談俊 高巍巍 滕志鵬 王廣 代震宇 李煒

關(guān)節(jié)炎導(dǎo)致慢性疼痛甚至致殘,對(duì)人們的生活造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)[1]。關(guān)節(jié)炎的特征是疼痛、關(guān)節(jié)腫脹、畸形和功能喪失[2]。但不明確炎性疼痛的發(fā)生機(jī)制,本研究利用完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)炎性疼痛模型[3],探討關(guān)節(jié)炎性疼痛的機(jī)制。P300蛋白是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)家族的關(guān)鍵成員,在真核生物中參與基因表達(dá)的調(diào)控。研究表明,慢性壓迫損傷(CCI)引起的神經(jīng)性疼痛中P300激活增加[4],并依賴于鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMK Ⅱ)的磷酸化[5]。研究表明,細(xì)胞內(nèi)Ca2+相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起的受體損傷和敏化可能是神經(jīng)性疼痛的神經(jīng)生理機(jī)制[6],其中CaMK Ⅱ的表達(dá)變化在其中扮演重要作用[7,8]。CaMK Ⅱ參與外周和中樞敏化過程[6,9]。還有研究表明,抑制CaMK Ⅱ可以改善CCI模型動(dòng)物的疼痛敏化[6]。但是目前仍無關(guān)于P300與其依賴的CaMK Ⅱ的磷酸化調(diào)節(jié)方式在關(guān)節(jié)炎性痛模型中扮演的角色。本文假設(shè)P300通過抑制磷酸化的CaMK Ⅱ可能與關(guān)節(jié)炎性疼痛和抗炎作用有關(guān)。因此,本研究構(gòu)建CFA誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠模型,評(píng)價(jià)鞘內(nèi)注射P300的沉默質(zhì)粒(siRNA-P300)對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠痛覺、炎性反應(yīng)的影響,并探討CaMK Ⅱ磷酸化的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠來源于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。二甲基亞砜(DMSO)、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-6的ELISA試劑盒及CFA購(gòu)于上海碧云天公司;Von Frey TM動(dòng)態(tài)足底觸覺測(cè)量?jī)x購(gòu)于上海玉研科學(xué)儀器有限公司;輻射熱刺痛儀購(gòu)于四川科儀誠(chéng)科技有限公司。P300、P物質(zhì)(SP)、c-fos,p-CaMK Ⅱ的抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的造模、給藥與分組:3月齡雄性SD大鼠60只,體重181～233 g。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房,每日光照約12 h,自由飲食和飲水。所有大鼠飼養(yǎng)2周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。將大鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E、F共6組(n=10):A組:僅為大鼠左后肢踝關(guān)節(jié)注射等體積0.9%氯化鈉溶液作為對(duì)照組。B組:左后肢踝關(guān)節(jié)注射完全弗氏佐劑(CFA)誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠;C組:鞘內(nèi)注射陰性對(duì)照(siRNA-NC),其余操作與D組一致;D組:左后肢踝關(guān)節(jié)注射CFA誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠,制備前10 min鞘內(nèi)注射用于敲低P300的小干擾RNA(siRNA-P300);E組:鞘內(nèi)聯(lián)合注射siRNA-P300和油酸的溶劑二甲基亞砜(DMSO),其余操作與D組一致;F組:鞘內(nèi)聯(lián)合注射siRNA-P300和油酸(CaMKⅡ的激活劑),其余操作與D組一致。建模后1 d、7 d、14 d用電子千分卡尺測(cè)左后足跖厚度。

1.2.2 行為學(xué)檢測(cè):①利用Von Frey TM動(dòng)態(tài)足底觸覺測(cè)量?jī)x檢測(cè)大鼠的機(jī)械性縮足閾值(PWMT)。于建模前1 d,建模后1 d、7 d、14 d檢測(cè)各組大鼠的疼痛刺激閾值,每次檢測(cè)于上午8∶30～11∶30進(jìn)行,波間隔設(shè)置為10,頻率為10.0 Hz,強(qiáng)度1.000 V。測(cè)定時(shí)保持被檢測(cè)肢體溫度在37℃左右。將大鼠放入有機(jī)玻璃籠中,底部為1 cm×1 cm網(wǎng)格的鐵絲網(wǎng),安靜20 min后開始測(cè)量。測(cè)痛儀的Von Frey纖維絲由下向上刺激大鼠右側(cè)后肢足底,設(shè)定刺激力度在20 s內(nèi)由0 g逐漸增強(qiáng)至26 g,當(dāng)大鼠出現(xiàn)迅速縮足時(shí)刺激力度會(huì)停止;若未出現(xiàn)縮足反應(yīng),壓力值增到26 g后也會(huì)自動(dòng)停止。屏幕顯示的壓力值即為痛閾值,每只大鼠測(cè)3次。每2次測(cè)量間隔5 min,取其平均值。②另外,使用熱輻射痛檢測(cè)儀分別檢測(cè)大鼠左后足的熱縮足潛伏期(PWTL),與機(jī)械異位痛同時(shí)進(jìn)行測(cè)試。將大鼠置于3 mm厚的有機(jī)玻璃箱(20 cm×40 cm×35 cm)中,適應(yīng)30 min環(huán)境后確定PWTL。儀器參數(shù)設(shè)定紅外強(qiáng)度為50,終止時(shí)間為20 s。紅外線熱源被放置在腳下并打開。爪子拔出后切斷電源,自動(dòng)記錄照射時(shí)間。每次刺激間隔5 min,以避免潛在的組織損傷。

