陸嘉欣 吳 旭 蔣永亮

低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是一種嚴(yán)重的進(jìn)展性綜合征,會(huì)使肺血管阻力上升甚至右心衰竭,最終導(dǎo)致死亡。目前其病理機(jī)制包括血管收縮、血管重構(gòu)、血栓形成和炎癥等關(guān)鍵因素。雖已有眾多研究針對(duì)HPH,但其病因仍未完全明確,闡明HPH的發(fā)病機(jī)制十分迫切和必要。

自噬可降解受損或不需要的細(xì)胞成分進(jìn)行自我更新,在特定環(huán)境下對(duì)宿主有保護(hù)功能,自噬-溶酶體途徑通過降解蛋白質(zhì)聚集體或受損的細(xì)胞器維持細(xì)胞生長調(diào)節(jié)等活動(dòng)以發(fā)揮促生存作用,但同時(shí)自噬功能受損也可轉(zhuǎn)變?yōu)榇偎劳鲆蛩?。隨著對(duì)自噬的深入探索,研究自噬在HPH的調(diào)控機(jī)制有望成為HPH治療靶點(diǎn)。

自噬過程涉及一系列分子事件,包括膜的啟動(dòng)、成核、延長和閉合。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)可直接參與調(diào)控自噬。自噬關(guān)鍵蛋白Atg6(autophagy 6/Beciln1)是自噬過程中一個(gè)重要調(diào)節(jié)因子,其作為Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)復(fù)合物的主要部分調(diào)節(jié)自噬小體形成。Ⅲ類PI3K復(fù)合物和Atg38與質(zhì)膜結(jié)合,催化磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3-磷酸,從而招募與磷脂酰肌醇3-磷酸結(jié)合的蛋白[1]。

一、細(xì)胞自噬通路

1.PI3K/Akt/mTOR通路：PI3K以二聚體形式存在,由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成。當(dāng)外部刺激因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞后,p85結(jié)構(gòu)改變使PI3K正式啟動(dòng),同時(shí)激活其下游信號(hào)分子蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至質(zhì)膜上成為p-Akt,p-Akt將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到mTOR,mTOR激活泛素蛋白酶體途徑并調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因或其他下游底物,以發(fā)揮抑制自噬的生理效應(yīng)。

2.FoxO1通路：轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白O1(forkhead box O1,FoxO1)通路可激活自噬。在應(yīng)激狀態(tài)下FoxO1與沉默信息調(diào)節(jié)因子1結(jié)合物分離后出現(xiàn)的形式為活化狀態(tài)的乙?；疐oxO1,此狀態(tài)下FoxO1在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與Atg7特異性結(jié)合激活細(xì)胞自噬[2]。而PI3K/Akt信號(hào)通路可使FoxO1磷酸化,磷酸化后FoxO1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì),失去調(diào)節(jié)其目標(biāo)基因的能力而抑制自噬。

3.BMPR2通路：骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2(bone morphogenetic protein receptor 2,BMPR2)拮抗劑noggin可減少腺泡細(xì)胞中空泡形成,下調(diào)微管相關(guān)蛋白1B-輕鏈3(microtubule-associated protein 1B light chain 3 beta,LC3B)水平,即BMPR2通路可促進(jìn)自噬發(fā)生[3]。但同時(shí)自噬的上調(diào)可加重缺氧誘導(dǎo)的BMPR2功能障礙,進(jìn)一步說明該通路與自噬存在相互影響甚至負(fù)反饋調(diào)節(jié)的潛在機(jī)制可能。自噬和BMPR2之間的聯(lián)系還可能存在于其他細(xì)胞信號(hào)通路中,因?yàn)樽允珊虰MPR2都參與β-catenin等信號(hào)通路。

