阮文輝,葉松華,馮夏珍,吳哲,薛潤(rùn)苗,羅晉萍,許信學(xué),王曉燕*

(1.山西省藥品審評(píng)中心(山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院),山西 太原 030006;2.山西省藥品檢查中心,山西 太原 030031;3.山西省食品藥品檢驗(yàn)所,山西 太原 030031;4.山西華康藥業(yè)股份有限責(zé)任公司,山西 運(yùn)城 044000)

黃柏為蕓香科植物黃皮樹(PhellodendronchinenseSchneid.)的干燥樹皮,習(xí)稱“川黃柏”,性苦,寒,歸腎、膀胱經(jīng),清熱燥濕,瀉火除蒸,解毒療瘡[1-3],主產(chǎn)地主要有四川、貴州、湖北、云南,以四川、貴州產(chǎn)量最大[4],現(xiàn)行《中華人民共和國(guó)藥典》(2020版)收載黃柏、鹽黃柏和黃柏炭,未收載酒黃柏,也無(wú)薄層色譜鑒別標(biāo)準(zhǔn)。但酒黃柏在我國(guó)應(yīng)用廣泛,歷史悠久[5-7]。黃柏的酒制初載于唐代《銀海精微》[8],謂之:“酒柏”。清代《本草從新》[9]曰“生用降實(shí)火,炒黑止崩帶,酒制治上,蜜制治中,鹽制治下”。在常用方劑中生品多用于清熱劑,如“黃柏丸”(清腸止痢)[10]、“黃連解毒湯”(瀉火解毒)[11];酒制多用于清上焦熱,如“還睛丸”(清熱散風(fēng)明目)[12]、“清上瀉火湯”(清虛熱散頭風(fēng))[13]。

薄層色譜鑒別一直是中藥材真?zhèn)慰焖勹b別的常用方法,具有設(shè)備要求低、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)速度快,效率高、適用性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)在中藥材快速鑒別中得到廣泛應(yīng)用[14-17]?，F(xiàn)有的黃柏、酒黃柏薄層鑒別方法如表1所示,本課題組多次嘗試采用《中國(guó)藥典》(2020年版)中所載方法進(jìn)行黃柏和酒黃柏的薄層色譜鑒別,發(fā)現(xiàn)操作繁瑣,重復(fù)性較差,對(duì)實(shí)驗(yàn)試劑質(zhì)量和人員操作要求較高,加大了黃柏和酒黃柏快速鑒別的難度。本文嘗試對(duì)現(xiàn)行黃柏薄層色譜鑒別方法進(jìn)行研究與改進(jìn),以期獲得操作較為簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的薄層色譜鑒別方法,用于黃柏、酒黃柏飲片的質(zhì)量控制。

表1 文獻(xiàn)報(bào)道黃柏、酒黃柏薄層鑒別方法

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

本實(shí)驗(yàn)所用十五批黃柏藥材和三批關(guān)黃柏購(gòu)自河北安國(guó),經(jīng)山西省藥檢所羅晉萍主任藥師鑒定分別為木蘭科植物黃皮樹(PhellodendronchinenseSchneid.)的干燥樹皮和蕓香科植物黃檗(PhellodendronamurenseRupr.)的干燥樹皮,信息見(jiàn)表2。

表2 黃柏飲片來(lái)源及制備

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

XSR-205DU/AC型電子天平(瑞士METTLER);SB25-12DTD型超聲波清洗器(寧波新芝);CBIO21多功能暗箱式紫外分析儀(北京賽百奧);CY型滾筒式炒藥機(jī)(南京騰陽(yáng));雙槽層析缸(上海壘固)。硅膠G板(批號(hào):020190411,煙臺(tái)江友);硅膠GF254板(批號(hào):20061021,青島海洋);微量毛細(xì)管(1 μL,批號(hào):889892;3 μL,批號(hào):895254,德國(guó),HIRSCHMANN)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào):110713-202015,中國(guó)食品藥品檢定研究院);鹽酸黃柏堿對(duì)照品(批號(hào):111895-201805,中國(guó)食品藥品檢定研究院);黃柏對(duì)照藥材(批號(hào):121510-201807,中國(guó)食品藥品檢定研究院);冀州黃酒(批號(hào):20200806),石家莊欒城黃酒廠;甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氨水(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);三氯甲烷、甲苯、異丙醇(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃柏炮制

文獻(xiàn)報(bào)道黃柏炮制方法多樣[18-21],本文參照國(guó)家及多省份中藥材炮制標(biāo)準(zhǔn)、中藥飲片廠通行酒黃柏炮制規(guī)范并采信老藥工的數(shù)十年酒黃柏炮制經(jīng)驗(yàn),采用以下酒黃柏炮制方法:取黃柏絲100 kg,加黃酒10 kg拌勻,置罐或適宜的容器內(nèi)悶潤(rùn)60 min至酒盡,取出,炒干(品溫150～170 ℃),偶有焦斑,即得。

