王 瑞,樸 龍

(延邊大學(xué) 附屬醫(yī)院1.急診科;2.康復(fù)科,吉林 延吉 133000)

急性腦梗塞是突然發(fā)生的腦組織缺血壞死或軟化,中老年為好發(fā)人群,是糖尿病、肥胖癥、高血壓為常見誘因的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病,其特征是腦部的血流供應(yīng)障礙或受限,并常導(dǎo)致腦部缺血缺氧性病變及損傷[1]。腦梗塞的預(yù)后與急性期的有效治療密切相關(guān)。燈盞花素具備使血液循環(huán)活化、改善血供的功效,它是傳統(tǒng)藥用植物燈盞花中國植物志正名為短庭葶飛蓬的粗略提取物。燈盞花素主要成分黃苓素(又名燈盞花乙素、野黃苓苷)具有很高的藥用價(jià)值且安全性高[2]。目前燈盞花素已被用于腦血管疾病的治療。

1 抗氧化應(yīng)激機(jī)制

腦缺血損傷的重要病理機(jī)制是氧化應(yīng)激反應(yīng),缺血缺氧后,活性氧(Reactive oxygen species,ROS)會(huì)過度產(chǎn)生,這可能跟氧化應(yīng)激發(fā)生相關(guān)[3]。研究表明,通過激活NF-E2相關(guān)因子/血紅素加氧酶-1(NF-E2-related Factor 2,Nrf2 / Heme oxygenase-1,HO-1)通路,可緩解缺血造成的細(xì)胞損傷。未發(fā)生腦缺血時(shí),Kelch樣ECH相關(guān)蛋白-1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap1)途徑可降解Nrf2;氧化物質(zhì)產(chǎn)生時(shí),打亂了Keap1-Nrf2結(jié)合,Nrf2與抗氧化應(yīng)答元件(Antioxidant response elements,ARE)抗氧化反應(yīng)通路被激活,使組織內(nèi)的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathion peroxidase,GSH-Px)和HO-1含量增高。同時(shí)增加Nrf2和HO-1可緩解缺血造成的組織氧化反應(yīng)損害。Nrf2是調(diào)節(jié)機(jī)體發(fā)揮抗氧化作用的重要因子,它可以在轉(zhuǎn)錄水平上介導(dǎo)調(diào)節(jié)ARE的II期解毒酶,并發(fā)揮抗氧化作用的HO-1;在休息條件下,此酶在低水平下隨處可見,并受到大量應(yīng)激刺激的高度調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)表明,HO-1在宿主防御ROS生成和氧化損傷方面也起著不可替代的作用[4]。在缺血后的24 h,燈盞花素治療顯著增加了缺血區(qū)Nrf2和HO-1的表達(dá),提示燈盞花素的保護(hù)作用可能與Nrf2和HO-1的上調(diào)節(jié)表達(dá)有關(guān)。

缺血再灌注后,減少氧自由基的蓄積是緩解微循環(huán)功能障礙的重要機(jī)制,細(xì)胞是ROS主要攻擊對象,破壞它們的膜、線粒體等,還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞自身物質(zhì)溶解造成機(jī)體內(nèi)皮細(xì)胞的破壞。SOD具有抗氧化應(yīng)激的能力,緩解細(xì)胞氧化損害。丙二醛(Malonaldehyde,MDA)是脂類物質(zhì)氧化應(yīng)激時(shí)的產(chǎn)物,可作為判斷細(xì)胞和組織氧化損傷程度的的指標(biāo)。王娓娓等[5]實(shí)驗(yàn)觀察到燈盞花素抗氧化損傷效果,與缺血損傷組比較,SOD表達(dá)水平在受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞增加。一氧化氮(NO)是一種對神經(jīng)細(xì)胞有毒的強(qiáng)力氧化應(yīng)激產(chǎn)物,細(xì)胞缺血缺氧后,NO表達(dá)量明顯提高。有實(shí)驗(yàn)表明:與缺血損傷組的大鼠相比,燈盞素治療組、燈盞花素聯(lián)合丙泊酚組使Nrf2和HO-1mRNA途徑受到抑制,減少了大鼠海馬組織MDA、NO表達(dá)含量,提高了SOD水平,改善了大鼠腦缺血損傷造成的神經(jīng)功能障礙。GSH-Px能夠清除氧化損傷時(shí)出現(xiàn)的MDA。缺血損傷組與燈盞花素組相比,發(fā)揮抑制氧化反應(yīng)的SOD和GSH-Px表達(dá)顯著提高,MDA含量顯著減少,提高了細(xì)胞的存活率。NO的合成過程需要一氧化氮合酶(Nitric oxide synthetase,NOS)重要參與,發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的是誘導(dǎo)型NOS(iNOS)。楚麗麗等[6]通過實(shí)驗(yàn)觀察到經(jīng)燈盞花滴丸處理組與氧化應(yīng)激損傷組比較發(fā)現(xiàn),MDA含量顯著減少,SOD活性提高,且iNOS活性及NO含量降低。綜上所述,提示燈盞花素可通過抑制MDA、iNOS、NO表達(dá),減少損傷細(xì)胞的氧化反應(yīng),提高SOD和GSH-Px含量,增加抗氧化能力從而發(fā)揮保護(hù)作用。