4.MAPK信號(hào)通路：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-Jun氨基末端激酶 (c Jun N terminal kinase,JNK)、p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinases,p38 MAPK)是MAPK的主要通路,以上通路皆可調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬。JNK1正向調(diào)控自噬的機(jī)制如下：一方面,JNK1介導(dǎo)抗凋亡蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)磷酸化干擾其與Beclin1的結(jié)合,Beclin1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)自噬發(fā)生。另一方面,JNK1可增強(qiáng)損傷調(diào)節(jié)自噬調(diào)控基因(damage-regulated autophagy modulator,DRAM)的表達(dá),從而使DRAM刺激Beclin1釋放以誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[4]。馬乾等[5]在肺成纖維細(xì)胞中驗(yàn)證補(bǔ)腎益肺消癥方機(jī)制之一可能是抑制JNK/p62(sequestosome 1)/Parkin通路減緩細(xì)胞線粒體自噬進(jìn)程。ERK5可直接磷酸化unc-51樣激酶1(unc-51-like kinase 1,ULK1)來下調(diào)自噬,ERK5抑制自噬通量不依賴腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase,AMPK)和mTOR,而與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)激活有關(guān)。p38 MAPK在自噬中為雙向調(diào)節(jié)因子,血紅素加氧酶-1抑制劑通過激活p38 MAPK途徑誘導(dǎo)Beclin1非依賴性自噬,而p38 MAPK活化還可誘導(dǎo)ULK1磷酸化,其破壞ULK1-Atg13復(fù)合物導(dǎo)致自噬減弱,這一過程存在Atg5蛋白的干預(yù)[6]。以上證明p38 MAPK通路通過激活下游不同信號(hào)分子在自噬調(diào)控中具有雙重作用。

5.NF-κB通路：核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路與自噬之間的聯(lián)系非常復(fù)雜,其可經(jīng)多種途徑參與自噬活動(dòng)。死亡相關(guān)蛋白激酶1通過下游p38 MAPK/NF-κB途徑觸發(fā)炎性反應(yīng)和自噬,共同導(dǎo)致肺損傷。與之相反的是二氧化硅納米粒子通過p62/NF-κB途徑可引起肺組織中的自噬功能障礙,NF-κB抑制劑BAY11-7821可通過激活自噬抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞異常增殖[7,8]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),不同蛋白質(zhì)聚集應(yīng)激可經(jīng)非典型途徑激活NF-κB,誘導(dǎo)自噬過程[9]。以上提示NF-κB可通過多種途徑參與自噬發(fā)生,并雙向調(diào)節(jié)其功能。

二、自噬在低氧肺動(dòng)脈高壓中的作用

現(xiàn)有研究表明,自噬在肺血管細(xì)胞中的活動(dòng)對(duì)HPH發(fā)生、發(fā)展具有雙重調(diào)控機(jī)制。Lee 等[10]驗(yàn)證缺氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓(pulmonary hypertension,PH)的小鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCS)及內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary artery endothelial cells,PAECS)中LC3B、Beclin1表達(dá)增加,同時(shí)實(shí)驗(yàn)表明,血管細(xì)胞中活躍的LC3B可能部分抑制血管重塑的增殖過程,首次證實(shí)自噬對(duì)HPH調(diào)控具有雙面性。在HPH大鼠模型中,蓽茇酰胺治療后PASMCS和大鼠肺組織中LC3BⅡ/LC3BⅠ比值升高,蓽茇酰胺增加了PASMCS自噬通量,顯著抑制缺氧誘導(dǎo)的PASMCS增殖,提示自噬在肺血管重構(gòu)中起保護(hù)作用[11]。而葛根素通過抑制自噬減輕缺氧誘導(dǎo)的肺血管細(xì)胞周期進(jìn)展和增殖,其可逆轉(zhuǎn)缺氧引起的PASMCS進(jìn)入S期的增加,并使細(xì)胞停滯于G1期,提示自噬在肺血管重構(gòu)中可為推動(dòng)因素[12]。這意味著自噬在HPH中存在完全相反作用,明確自噬相關(guān)通路在HPH中作用可為其治療提供未來新方向。

