溫潔 高穎穎

糖尿病腎病是糖尿病中最常見的微血管并發(fā)癥,也是終末期腎病的主要原因[1]。腎小球是糖尿病腎臟損傷的主要部位,進(jìn)行性糖尿病腎病導(dǎo)致腎小球高濾過以及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和組成改變,進(jìn)而導(dǎo)致系膜基質(zhì)擴(kuò)張和腎小球基底膜厚度增加,從而減少腎小球?yàn)V過表面積[2]。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的一個重要組成部分,高糖條件下腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙是引起糖尿病腎病的關(guān)鍵因素[3]。因此減輕高糖條件下腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷可作為治療糖尿病腎病的一個有潛力的方法。銀杏素是從銀杏葉中提取的一種常見的天然無毒雙黃酮物質(zhì),已被證實(shí)具有多種生物功能,如抗癌、抗肥胖、抗炎、氧化應(yīng)激和神經(jīng)保護(hù)的功效[4]。Zhang等[5]研究發(fā)現(xiàn)銀杏素可通過抑制體內(nèi)炎性反應(yīng),腎損傷以及腎小管凋亡減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷。另外,已有研究發(fā)現(xiàn)銀杏素可通過抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖和氧化應(yīng)激,減少細(xì)胞外基質(zhì)沉淀,并通過激活A(yù)MPk/mTOR介導(dǎo)的自噬途徑減輕腎小球系膜細(xì)胞功能障礙而緩解糖尿病腎病的進(jìn)展,提示其可作為一種有前途的糖尿病腎病治療劑[6]。焦亡是一種半胱天冬酶-1(caspase-1)依賴的程序性細(xì)胞死亡,由炎癥小體啟動[7]。核轉(zhuǎn)錄因子кB/Nod樣受體蛋白3/半胱天冬酶-1(NF-κB/NLRP3/Caspase-1)信號通路在焦亡過程中起重要作用,NF-κB通過誘導(dǎo)NLRP3表達(dá)來引發(fā)炎癥小體的激活[8]?；罨腘LRP3誘導(dǎo)caspase-1裂解為活化的caspase-1,進(jìn)而驅(qū)動促炎細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的產(chǎn)生,然后誘發(fā)焦亡[9]。Duan等[10]也發(fā)現(xiàn)Swietenine可抑制NF-κB/NLRP3/ caspase-1信號通路介導(dǎo)的焦亡減輕糖尿病腎病小鼠炎癥和氧化應(yīng)激,從而改善糖尿病腎病,提示NF-κB/NLRP3/ caspase-1信號通路參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。在高糖條件模擬糖尿病腎病體外環(huán)境,觀察銀杏素減輕腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷和焦亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(HRGECs)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。銀杏素(CFN90173)購自武漢中標(biāo)科技有限公司;NF-κB抑制劑BAY 11-7085(HY-10257)、NLRP3抑制劑(HY-12815)、Caspase-1抑制劑VX-765(HY-13205)購自MCE公司;FAM FLICATMCaspase-1 Kit(ICT098)購自Bio-Rad公司;抗體NF-κB p65(ab16502)、Caspase-1(ab207802)、GSDMD(ab209845)、NLRP3(ab263899)、GAPDH(ab8245)、HRP偶聯(lián)的二抗(ab6721)購自英國abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將HRGECs細(xì)胞生長在含10%胎牛血清和1%雙抗的內(nèi)皮生長培養(yǎng)基中,在37℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),傳3代后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將傳代后的細(xì)胞分為正常組(正常5 mmol/L葡萄糖)、高糖組[11](30 mmol/L葡萄糖)、銀杏素低劑量組[6](30 mmol/L葡萄糖+5 μmol/L銀杏素)、銀杏素中劑量組(30 mmol/L葡萄糖+10 μmol/L銀杏素)、銀杏素高劑量組(30 mmol/L葡萄糖+20 μmol/L銀杏素)、BAY組[12](30 mmol/L葡萄糖+20 μmol/L銀杏素+2.5 μmol/L NF-κB的特異性抑制劑BAY 11-7085(BAY))、MCC950組[13](30 mmol/L葡萄糖+20 μmol/L銀杏素+10 μmol/L NLRP3抑制劑MCC950)、VX-765組[12](30 mmol/L葡萄糖+20 μmol/L銀杏素+20 μmol/L Caspase-1抑制劑VX-765),8組細(xì)胞加入相應(yīng)試劑后共培養(yǎng)24 h。