1.2.3 組織檢測(cè):動(dòng)物腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉麻醉,鞘內(nèi)注射20 μl亞甲藍(lán)確認(rèn)導(dǎo)管位置。開胸灌流沖洗心臟,然后灌流固定40～60 min。大鼠在造模-1 d、1 d、7 d、14 d時(shí)取材制成切片。暴露脊柱棘突和橫突,選L4和L5作入路。剪刀剪去部分棘突形成“V”形切口,暴露黃韌帶和脊髓組織。咬去黃韌帶和硬脊膜,繼續(xù)咬去兩側(cè)的橫突。鉗下骨質(zhì)暴露脊髓并取出,剪去脊神經(jīng)節(jié)兩端的脊神經(jīng)干。將脊髓浸泡在4%多聚甲醛固定36 h,在30%蔗糖中脫水24 h。用O.C.T.進(jìn)行包埋,在-20℃下切6 μm厚手動(dòng)切片。吸附在載玻片上保存。用免疫熒光方法檢測(cè)定位定性P300在脊髓中的表達(dá)。冷凍切片經(jīng)過血清封閉并于室溫回溫,孵育兔抗大鼠的P300的一抗(1∶300)于濕盒中4℃過夜,復(fù)溫30 min,隨后避光下孵育山羊抗兔IgG二抗(黃紅色DyLight 549,1∶200)1 h。使用甘油:0.01 mmol/L(1∶1)封片。熒光顯微鏡下拍照保存。

1.2.4 Western blot檢測(cè)大鼠神轉(zhuǎn)錄因子和TRP、鈉通道蛋白:冰浴中勻漿處理脊髓組織,冰上孵育20 min,隨后離心15～20 min,收集上清,用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光值;計(jì)算樣品中的蛋白濃度。行SDS-PAGE電泳(先45 V,后90 V),冰浴電泳1.5 h;使用NC膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。使用Western Blot封閉液封閉用于檢測(cè)的NC膜,室溫封閉1 h,孵育SP(1∶500)、c-fos(1∶500)、磷酸化的CaMKⅡ(1∶800)、P300(1∶800)的一抗,室溫孵育30 min后,放于4℃過夜;孵育二抗,室溫孵育40 min,最后進(jìn)行顯色和曝光。

1.2.5 ELISA檢測(cè)血清中TNF-α、L-1β、IL-6的表達(dá):收集14 d大鼠血清。ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、L-1β、IL-6的表達(dá)水平。酶標(biāo)儀檢測(cè)A450的光密度。

1.3 觀察指標(biāo) 6組大鼠機(jī)械痛閾值,熱縮足潛伏期,左后足跖厚度,脊髓SP、c-fos、P300、p-CaMK Ⅱ、CaMK Ⅱ的蛋白表達(dá)水平,血清中TNF-α、L-1β、IL-6的含量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠機(jī)械痛閾值變化 動(dòng)物行為學(xué)觀察大鼠的MWT。與A組比較,B組造模后1 d、7 d、14 d的MWT值明顯下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與B組比較,C組在造模后1 d、7 d、14 d的MWT的變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);與C組比較,D組在造模后1 d、7 d、14 d的MWT均上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與E組比較,F組在造模后1 d、7 d、14 d的MWT均下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與D組比較,E組在造模后1 d、7 d、14 d 的MWT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 6組大鼠機(jī)械痛閾值 n=10,MWT/g,

2.2 大鼠熱縮足潛伏期變化 動(dòng)物行為學(xué)觀察大鼠的PWTL。與A組比較,B組造模后1 d、7 d、14 d的PWTL明顯縮短,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與B組比較,C組在造模后1 d、7 d、14 d 的PWTL變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);與C組比較,D組在造模后1 d、7 d、14 d 的PWTL均增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與E組比較,F組在造模后1 d、7 d、14 d 的PWTL均縮短,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);與D組比較,E組在造模后1 d、7 d、14 d 的PWTL差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 6組大鼠輻射熱潛伏期 n=10,PWIL/S,