1.mTOR、NF-κB通路雙向調(diào)節(jié)低氧性肺動(dòng)脈高壓形成：mTOR復(fù)合物1(mTORC1)和 mTOR 復(fù)合物 2(mTORC2)為mTOR兩類不同的蛋白激酶復(fù)合物。低氧條件下可激活二者,mTORC1抑制對(duì)營養(yǎng)敏感的自噬,而mTORC2可能對(duì)分子伴侶介導(dǎo)的自噬存在特異性,二者通過抑制自噬調(diào)控血管生成和細(xì)胞增殖：在缺氧條件下mTORC1具有早期激活和晚期抑制細(xì)胞增殖作用,而mTORC2則為延遲和維持的激活細(xì)胞增殖作用。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抑制mTORC1可減輕PH,而抑制mTORC2可引起自發(fā)性PH,使用mTOR抑制劑和血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB)受體抑制劑可顯著延緩HPH[13]。這可能與mTORC1主要調(diào)控與肺血管重構(gòu)關(guān)系緊密的巨自噬,而mTORC2則主要影響細(xì)胞存活和細(xì)胞骨架重塑,抑制mTORC2通路激活自噬更易受其他因素干擾影響其對(duì)肺血管細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)。Yes相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)可降低自身核定位,從而下調(diào)PI3K表達(dá),抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的Akt磷酸化激活自噬,改善肺血管重構(gòu)和右心室肥大。某些藥物如槲皮素、白藜蘆醇均可在HPH大鼠模型中干擾PI3K活性,通過下調(diào)PI3K/Akt/mTOR通路增強(qiáng)自噬,抑制PASMCS增殖[14]。這些研究表明,自噬激活可發(fā)揮抗增殖效果,自噬誘導(dǎo)劑對(duì)防止肺血管重構(gòu)有潛在作用。

而與之結(jié)論相反的是,Li等[15]發(fā)現(xiàn)Galectin-3蛋白可通過抑制瞬時(shí)受體電位通道(transient receptor potential canonical TRPC)1/4途徑和激活A(yù)kt/mTOR通路,抑制自噬最終抑制PAECS的增殖。愛帕琳肽通過激活mTOR通路抑制缺氧誘導(dǎo)的自噬來緩解大鼠PASMCS增殖和遷移,17β-雌二醇可上調(diào)愛帕琳肽來減輕PH誘導(dǎo)的右心室衰竭[16]。達(dá)可替尼通過mTOR通路抑制缺氧誘導(dǎo)的PASMCS細(xì)胞周期進(jìn)程、增殖、遷移和自噬,減弱PASMCS從G0/G1期進(jìn)入S期的進(jìn)程,抑制肺動(dòng)脈血管重構(gòu)[17]。目前達(dá)可替尼對(duì)HPH的治療仍處于臨床試驗(yàn)階段。

以上研究表明,mTOR通路可雙向調(diào)控HPH的形成,這意味兩個(gè)mTOR復(fù)合體的信號(hào)不僅在肺血管細(xì)胞對(duì)缺氧的反應(yīng)中存在協(xié)同機(jī)制,還可能受其他因素影響。以mTOR抑制劑或mTOR激活劑為基藥的聯(lián)合治療可能提供基于重要通路機(jī)制的治療HPH新方向。

NF-κB在HPH中也是調(diào)控肺血管重構(gòu)的重要原因,該通路可誘導(dǎo)自噬激活,進(jìn)而下調(diào)Rho家族GTP酶3表達(dá),促進(jìn)HPH發(fā)展。同時(shí)低氧誘導(dǎo)NF-κB激活后上調(diào)PASMCS中細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞周期G1向S期轉(zhuǎn)變,從而促進(jìn)PASMCS增殖。激活A(yù)MPK可抑制NF-κB的p65亞基從胞質(zhì)到胞核的移位,降低PH中自噬標(biāo)志物蛋白水平。AMPK激動(dòng)劑二甲雙胍抑制NF-κB介導(dǎo)的自噬激活,從而降低野百合堿(monocrotaline,MCT)誘導(dǎo)的PH的右心室收縮壓,首次揭示二甲雙胍抑制自噬和逆轉(zhuǎn)肺血管重塑的新機(jī)制[18]。而缺氧后PAECS中NF-κB表達(dá)增加,給予NF-κB抑制劑后缺氧誘導(dǎo)的Galectin-3蛋白下調(diào),而Galectin-3下調(diào)可增加LC3B表達(dá),上調(diào) TRPC1/4和鈣蛋白酶的信使RNA和蛋白水平從而促進(jìn)自噬,提示NF-κB可抑制自噬以促進(jìn)HPH發(fā)生[19]。同時(shí)NF-κB受體激動(dòng)劑可抑制PASMCS Atg5/Atg7/Beclin1/LC3依賴的自噬途徑,從而減輕肺血管重構(gòu)和功能障礙,提示該通路可抑制自噬以達(dá)到緩解HPH[20]。這表明NF-κB不僅可雙向調(diào)節(jié)自噬,還對(duì)肺動(dòng)脈血管細(xì)胞增殖具有雙面調(diào)控機(jī)制,其涉及的下游信號(hào)通路仍需進(jìn)一步探究。

