用強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒從中提取DNA。根據(jù)引入預(yù)PCR前后所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，該方法令土壤中尖孢鐮刀菌的檢測(cè)下限提高了10倍。熒光定量PCR可對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確定量，但儀器昂貴，對(duì)操作人員的技術(shù)有一定的要求，在基層的使用條件受限，因此，不適合在田間推廣和應(yīng)用。

NOTOMI等[13]研發(fā)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）可在恒溫（60～65℃）下，利用鏈置換型DNA聚合酶針對(duì)目標(biāo)核酸靶序列進(jìn)行快速擴(kuò)增，是一種快速經(jīng)濟(jì)、特異性強(qiáng)的DNA擴(kuò)增方法。楊科等[5]通過LAMP檢測(cè)西瓜上的尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵ON），其檢測(cè)下限與姚錦愛等[14]對(duì)尖孢鐮刀菌的檢測(cè)一致，但僅能對(duì)西瓜幼苗是否被FON侵染作出正確判斷。針對(duì)黃芪上由尖孢鐮刀菌引起的根腐病的LAMP快速檢測(cè)方法目前未見報(bào)道。

本試驗(yàn)針對(duì)黃芪上分離出的尖孢鐮刀菌TEF-1alpha基因的特定靶向區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，通過對(duì)反應(yīng)溫度和時(shí)間優(yōu)化，以期建立黃芪根腐病的可視化快速檢測(cè)體系。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株 2019年采集到黃芪根腐病樣品，從中分離獲得尖孢鐮刀菌（Fusariumoxysporum）菌株，并通過柯赫氏法完成致病性測(cè)定。特異性檢測(cè)試驗(yàn)中用到的木賊鐮刀菌（Fusariumequiseti）、銳頂鐮刀菌（Fusariumacuminatum）、層出鐮刀菌（Fusariumproliferatum）、磚紅鐮刀菌（Fusariumlat?eritium）、變紅鐮刀菌（Fusariumincarnatum）、禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum）、枝孢菌（Clado?sporiumanthropophilum）、茄腐鐮刀菌（Fusariumsolani）、輪枝鐮刀菌（Fusariumverticillioides）和半裸鐮刀菌（Fusariumsemitectum）均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。以上菌株均保存于PDA試管斜面，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑及儀器 Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒、LAMPMasterMix試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司），SYBRGreenI核酸染料（北京索萊寶科技有限公司），NaOH，95%HCl，Tris，ddH2O。

HH-2水浴鍋（國(guó)華電器有限公司），C1000TouchThermalCyclerPCR儀（上海柏辰生物科技有限公司），Centrifuge5810r離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），三用紫外分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 LAMP引物設(shè)計(jì) 基于TEF-1alpha基因序列與Fusarium屬的相關(guān)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖1所示。

從黃芪根腐病樣品中分離獲得的Fusariumoxysporum與MRC1964、MRC2325、MRC2066、MRC2199和MRC2536聚于同一分支，明顯遠(yuǎn)離Fusarium屬的其他種。因此，可以通過TEF-1alpha基因序列區(qū)分不同鐮刀菌種。此外，將從NCBI獲取的尖孢鐮刀菌TEF-1alpha基因序列與其他鐮刀菌進(jìn)行比對(duì)，針對(duì)TEF-1alpha基因序列，使用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorerV5設(shè)計(jì)特異性引物：1對(duì)內(nèi)側(cè)引物FIP（F1c＋F2）和BIP（B1c＋B2）、1對(duì)外側(cè)引物F3和B3和1對(duì)環(huán)引物L(fēng)oopF和LoopB（表1）。

1.2.2 DNA提取 用Biospin真菌基因組DNA試劑盒提取所有供試菌株DNA。

1.2.3 LAMP體系優(yōu)化 反應(yīng)體系如表2所示，其中，F(xiàn)IP、BIP、LoopF、LoopB、F3和B3提前混合作為預(yù)混液。

將0.5μLSYBRGreenⅠ滴加在管蓋上，置于恒溫水浴鍋中反應(yīng)。為優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系，將其反應(yīng)溫度分別設(shè)置為60、61、62、63、64、65℃，反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)置為15、30、45、60、75min。待反應(yīng)結(jié)束后，振蕩離心管將反應(yīng)體系與SYBRGreenⅠ混勻，觀察254nm紫外燈下的熒光反應(yīng)以及1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 LAMP靈敏度檢測(cè) 用DNA質(zhì)量濃度測(cè)定儀測(cè)定尖孢鐮刀菌DNA質(zhì)量濃度。用ddH2O將得到的DNA濃度依次稀釋為10、1ng/μL以及100、10、1pg/μL和100fg/μL，分別取1μL作為L(zhǎng)AMP檢測(cè)方法的反應(yīng)模板，進(jìn)行靈敏度檢測(cè)并觀察紫外燈下的熒光反應(yīng)。