2 減輕細(xì)胞的炎性損傷

腦缺血損傷后,小膠質(zhì)細(xì)胞被活化,致多種炎性介質(zhì)的釋放。炎性損傷是腦缺血損傷后一個(gè)復(fù)雜的過程。一旦過多產(chǎn)生促炎因子或者細(xì)胞毒性因子,如白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1 beta,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、NO等可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷[7]。因此,保證小膠質(zhì)細(xì)胞不被過度激活,可減輕腦組織缺血后的炎性損傷。研究發(fā)現(xiàn),燈盞花素在動(dòng)物模型中可減輕炎性反應(yīng)的作用,它可以抑制大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞系被脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的促炎介質(zhì)如TNF-α、IL-1β、NO和ROS的產(chǎn)生。通過分別進(jìn)行體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究表明,燈盞花乙素使腦缺血大鼠和LPS誘導(dǎo)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞中促炎介質(zhì)(TNF-α,IL-1β,NO和ROS)的產(chǎn)生減少,實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)產(chǎn)生的iNOS表達(dá)減少。提示燈盞花素通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化,以此來減少神經(jīng)細(xì)胞的炎性損傷。

反映全身炎性反應(yīng)的標(biāo)記物超敏C反應(yīng)反蛋白(High-sensitivity C-reactive anti-protein,hs-CRP),可作為監(jiān)測心腦血管疾病的有效指標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn),hs-CRP的降低,可以改善機(jī)體的炎性損傷,減輕神經(jīng)功能障礙[8]。有研究觀察到聯(lián)合應(yīng)用燈盞花素組的患者與常規(guī)用西藥的患者相比,不僅降低了hs-CRP,還減少了炎癥指標(biāo)TNF-α水平,可用于評估腦缺血的預(yù)后情況。機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)時(shí),NF-κB起到關(guān)鍵性作用,研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞發(fā)生增值凋亡、炎性損傷時(shí),NF-kB-p65蛋白和其抑制性蛋白IkB-α可發(fā)揮重要的作用。丁丹等[9]研究表明缺血損傷后的大鼠降低了p65蛋白,使IκB-α蛋白表達(dá)提高,燈盞花素在缺血大鼠模型中發(fā)揮抑制炎癥損傷的作用。在各種先天性免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR),在大腦中,TLRs的表達(dá)主要由膠質(zhì)細(xì)胞中的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞完成,與相應(yīng)配子附著時(shí),可以產(chǎn)生促炎因子。在腦缺血條件下,神經(jīng)元中TLR2,TLR4和TLR9的表達(dá)升高,大量研究證明,腦缺血導(dǎo)致的炎性反應(yīng)時(shí),TLR2和TLR4可與內(nèi)源性配體結(jié)合并發(fā)揮重要作用[10]。研究顯示,IL-6和TNF-α受TLR4/NF-κB信號通路調(diào)節(jié)。童軍衛(wèi)等[11]實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,燈盞花素組與模型組比較大腦皮質(zhì)中NF-κB和TLR4表達(dá)減少,提示燈盞花素在腦缺血損傷時(shí)可通過抑制TLR4/NF-κB 通路的上調(diào)減輕腦細(xì)胞的炎性損傷。