2.低氧條件下抑制低氧性肺動(dòng)脈高壓形成的自噬相關(guān)通路：FoxO1通路由FoxO1誘導(dǎo)recombinant sestrin 3 (SESN3)蛋白表達(dá)上調(diào)形成FoxO1-SENS3-mTOR,該通路使下游mTOR被抑制而自噬激活,最終減弱PASMCS增殖從而延緩HPH。吡非尼酮目前已用于特發(fā)性肺纖維化治療,研究證實(shí)在缺氧大鼠模型中,吡非尼酮?jiǎng)┝恳蕾嚨卦黾覨oxO1水平及其核轉(zhuǎn)位,從而減弱PASMCS增殖和遷移能力,這意味著已投入臨床使用的吡非尼酮有望以抑制FoxO1為靶點(diǎn)機(jī)制激活自噬抑制HPH的形成,實(shí)現(xiàn)老藥新用這一擴(kuò)展用藥[21]。而在MCT誘導(dǎo)大鼠PH模型中胞質(zhì)內(nèi)FoxO1升高可刺激自噬激活,紫杉醇通過抑制FoxO1介導(dǎo)的自噬,最終降低PH,提示FoxO1介導(dǎo)的自噬可促進(jìn)肺血管重塑[22]。這也表明在非低氧誘導(dǎo)的PH動(dòng)物模型下,FoxO1通路激活自噬后可能對(duì)肺血管重構(gòu)產(chǎn)生相反作用。

BMPR2突變及介導(dǎo)信號(hào)的紊亂是HPH易感因素之一。SIN3轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白家族成員A過表達(dá)后可阻斷BMPR2啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化上調(diào)BMPR2表達(dá),最終抑制PASMCS增殖[23]。PAECS中上調(diào)BMPR2可逆轉(zhuǎn)低氧誘導(dǎo)的大鼠PH[24]。內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial to mesenchymal transition,ENDMT)被認(rèn)為是肺動(dòng)脈重構(gòu)重要因素,而BMPR2可抑制ENDMT。Liu等[25]在人PAECS證明miRNA-204下調(diào)后促進(jìn)自噬以減弱缺氧誘導(dǎo)的ENDMT,其中BMPR2表達(dá)上調(diào),在一定程度上改善HPH,以上提示BMPR2通路或可通過抑制ENDMT促進(jìn)自噬以抑制肺動(dòng)脈血管重構(gòu)。低氧促有絲分裂因子誘導(dǎo)的PH中,高遷移率族蛋白-1信號(hào)下調(diào)BMPR2以抑制自噬,協(xié)同增強(qiáng)肺血管細(xì)胞增殖,同時(shí)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證低氧抑制的FoxO1可能是自噬和BMPR2下調(diào)之間聯(lián)系的一種機(jī)制,FoxO1、BMPR2這兩條通路可能通過某一共同靶點(diǎn)激活自噬,從而對(duì)HPH形成起抑制作用[26]。

3.低氧條件下促進(jìn)低氧性肺動(dòng)脈高壓形成的自噬相關(guān)通路：JNK通路除可使Beclin1游離后形成PI3K復(fù)合物促進(jìn)自噬,還能介導(dǎo)自噬研究相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)激活自噬。JNK可作為Toll樣受體-9下游效應(yīng)分子參與調(diào)控缺氧時(shí)PASMCS增殖,使用JNK抑制劑可減少其磷酸化,降低該細(xì)胞增殖水平[27]。缺氧通過激活ERK、JNK和p38信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制PASMCS凋亡,進(jìn)而誘導(dǎo)肺血管重構(gòu)。Guo等[28]實(shí)驗(yàn)證明,在體內(nèi)沉默recombinant notch homolog4(Notch4)重組蛋白可通過Notch4-ERK/JNK/p38MAPK軸部分抑制HPH大鼠的肺血管重構(gòu)。因此,JNK相關(guān)抑制劑有望成為抑制PASMCS增殖的藥物之一。