1.3 MTT法檢測細(xì)胞存活率 將HRGECs細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種到96孔細(xì)胞板培養(yǎng)24 h后,加入8組細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后,向每個孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),并繼續(xù)孵育4 h。然后除去培養(yǎng)基,向每個孔中加入150 μl DMSO以充分溶解紫色結(jié)晶,使用酶標(biāo)儀記錄490 nm波長下的吸光度值(OD值),計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞焦亡情況 收集8組細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞后,根據(jù)試劑盒說明書,加入5 μl Caspase-1-FLICA避光孵育1 h,然后加入5 μl PI染液避光孵育15 min,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞焦亡。

1.5 試劑盒法測定細(xì)胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平 通過ELISA試劑盒檢測細(xì)胞上清IL-1β、IL-18水平,使用LDH試劑盒檢測LDH釋放水平,所有具體操作步驟嚴(yán)格按照各自試劑盒進(jìn)行。

1.6 qRT-PCR法檢測細(xì)胞NF-κB、NLRP3、Caspase-1 mRNA的表達(dá) 收集8組細(xì)胞,加入TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA,檢測總RNA濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。GAPDH為內(nèi)參基因,PCR條件為:95℃ 30 s, 95℃ 5 s,60℃ 30 s共40個循環(huán)。最后,采用2-ΔΔCt法分析NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1基因相對表達(dá)水平。見表1。

1.7 Western blot檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)情況 收集8組細(xì)胞,用PBS洗滌3次后加入RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白,使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)上樣后由10%SDS-PAGE凝膠電泳分離,隨后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶封閉2 h后加入一抗p-NF-κB p65、NF-κB p65、Cleaved caspase-1、Caspase-1、GSDMD、NLRP3和GAPDH在4℃下孵育過夜,隨后,將膜與二抗在室溫下孵育1 h,加入ECL試劑顯影, Image J軟件量化蛋白條帶。

2 結(jié)果

2.1 銀杏素對高糖誘導(dǎo)的HRGECs細(xì)胞存活率的影響 與正常組比較,高糖組細(xì)胞存活率明顯下降(P<0.05);與高糖組比較,銀杏素低、中、高劑量組細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.05);與銀杏素高劑量組比較,BAY組、MCC950組、VX-765組細(xì)胞存活率進(jìn)一步升高(P<0.05)。見表2。

表2 銀杏素對高糖誘導(dǎo)的HRGECs細(xì)胞存活率的影響 n=6,%,

2.2 銀杏素對高糖誘導(dǎo)的HRGECs細(xì)胞焦亡的影響 與正常組比較,高糖組細(xì)胞PI+ Caspase-1陽性細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05);與高糖組比較,銀杏素低、中、高劑量組細(xì)胞PI+ Caspase-1陽性細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05);與銀杏素高劑量組比較,BAY組、MCC950組、VX-765組細(xì)胞PI+ Caspase-1陽性細(xì)胞比例進(jìn)一步降低(P<0.05)。見表3,圖1。

圖1 銀杏素對高糖誘導(dǎo)的HRGECs細(xì)胞焦亡的影響

表3 銀杏素對高糖誘導(dǎo)的HRGECs細(xì)胞焦亡的影響

2.3 銀杏素對高糖誘導(dǎo)的HRGECs細(xì)胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平的影響 與正常組比較,高糖組細(xì)胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平明顯升高(P<0.05);與高糖組比較,銀杏素低、中、高劑量組細(xì)胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與銀杏素高劑量組比較,BAY組、MCC950組、VX-765組細(xì)胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平進(jìn)一步降低(P<0.05)。見表4。

表4 銀杏素對高糖誘導(dǎo)的HRGECs細(xì)胞上清IL-1β、IL-18、LDH水平的影響

2.4 銀杏素對高糖誘導(dǎo)的HRGECs細(xì)胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 mRNA的表達(dá)影響 與正常組比較,高糖組細(xì)胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與高糖組比較,銀杏素低、中、高劑量組細(xì)胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 mRNA表達(dá)水平明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與銀杏素高劑量組比較,BAY組、MCC950組和VX-765組細(xì)胞Caspase-1 mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 銀杏素對高糖誘導(dǎo)的HRGECs細(xì)胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 mRNA的表達(dá)影響