2.3 大鼠脊髓SP和c-fos的變化 檢測(cè)大鼠造模后14 d脊髓的SP和c-fos的表達(dá)變化。A組SP和c-fos的表達(dá)水平明顯上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與B組比較,C組SP和c-fos的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與C組比較,D組SP和c-fos的表達(dá)水平下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與E組比較,F組SP和c-fos的表達(dá)水平上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);但與D組比較,E組SP和c-fos的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表3。

表3 6組大鼠脊髓SP和c-fos的相對(duì)表達(dá) n=10,

2.4 大鼠左后足跖腫脹程度變化 測(cè)量大鼠左后足跖厚度變化。與A組比較,B組造模后1 d、7 d、14 d的足跖厚度增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與C組比較,D組在造模后1 d、7 d的足跖厚度減少,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表4。

表4 6組大鼠左后足跖厚度 n=10,cm,

2.5 大鼠血清TNF-α、L-1β、IL-6的變化 檢測(cè)大鼠造模后14 d血清TNF-α、L-1β、IL-6的變化。與A組比較,B組造模后TNF-α、L-1β、IL-6的水平上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與B組比較,C組TNF-α、L-1β、IL-6的水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與C組比較,D組TNF-α、L-1β、IL-6 的水平下調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與E組比較,F組TNF-α、L-1β、IL-6上調(diào),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與D組比較,E組TNF-α、L-1β、IL-6的水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表5。

表5 大鼠血清炎性因子水平 n=10,

2.6 大鼠脊髓CaMK Ⅱ的磷酸化水平變化

2.6.1 免疫熒光結(jié)果顯示:與A組比較,B組P300的表達(dá)水平上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與B組比較,C組P300水平變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與C組比較,D組P300的水平下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與E組比較,F組的P300上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與D組比較,E組的P300的水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6.2 蛋白免疫印跡檢測(cè)大鼠造模后14 d脊髓p-CaMK Ⅱ的表達(dá)變化:A組的p-CaMK Ⅱ的表達(dá)水平明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與B組比較,C組p-CaMK Ⅱ表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);而與C組比較,D組的p-CaMK Ⅱ的表達(dá)水平下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與E組比較,F組的p-CaMKII表達(dá)水平上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);但與D組比較,E組的p-CaMK Ⅱ的水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、2,表6。

圖1 蛋白免疫印跡檢測(cè)大鼠脊髓的P300和p-CaMK Ⅱ的表達(dá)

A組 B組 C組

表6 大鼠P300蛋白和CaMKII的磷酸化的相對(duì)表達(dá)水平 n=10,

3 討論

關(guān)節(jié)炎是目前導(dǎo)致嚴(yán)重威脅人類健康的關(guān)節(jié)疾病,每年關(guān)節(jié)炎的新發(fā)病例數(shù)和致殘總數(shù)都在增加。關(guān)節(jié)炎患者會(huì)產(chǎn)生不同程度的疼痛,降低生活質(zhì)量[1]。關(guān)節(jié)炎的炎性痛機(jī)制較為復(fù)雜,容易出現(xiàn)異常性疼痛和痛覺過敏[10],由于其病因的多樣性和復(fù)雜性,炎性導(dǎo)致的疼痛已成為關(guān)節(jié)炎機(jī)制研究的關(guān)鍵[11]。

本研究使用CFA模擬臨床的關(guān)節(jié)炎性疼痛。觀察到與對(duì)照組大鼠比較,CFA誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎性疼痛大鼠中的機(jī)械性異常性疼痛持續(xù)1個(gè)月,另外,本研究也觀察到了CFA注射后的慢性熱痛覺過敏現(xiàn)象持續(xù)半月。因此本研究著重研究了1 d、7 d、14 d大鼠的關(guān)節(jié)炎性疼痛機(jī)制。我們還觀察到CaMK Ⅱ參與到了佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的疼痛和炎性反應(yīng)。

首先,動(dòng)物行為學(xué)結(jié)果顯示,CFA關(guān)節(jié)炎大鼠表現(xiàn)出明顯疼痛反應(yīng),其中機(jī)械痛覺過敏的癥狀持續(xù)至少28 d,而熱痛覺過敏持續(xù)至少維持15 d。因此,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,CFA誘導(dǎo)下,大鼠關(guān)節(jié)的促炎反應(yīng)加劇,不僅可以誘導(dǎo)機(jī)械痛覺過敏還可以誘導(dǎo)熱痛覺過敏。這與Avrampou 等[12]的研究一致。其次,內(nèi)鈣的相關(guān)級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)痛覺敏化,而且研究表明CaMK Ⅱ的磷酸化水平升高作為痛覺敏化的關(guān)鍵表征之一[13],因此我們研究了CFA關(guān)節(jié)炎大鼠脊髓中CaMK Ⅱ的磷酸化水平。蛋白免疫印跡結(jié)果觀察到,在CFA刺激后的14 d,大鼠脊髓組織中CaMK Ⅱ的磷酸化水平明顯增加。然而,大鼠在術(shù)前接受鞘內(nèi)注射siRNA-P300,可觀察到明顯的磷酸化CaMK Ⅱ水平被抑制的現(xiàn)象,此結(jié)果表明,沉默P300抑制了CFA關(guān)節(jié)炎大鼠脊髓組織中CaMK Ⅱ的磷酸化水平。