p38 MAPK通路一方面可導(dǎo)致自噬激活,這是由于其可誘發(fā)內(nèi)皮屏障功能障礙并可能破壞緊密連接。該通路激活同時(shí)使調(diào)節(jié)血管通透性的重要屏障蛋白下調(diào),最終導(dǎo)致肺血管病變和重塑。黃芩苷可通過下調(diào)p38 MAPK/基質(zhì)金屬蛋白酶9通路來減輕慢性缺氧引起的PH[29]。另一方面,p38 MAPK通路可抑制自噬發(fā)生,如骨橋蛋白通過此信號(hào)通路抑制PASMCS自噬,促進(jìn)HPH形成[30]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)人抵抗素樣分子β可通過Ca2+內(nèi)流激活MAPK通路,抑制自噬進(jìn)而誘導(dǎo)PASMCS增殖,提示鈣離子通道與自噬通路相關(guān)性[31]。與激活mTOR通路抑制自噬不同的是,p38 MAPK通路在肺血管細(xì)胞自噬過程中呈雙面性,其通過不同下游靶點(diǎn)抑制/激活自噬,皆可在PASMCS細(xì)胞增殖調(diào)控中起促進(jìn)作用,這或許使p38 MAPK抑制劑成為治療HPH的前景靶向藥物成為可能。

ERK1/2通路活化能夠直接促進(jìn)LC3表達(dá)上調(diào),自噬通量增加。ERK1/2抑制劑可減弱鈣蛋白酶-2的磷酸化從而減輕PASMCS增殖。醛脫氫酶2對(duì)PASMCS和HPH遷移和增殖具有保護(hù)作用,或是通過阻斷ERK1/2-Beclin1通路以抑制自噬來實(shí)現(xiàn)[32]。miRNA-205-5p可通過傳導(dǎo)細(xì)胞骨架調(diào)控蛋白(microtubule associated monoxygenase,calponin and LIM domain containing 2,MICAL2)促進(jìn)PASMCs增殖,ERK1/2抑制劑阻斷MICAL2介導(dǎo)的對(duì)PASMCS增殖的促進(jìn)作用。因此抑制ERK1/2可作為HPH治療的理想治療靶點(diǎn)。

ERK5屬于MAPK信號(hào)家族,可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞存活等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。過表達(dá)ERK5可導(dǎo)致p62蛋白表達(dá)水平增加,LC3Ⅱ、Beclin1表達(dá)水平降低,細(xì)胞自噬受到抑制[33]。既往研究發(fā)現(xiàn),ERK5抑制劑可緩解博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化的作用。ERK5蛋白激酶協(xié)調(diào)激活信號(hào),導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子如白介素1β、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1、單核細(xì)胞趨化蛋白-1的增加,抑制自噬從而觸發(fā)右心室肥大過程。

上述研究證實(shí)自噬在HPH中的兩面性,這些相互矛盾的結(jié)果也可能是由于實(shí)驗(yàn)條件的差異,如治療時(shí)間和氧氣水平、LC3B自噬通量增加的具體含義。在所有PH模型中,與真實(shí)人類PH發(fā)展相關(guān)的組織病理學(xué)改變、肺壓力和右心功能之間也可能存在不同。這些復(fù)雜因素也可能影響自噬在HPH中的具體作用,針對(duì)自噬與HPH之間的作用仍有待于進(jìn)一步深入研究。目前為止,自噬調(diào)節(jié)療法的應(yīng)用大多局限于實(shí)驗(yàn)階段,只有少數(shù)能調(diào)節(jié)自噬的化合物被用于臨床,自噬激活劑如mTOR抑制劑雷帕霉素和自噬抑制劑如氯喹等,未來需要更多的研究提供新的實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。

三、展 望

近年來,臨床工作中發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病患者繼發(fā)HPH者逐年上升,特別是多見于老年患者。如何快速有效地診斷和干預(yù)HPH這一相關(guān)疾病,給臨床工作提出了新的要求和挑戰(zhàn)。越來越多的研究表明,HPH與自噬密不可分,但是具體關(guān)系及相關(guān)機(jī)制尚未完全明確,期待今后開展更多的相關(guān)研究進(jìn)一步明確兩者關(guān)系及發(fā)病機(jī)制,為更好地診斷和治療HPH提供新的方向和思路。