1.2.2 樣品溶液的制備及檢視

取藥材粉末 0.1 g,加甲醇5 mL,超聲提取(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,濾過(guò),濾液用甲醇補(bǔ)足5 mL,作為供試品溶液。另取黃柏對(duì)照藥材0.1 g,同法制成對(duì)照藥材溶液。再另取鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿對(duì)照品,加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液,用毛細(xì)管點(diǎn)樣1～9 μL,展開(kāi)、取出、晾干,置紫外燈(365 nm)下檢視。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層色譜鑒別條件考察

2.1.1 薄層色譜鑒別提取溶劑考察

本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶劑分別為甲醇、乙醇、乙酸乙酯對(duì)酒黃柏1的提取效果的比較,見(jiàn)圖1。甲醇提取液熒光點(diǎn)的大小和強(qiáng)度最高,熒光點(diǎn)均勻且聚集,明顯高于乙醇和乙酸乙酯,甲醇作為提取溶劑利于提升檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度。

供試品溶液:1.甲醇;2.乙醇;3.乙酸乙酯;4.鹽酸黃柏堿對(duì)照品;5.鹽酸小檗堿對(duì)照品;點(diǎn)樣量:3 μL

2.1.2 薄層色譜鑒別展開(kāi)系統(tǒng)考察

實(shí)驗(yàn)對(duì)四種展開(kāi)體系進(jìn)行了考察,結(jié)果顯示,展開(kāi)劑Ⅳ:乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-氨水-三乙胺(V乙酸乙酯∶V甲醇∶V三氯甲烷∶V氨水∶V三乙胺=6∶2∶2∶1∶1)的熒光點(diǎn)集中清晰、不易漂移,且檢測(cè)精度較高,重復(fù)性較好。除出現(xiàn)了小檗堿的亮黃色熒光,還出現(xiàn)了藍(lán)色熒光和綠色熒光,見(jiàn)圖2。初步估計(jì)薄層色譜圖中綠色熒光點(diǎn)為黃柏酮類物質(zhì),藍(lán)色熒光點(diǎn)為木蘭花堿類物質(zhì)的熒光所致,有待后續(xù)研究。

展開(kāi)劑I:V(甲苯)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(異丙醇)∶V(水)=6∶3∶2∶1.5∶0.3;展開(kāi)劑II:V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=30∶15∶4;展開(kāi)劑III:V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(三氯甲烷)∶V(氨水)∶V(三乙胺)=6∶2∶2∶1∶1;供試品溶液:1.黃柏1;2.酒黃柏1;3.酒黃柏7;4.酒黃柏13;5.黃柏對(duì)照藥材;6.小檗堿對(duì)照品

2.1.3 薄層色譜鑒別提取方法考察

考察了回流和超聲兩種方法。超聲和回流提取效果無(wú)明顯差異,而且采用超聲提取法黃柏藥材中的標(biāo)志性物質(zhì)小檗堿(C20H18NO4)的提取率更高,所以后續(xù)試驗(yàn)優(yōu)選超聲提取法進(jìn)行樣品溶液的制備。

2.1.4 薄層色譜鑒別展距考察

實(shí)驗(yàn)考察了不同展距對(duì)展開(kāi)效果的影響。結(jié)果顯示展距為7 cm時(shí)效果較好,拖尾現(xiàn)象少,隨著層析時(shí)間的延長(zhǎng),展距的加大,耗時(shí)、費(fèi)板且溶劑前沿和熒光點(diǎn)容易產(chǎn)生漂移,對(duì)薄層板的加工要求和硅膠顆粒均勻度要求變高。

2.1.5 薄層色譜鑒別點(diǎn)樣量考察

點(diǎn)樣量1～2 μL時(shí),熒光點(diǎn)集中,邊界清晰,拖尾少,能夠達(dá)到薄層色譜鑒別的要求。

2.2 薄層色譜鑒別專屬性考察

本方法的專屬性進(jìn)行考察見(jiàn)圖3。

供試品溶液:1.黃柏1;2.酒黃柏1;3.黃柏對(duì)照藥材;4. 鹽酸黃柏堿對(duì)照品;5.鹽酸小檗堿對(duì)照品;點(diǎn)樣量:3 μL

鹽酸小檗堿有熒光斑點(diǎn),黃柏對(duì)照藥材、黃柏、酒黃柏飲片在與鹽酸小檗堿對(duì)照品相同的位置有相同的熒光斑點(diǎn),鹽酸黃柏堿無(wú)熒光斑點(diǎn),且無(wú)其他干擾斑點(diǎn)。表明該方法專屬性良好。