作為HAT家族成員,P300蛋白在以往被證實(shí)可以參與CCI神經(jīng)性痛覺過敏,我們的結(jié)果證實(shí),P300在CFA模型大鼠脊髓中表達(dá)顯著增加,表明P300可能對(duì)CFA疼痛的機(jī)制具有潛在的調(diào)節(jié)作用。另外,P300激活后可以引起CaMK Ⅱ的磷酸化[4,14,15]。在外周和中樞敏化過程中CaMK Ⅱ的磷酸化扮演重要作用[9]。研究表明,CCI神經(jīng)性痛覺過敏大鼠在造模前接受鞘內(nèi)注射CaMK Ⅱ抑制劑m-AIP可導(dǎo)致CaMK Ⅱ的磷酸化被抑制,因此表現(xiàn)出痛覺過敏行為減輕的現(xiàn)象,維持了7 d[6]。本研究在大鼠脊髓中利用P300的siRNA成功降低P300的表達(dá)。觀察到與CaMK Ⅱ抑制劑m-AIP類似的結(jié)果;但是P300被沉默后,我們還觀察到14 d痛覺過敏行被減輕的效果,觀察到脊髓中的疼痛標(biāo)志物SP和c-fos表達(dá)同樣被抑制;而在P300沉默的基礎(chǔ)上繼續(xù)使用CaMK Ⅱ激活劑油酸后,痛覺過敏行為反而部分增強(qiáng),且SP和c-fos表達(dá)部分上調(diào),但是油酸對(duì)P300的表達(dá)未產(chǎn)生顯著影響。因此本研究結(jié)果表明,在脊髓中沉默P300可能通過抑制CaMKII的磷酸化抑制CFA大鼠的炎性痛覺過敏。

另外,與對(duì)照組比較,CFA組大鼠的足跖厚度增加,而預(yù)先注射siRNA-P300,CFA大鼠的足跖厚度在7 d內(nèi)被明顯抑制,表明siRNA-P300可以抑制關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)水腫。我們還檢測(cè)大鼠血清TNF-α、L-1β、IL-6的變化。本研究結(jié)果顯示siRNA-P300降低了TNF-α、L-1β、IL-6水平,然而注射油酸后,大鼠血清TNF-α、L-1β、IL-6的水平都增加。因此,本研究證明關(guān)節(jié)大鼠鞘內(nèi)注射siRNA-P300有抗炎作用,抑制CaMKII的磷酸化是siRNA-P300抗炎作用的關(guān)鍵機(jī)制之一。

本研究深入探討了關(guān)節(jié)炎性疼痛的機(jī)制,并觀察到脊髓SP、c-fos、P300蛋白、CaMKⅡ的磷酸化水平表達(dá)均增加,與觀察到的CFA大鼠疼痛行為相對(duì)同步,這表明CaMK Ⅱ可能介入與疼痛有關(guān)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。研究表明,大鼠中皮下注射甲醛后,CaMK Ⅱ磷酸化在脊髓背角顯著增加,時(shí)間與發(fā)炎性疼痛出現(xiàn)的時(shí)間高度一致[16]。這進(jìn)一步證實(shí)CaMK Ⅱ可作為炎性痛的標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。另有相關(guān)機(jī)制研究證實(shí),CaMK Ⅱ經(jīng)歷自身磷酸化并激活天冬氨酸NMDA受體,以促進(jìn)痛覺過敏的持續(xù)形成[17,18]。以上這些結(jié)果表明,在臨床治療關(guān)節(jié)炎性疼痛中,連續(xù)給CaMK Ⅱ磷酸化的抑制劑可能更有效,而沉默P300對(duì)CaMK Ⅱ磷酸化的抑制作用更明顯,因而可作為新的關(guān)節(jié)炎性疼痛的治療靶點(diǎn)。

綜上所述, P300介導(dǎo)的CaMK Ⅱ磷酸化在關(guān)節(jié)炎性疼痛和炎性反應(yīng)中起著重要作用。通過使用siRNA-P300抑制CaMK Ⅱ的磷酸化,可在一定的時(shí)間內(nèi)有效改善大鼠的疼痛行為和炎性反應(yīng),為關(guān)節(jié)炎性疼痛的臨床治療提供了新思路。