1.2.5 PCR靈敏度檢測(cè) 采用PCR技術(shù)作為靈敏度對(duì)照，質(zhì)量濃度為10ng/μL～100fg/μL，檢測(cè)其反應(yīng)靈敏度的下限，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳得到結(jié)果。

1.2.6 LAMP特異性檢測(cè) 將上述11種供試菌株的DNA在優(yōu)化的反應(yīng)條件下進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后，觀察反應(yīng)的特異性結(jié)果。

1.2.7 堿裂解法提取DNA 取0.2g的患病黃芪根部組織，加入2mLNaOH并在研缽中研磨成糊狀。將糊狀物質(zhì)轉(zhuǎn)移到1.5mL的離心管中，在離心機(jī)中于12000r/min離心6min。離心后取5μL的上清液與495μL的0.1mol/LTris-HCl（pH=8.0）混合均勻。取1.0μL混合物作為模板DNA進(jìn)行LAMP反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)溫度的優(yōu)化

結(jié)果表明，在60～65℃的溫度范圍內(nèi)，LAMP反應(yīng)呈陽性，凝膠電泳條帶呈階梯狀。觀察發(fā)現(xiàn)，在62℃下，LAMP反應(yīng)的凝膠電泳條帶最清晰（圖2-A），在紫外燈下產(chǎn)生的綠色熒光強(qiáng)度最大（圖2-B）。

2.2 反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

在62℃條件下，設(shè)置反應(yīng)時(shí)間范圍為15～75min，觀察到反應(yīng)時(shí)間為15min時(shí)，反應(yīng)為陰性，瓊脂糖凝膠中未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶（圖3-A），且無熒光反應(yīng)（圖3-B）；反應(yīng)時(shí)間為30min時(shí)，擴(kuò)增條帶最清晰、且熒光強(qiáng)度最大。

2.3 檢測(cè)LAMP與PCR方法的靈敏度

在優(yōu)化的反應(yīng)條件下，用TEF-1alpha基因部分序列進(jìn)行LAMP檢測(cè)，確定LAMP的檢測(cè)下限，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳（圖4-A）觀察擴(kuò)增結(jié)果和在紫外燈下觀察顯色反應(yīng)（圖4-B），結(jié)果表明，該LAMP方法檢測(cè)靈敏度為10pg/μL。

設(shè)置DNA質(zhì)量濃度為10ng/μL～100fg/μL，檢測(cè)PCR反應(yīng)靈敏度下限，通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明（圖5），其靈敏度為100pg/μL。

2.4 檢測(cè)LAMP引物的特異性

11種供試菌株在上述試驗(yàn)得到的最適溫度（62℃）和最適時(shí)間（30min）條件下，用尖孢鐮刀菌的3對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，以ddH2O代替模板DNA作為陰性對(duì)照，結(jié)果表明（圖6），除尖孢鐮刀菌外，其余供試菌株擴(kuò)增后均無電泳條帶（圖6-A），且在紫外燈下呈現(xiàn)橘色（圖6-B），其LAMP反應(yīng)結(jié)果同陰性對(duì)照一致，說明該LAMP方法對(duì)尖孢鐮刀菌具有較高的特異性。

2.5 檢測(cè)發(fā)病組織

使用LAMP方法檢測(cè)9份樣品，包括接種樣品、發(fā)病樣品和未感染樣品各3份，用堿裂解法提取DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)，結(jié)果顯示（圖7），所有染病樣品和接種樣品的LAMP檢測(cè)均出現(xiàn)階梯狀條帶。此外，該方法還可用于檢測(cè)田間患病植株上的尖孢鐮刀菌。