2.3 薄層色譜鑒別耐用性考察

對(duì)不同廠家生產(chǎn)的高效薄層板和普通薄層板進(jìn)行考察發(fā)現(xiàn),樣品在普通板和高效板上均可獲得很好的分離,熒光點(diǎn)集中,且邊界清晰,而高效板的效果更優(yōu),更利于后續(xù)的薄層掃描定量。在溫度對(duì)薄層鑒別影響的考察中發(fā)現(xiàn)4和21 ℃條件下,小檗堿熒光點(diǎn)大小穩(wěn)定,相對(duì)集中,邊界清晰且展距相當(dāng),在40 ℃條件下,展距有所增長(zhǎng),但影響較小,熒光點(diǎn)有較明顯變化,熒光點(diǎn)面積約為4 ℃時(shí)的兩倍,但邊界清晰,對(duì)黃柏和酒黃柏的薄層色譜鑒別未產(chǎn)生影響。

2.4 樣品的薄層色譜檢測(cè)

2.4.1 用《中國(guó)藥典》方法鑒別十五批黃柏飲片

按2020年版《中國(guó)藥典》薄層色譜方法進(jìn)行十五批黃柏飲片薄層鑒別,經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)才得到較清晰的圖譜,見(jiàn)圖4。供試品色譜中,在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的斑點(diǎn)。但斑點(diǎn)有明顯的漂移,顯色不清晰,較分散。

提取溶劑:1%醋酸-甲醇溶液;提取方法:超聲處理;硅膠G板:煙臺(tái)市江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司;展開(kāi)劑:V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=30∶15∶4;展距:10 cm;供試品溶液:1～15:黃柏1～15;16.黃柏對(duì)照藥材;17.黃柏堿對(duì)照品;18.小檗堿對(duì)照品;點(diǎn)樣量:3 μL;檢視:稀碘化鉍鉀噴涂顯色

2.4.2 薄層鑒別十五批黃柏飲片

按本文方法層析、晾干、檢視,結(jié)果見(jiàn)圖5,在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的亮黃色熒光斑點(diǎn),斑點(diǎn)集中、均勻,邊界清晰,溶劑前沿和熒光點(diǎn)無(wú)明顯漂移。

供試品溶液:1～15.黃柏1～15;16.黃柏對(duì)照藥材;17. 小檗堿對(duì)照品;18.黃柏堿對(duì)照品

2.4.3 薄層鑒別十五批酒黃柏飲片

同法試驗(yàn)、檢視,圖6顯示在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上,顯相同顏色的亮黃色熒光斑點(diǎn),斑點(diǎn)集中、均勻,邊界清晰,溶劑前沿和熒光點(diǎn)無(wú)明顯漂移。

供試品溶液:1～15:酒黃柏1～15;16. 小檗堿對(duì)照品;17. 黃柏對(duì)照藥材;18.黃柏堿對(duì)照品

2.4.4 薄層鑒別黃柏與關(guān)黃柏

同法對(duì)關(guān)黃柏和黃柏進(jìn)行試驗(yàn)、檢視。結(jié)果如圖7所示,關(guān)黃柏薄層色譜圖為上下兩個(gè)亮黃色熒光點(diǎn),上面的亮黃色熒光點(diǎn)為小檗堿,下面的亮黃色熒光點(diǎn)極有可能為巴馬丁,有待后續(xù)研究,本薄層色譜鑒別方法可以快速鑒別黃柏與關(guān)黃柏。

供試品溶液:1.黃柏1;2.黃柏對(duì)照藥材;3～5.關(guān)黃柏1～3;6.小檗堿對(duì)照品

3 結(jié)論與討論

針對(duì)《中國(guó)藥典》(2020版)收載的黃柏藥材鑒別方法,本方法進(jìn)行了如下改進(jìn):1)樣品粉末取樣量由0.2 g減少至0.1 g,本方法精度增加;2)提取溶劑由1%醋酸-甲醇溶液變更為甲醇,用量由40 mL減少為5 mL,溶劑用量大幅減少,且省去溶劑配置環(huán)節(jié);3)《中國(guó)藥典》(2020版)收載黃柏藥材鑒別方法以三氯甲烷-甲醇-水(V三氯甲烷∶V甲醇∶V水=30∶15∶4)的下層溶液為展開(kāi)劑,置氨蒸汽飽和的展開(kāi)缸內(nèi),展開(kāi),步驟復(fù)雜而且斑點(diǎn)極易漂移,造成檢視判斷困難。改進(jìn)后本方法展開(kāi)劑為乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-氨水-三乙胺(V乙酸乙酯∶V甲醇∶V三氯甲烷∶V氨水∶V三乙胺=6∶2∶2∶1∶1),不需要分層展開(kāi)劑,展開(kāi)劑現(xiàn)用現(xiàn)配,斑點(diǎn)集中、邊界清晰、穩(wěn)定無(wú)漂移;4)《中國(guó)藥典》(2020版)收載方法操作時(shí)需要將薄層板置氨蒸汽中飽和的展開(kāi)劑中展開(kāi),展開(kāi)結(jié)束后需噴以稀碘化鉍鉀試液顯色后檢視,操作復(fù)雜,本方法置展開(kāi)劑中展開(kāi)結(jié)束后,直接在365 nm下檢視,方便直觀;5)本方法還可作為黃柏與關(guān)黃柏的快速薄層色譜鑒別之用,斑點(diǎn)分離清晰穩(wěn)定。