3 減弱血腦屏障破壞

維持血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)結(jié)構(gòu)完整性對保護(hù)神經(jīng)中樞系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)具有重要意義。小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦組織血液循環(huán)供應(yīng)不足時(shí)被激活,炎癥因子發(fā)生聚集,BBB通透性增加大量有害物質(zhì)進(jìn)入,使其結(jié)構(gòu)受到破壞,將會(huì)導(dǎo)致大腦炎癥反應(yīng)和腦水腫的發(fā)生[12]。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果指出,單用燈盞花素和聯(lián)合應(yīng)用燈盞花素和冰片組與模型組大鼠比較,腦缺血后能明顯提高跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻(Transendothelial electrical resistance,TEER)值并使辣根過氧化物酶(Horse radish peroxidase,HRP)的通透率回降,保護(hù)BBB完整性;在蛋白表達(dá)水平上,聯(lián)合組與燈盞花素均使內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接蛋白-1(Zonula occluden 1,ZO-1)和大腦緊密連接蛋白-5(Claudin-5)蛋白的表達(dá)增加。以上研究提示燈盞花素改善BBB缺血損傷的機(jī)制可能與增加ZO-1和Claudin-5蛋白的表達(dá)有關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)中十分重要的兩種酶基質(zhì)金屬蛋白酶2和9(MMP-2、MMP-9)能夠?qū)⒕o密連接的蛋白(TJ)降解破壞BBB結(jié)構(gòu)完整性[13]。與反應(yīng)性星型膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、組織細(xì)胞相關(guān)的是MMP-2,與細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)的是MMP-9[14]。實(shí)驗(yàn)研究表明,治療組與模型組大鼠比較,缺血損傷后,BBB的通透性增加,伊文思藍(lán)(Evans blue,EB)含量隨著MMP-2和MMP-9表達(dá)變化,說明MMP-2和MMP-9和血腦屏障存在密切的相關(guān)性。用燈盞花素治療后,模型組大鼠腦部的MMP-2和MMP-9表達(dá)降低,腦組織中的EB含量也降低。提示燈盞花素減輕腦細(xì)胞損傷的機(jī)制可能與抑制MMP-2和MMP-9表達(dá),減輕血腦屏障破壞有關(guān)。

4 減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡

腦循環(huán)缺血時(shí),神經(jīng)細(xì)胞為了維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境自主性的有序死亡,即神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。腦血管狹窄或閉塞時(shí),神經(jīng)細(xì)胞的過度或不當(dāng)?shù)蛲鰰?huì)引起神經(jīng)功能障礙。因此,神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù),成為腦缺血治療的關(guān)鍵。細(xì)胞凋亡依賴于半胱天冬酶-3(Caspase-3),Caspase-3可被多種途徑激活,一旦被激活可以誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的不可逆性凋亡[15]。王少華等[16]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)治療組大鼠與模型組相比,TUNEL染色顯示棕色和褐色凋亡細(xì)胞的數(shù)量和海馬組織中Caspase-3蛋白表達(dá)下降,抑制了觸發(fā)細(xì)胞凋亡的途徑。腦缺血時(shí)線粒體受損,細(xì)胞凋亡被啟動(dòng)。Lu Yang等[17]實(shí)驗(yàn)表明模型組TUNEL陽性細(xì)胞增多,給藥組減少。一些凋亡相關(guān)的位點(diǎn)與燈盞花的活性成分具備結(jié)合能力,缺血部位的(BCL2-Associated X,Bax)、細(xì)胞-c和Caspase-3的表達(dá)受限。表明燈盞花的活性成分對腦缺血損傷的細(xì)胞凋亡起到重要的抑制作用。提示燈盞花素能通過減少Bax、Caspase-3的表達(dá)抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,增加細(xì)胞活力。在腦缺血損傷中,介導(dǎo)炎性反應(yīng)和促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的主要是由p38和JNK參與的,而ERK發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受損害的作用[18]。NO含量可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生,隨著其含量的增加,加劇神經(jīng)元產(chǎn)生的毒性作用,增加細(xì)胞凋亡數(shù)量。有研究指出,燈盞花素治療后激活小膠質(zhì)細(xì)胞的p38和JNK表達(dá)被顯著下調(diào),p-ERK被上調(diào),同時(shí)還降低了iNOS、TNF-α、IL-1β等炎性介質(zhì)。提示燈盞花素可通過抑制p38和JNK,上調(diào)p-ERK,減少NO含量,抑制TNF-α、IL-1β等炎性因子表達(dá),減少細(xì)胞凋亡數(shù)量,降低腦細(xì)胞炎性損傷,緩解神經(jīng)功能損傷。