3 結(jié)論與討論

鐮刀菌是一種世界性的土傳真菌，可引起多種植物枯萎病或根腐病的發(fā)生[15-19]，近幾年有關(guān)于使用LAMP技術(shù)檢測(cè)尖孢鐮刀菌的報(bào)道，但大多集中于各種?；?，還有部分對(duì)草莓、柑橘等經(jīng)濟(jì)作物以及多肉植物上尖孢鐮刀菌的報(bào)道[19-23]，而針對(duì)黃芪上尖孢鐮刀菌的檢測(cè)技術(shù)未見報(bào)道。

本研究首次利用LAMP技術(shù)檢測(cè)黃芪根腐病，同時(shí)在研究中優(yōu)化LAMP反應(yīng)體系，確定了擴(kuò)增尖孢鐮刀菌DNA片段的最適反應(yīng)時(shí)間為30min和最適反應(yīng)溫度為62℃。使用LAMP方法測(cè)定的檢測(cè)下限為10pg/μL，比伍文憲等[11]通過PCR方法測(cè)定尖孢鐮刀菌的檢測(cè)下限高10倍。姚錦愛等[14]針對(duì)尖孢鐮刀菌建立的檢測(cè)體系需用時(shí)2h，而本研究中的快速檢測(cè)體系僅用時(shí)70min，檢測(cè)時(shí)間縮短了50min且檢測(cè)下限一致。黃熊娟等[16]和鄧晟等[17]研究尖孢鐮刀菌專化型檢驗(yàn)試劑盒，李信申等[18]測(cè)定了在芝麻、花生、馬鈴薯等作物上的檢測(cè)下限，用LAMP方法可在60min內(nèi)擴(kuò)增出尖孢鐮刀菌的目標(biāo)基因，而使用本研究中的快速檢測(cè)體系僅在30min內(nèi)就擴(kuò)增出目標(biāo)基因。本研究還提出將LAMP引物預(yù)先混合的思路，因3對(duì)引物在添加時(shí)處于相鄰位置，且在設(shè)計(jì)引物時(shí)避免了引物與引物之間形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所以，可以將其預(yù)先混合。試驗(yàn)證明，可以使用預(yù)混液代替常規(guī)LAMP體系建立時(shí)依次加入的3對(duì)引物。

可視化檢測(cè)常用于病害的快速診斷。模板DNA經(jīng)過擴(kuò)增后加入SYBRGreenI，陽性樣本出現(xiàn)綠色熒光，而陰性樣本呈現(xiàn)橙色。LIUYING等[24]、王芝涵等[25]針對(duì)玉米穗腐病上的溫和鐮刀菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)，在擴(kuò)增后加入SYBRGreenI，觀察到反應(yīng)體系顏色變化在紫外光與自然光下一致；但反應(yīng)后加入SYBRGreenI，可能導(dǎo)致氣溶膠污染，使體系出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，從而干擾擴(kuò)增結(jié)果的判定。本研究中，在LAMP擴(kuò)增前加入SYBRGreenI，不僅可直觀呈現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果，而且可避免假陽性反應(yīng)；同時(shí)，其反應(yīng)結(jié)果與凝膠電泳結(jié)果一致，也不需要復(fù)雜的設(shè)備和操作。因此，在反應(yīng)開始前加入SYBRGreenI不僅使反應(yīng)結(jié)果可視化，還可大大節(jié)省檢測(cè)所需的時(shí)間。

在LAMP檢測(cè)中，特定的靶向區(qū)域?qū)τ趨^(qū)分不同的物種至關(guān)重要[24-25]。TEF-1alpha是一種高度保守且普遍存在的蛋白，已被廣泛應(yīng)用m于研究鐮刀菌屬的種內(nèi)和種間變異和系統(tǒng)發(fā)育[25]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹可知，從黃芪根腐病樣品中分離獲得的尖孢鐮刀菌明顯遠(yuǎn)離Fusarium屬的其他種。因此，以TEF-1alpha區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)設(shè)計(jì)LAMP引物是合適的。研究表明，所設(shè)計(jì)的引物對(duì)尖孢鐮刀菌具有較高的特異性。本研究利用尖孢鐮刀菌的TEF-1alpha蛋白設(shè)計(jì)了一套引物，并結(jié)合堿裂解快速提取DNA方法，建立了尖孢鐮刀菌的LAMP快速檢測(cè)體系。田間實(shí)際樣品檢測(cè)試驗(yàn)表明，該LAMP體系具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，能對(duì)黃芪根部是否被尖孢鐮刀菌侵染作出正確判斷。