2.5 銀杏素對高糖誘導(dǎo)的HRGECs細(xì)胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)影響 與正常組比較,高糖組細(xì)胞p-NF-κB p65、NLRP3、Cleaved caspase-1、 GSDMD蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05);與高糖組比較,銀杏素低、中、高劑量組細(xì)胞p-NF-κB p65、NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05);與銀杏素高劑量組比較,BAY組細(xì)胞p-NF-κB p65、NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低(P<0.05),MCC950組細(xì)胞NLRP3、Cleaved caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低(P<0.05),VX-765組細(xì)胞Cleaved caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低(P<0.05)。見圖2,表6。

圖2 銀杏素對高糖誘導(dǎo)的HRGECs細(xì)胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)

表6 銀杏素對高糖誘導(dǎo)的HRGECs細(xì)胞NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)影響

3 討論

腎小球內(nèi)皮細(xì)胞位于腎小球毛細(xì)血管的最內(nèi)層,易受血糖、血脂、炎癥刺激等因素的損傷[14]。高糖環(huán)境中腎小球內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙與糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。多項(xiàng)研究已表明,高糖條件下會抑制腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)促炎因子的釋放進(jìn)而加重內(nèi)皮損傷[16,17]。高糖誘導(dǎo)的體外腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷方法已被大多數(shù)研究人員證實(shí)可模擬糖尿病腎病環(huán)境[18]。本研究結(jié)果同樣顯示高糖條件下明顯抑制腎小球內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況,促炎因子IL-1β、IL-18水平明顯升高,表明高糖誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

細(xì)胞焦亡是一種程序性細(xì)胞死亡,并伴隨著促炎因子的釋放[19]。NF-κB是炎癥、應(yīng)激反應(yīng)以及細(xì)胞生長和存活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,高糖條件下增強(qiáng)細(xì)胞中氧化應(yīng)激,誘導(dǎo)NF-κB介導(dǎo)的炎性級聯(lián)反應(yīng)[20]。有研究發(fā)現(xiàn),NF-κB途徑激活誘導(dǎo)NLRP3的產(chǎn)生,NLRP3反過來觸發(fā)Caspase-1的募集,形成激活Caspase-1發(fā)生裂解,并促進(jìn)GSDMD的活化以及IL-1β和IL-18的產(chǎn)生[21]。值得注意的是,IL-1β和IL-18是有效的促炎細(xì)胞因子,通過誘導(dǎo)其他促炎細(xì)胞因子和粘附分子的表達(dá)來加重炎性反應(yīng)[22]。Gu等[19]也研究發(fā)現(xiàn)丁酸鈉可通過抑制NF-κB/Caspase-1信號通路降低高糖誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子表達(dá),抑制細(xì)胞焦亡。另有研究報(bào)道稱NLRP3 炎癥小體激活可誘發(fā)腎小球炎癥和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷,從而引發(fā)腎小球損傷[23]。Jiang等[24]也研究發(fā)現(xiàn)維生素D可下調(diào)NF-κB p65、NLRP3、Cleaved Caspase-1蛋白表達(dá),通過抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1信號通路介導(dǎo)的焦亡緩解腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)高糖誘導(dǎo)后,腎小球內(nèi)皮細(xì)胞PI+Caspase-1陽性細(xì)胞比例、p-NF-κB p65、NLRP3、Cleaved Caspase-1以及GSDMD蛋白表達(dá)明顯升高,表明高糖會誘導(dǎo)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生焦亡,此研究結(jié)果與Song等[25]研究一致。另外,使用銀杏素干預(yù)后,增加了處于高糖條件下腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的存活率,抑制細(xì)胞IL-1β、IL-18和LDH的釋放、PI+ Caspase-1陽性細(xì)胞比例以及p-NF-κB p65、NLRP3、Cleaved Caspase-1和GSDMD的蛋白表達(dá),提示銀杏素可通過抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1信號通路抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。分別使用NF-κB、NLRP3、Caspase-1特性性抑制劑BAY、MCC950、VX-765,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BAY、MCC950、VX-765進(jìn)一步抑制腎小球內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生焦亡,證實(shí)銀杏素可通過抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1信號通路抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞焦亡。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)銀杏素促進(jìn)高糖條件下腎小球內(nèi)皮細(xì)胞增殖,通過抑制NF-κB/NLRP3/Caspase-1信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡減輕腎小球內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究僅從體外細(xì)胞層面研究發(fā)現(xiàn)銀杏素可通過NF-κB/NLRP3/Caspase-1信號通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡發(fā)揮抗炎作用,后續(xù)本研究將進(jìn)一步通過體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證銀杏素作用機(jī)制,為銀杏素治療糖尿病腎病提供有力的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。