5 促進(jìn)新生血管生成

研究發(fā)現(xiàn):內(nèi)皮細(xì)胞在缺血灌注損傷后,更早出現(xiàn)受損,引發(fā)一系列炎性反應(yīng)、血栓形成等效應(yīng),加速細(xì)胞的凋亡和死亡發(fā)展[19]。血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular endothelial cell,VECs)的損傷會(huì)導(dǎo)致各種內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙,促炎因子的釋放和氧自由基的生成[20]。缺血缺氧條件下,上游缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-inducible factor,HIFs)可被觸發(fā),從而激活下游血管生成中最有效的血管生成因子——血管內(nèi)皮生長因(Vascular endothelial growth factor,VEGFs)等一系列因子的表達(dá),啟動(dòng)生成新血管的過程,使細(xì)胞對損傷做出反應(yīng)[21]。VEGF在缺血性疾病損傷修復(fù)中起著重要作用,形成新的血管過程是通過增加微循環(huán)中的血管通透性,內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及遷移啟動(dòng)的。王震雨等[22]研究指出,用藥組與模型組大鼠腦組織VEGF蛋白表達(dá)比較明顯增高,說明燈盞花素減輕腦細(xì)胞損傷作用與促進(jìn)新生血管形成有關(guān)。血小板內(nèi)皮黏附因子-1(Platelet endothelial adhesion factor-1,PECAM-1)存在于各種細(xì)胞,包括內(nèi)皮細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等甚至某些亞基也會(huì)表達(dá)[23]。有研究發(fā)現(xiàn),PECAM-1可參與體內(nèi)外的新生血管形成[24],通過一些實(shí)驗(yàn)觀察到,PECAM-1表達(dá)缺陷的小鼠細(xì)胞在體外不能形成管樣結(jié)構(gòu);而過度表達(dá)PECAM-1可以形成管樣結(jié)構(gòu)。由此可見,PECAM-1是形成血管的重要標(biāo)志物。內(nèi)皮下基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)的降解是血管形成的最基本步驟[25]。因此,能激活降解ECM酶是血管生成的基礎(chǔ)。MMPs可以分解EMC,同時(shí)可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,應(yīng)用燈盞花素后在免疫印跡和RT-PCR技術(shù)檢測到PECAM-1的蛋白和mRNA的含量增加明顯;藥物處理后的內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-2的mRNA活性增加。以上研究表明,燈盞花素可能通過上調(diào)VEGF和PECAM-1表達(dá)及增加MMP2活性,改善腦缺血引發(fā)的血管內(nèi)皮功能障礙。

6 小結(jié)

燈盞花素在腦缺血防治中,已獲得一定的研究進(jìn)展。文中提到,燈盞花素在不同方面發(fā)揮腦保護(hù)作用,它降低MDA含量,提高SOD和GSH-Px表達(dá),以此降低氧化損傷程度。燈盞花素通過TLR4/NF-κB信號通路調(diào)節(jié)IL-6和TNF-α等炎癥因子;可通過增加ZO-1和Claudin-5,抑制MMP2和MMP9減輕對BBB破壞;通過抑制Bax、Caspase-3表達(dá),下調(diào)p38和JNK且上調(diào)p-ERK,減少細(xì)胞凋亡;還可通過增加VEGF和PECAM-1,改善血管內(nèi)皮損傷。但腦損傷機(jī)制十分復(fù)雜,其保護(hù)信號通路及各因子之間關(guān)系尚未完全被闡明,需要進(jìn)一步應(yīng)用各種模型和技術(shù)深入研究。