曹冰 張靜 陸晨

糖尿病腎病(diabetic kidney disease)是糖尿病患者嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一,也是目前導(dǎo)致終末期腎病發(fā)生的主要原因之一。目前治療糖尿病腎病的最佳治療措施包括嚴(yán)格控制血糖、血壓及降低尿蛋白的排泄,雖然該病的治療方案選擇性很多,但這并沒有使糖尿病腎病發(fā)病率降低。鈉葡萄糖共轉(zhuǎn)運(yùn)體2(sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2)抑制劑是一種新型的糖尿病治療藥物,研究表明SGLT2抑制劑具有降糖、降壓、降低蛋白尿排泄、改善腎纖維化等腎臟保護(hù)作用[1]。研究證實(shí),轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming grouth factor beta 1,TGF-β1)合成增加的許多原因是由于高血糖的作用,TGF-β1可導(dǎo)致基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生及腎小球結(jié)節(jié)性硬化的發(fā)生,促進(jìn)腎臟纖維化發(fā)生,與此同時(shí),結(jié)締組織生長因子(connective tissue grouth factor,CTGF)也是一種新的促進(jìn)纖維化生長因子,它的表達(dá)在一定程度上受到TGF-β1的調(diào)節(jié),在糖尿病腎病的組織中表達(dá)量增加,參與致腎臟纖維化的作用中。有研究表明SGLT2抑制劑可通過抑制糖尿病大鼠腎臟 TGF-β1的水平對大鼠的腎臟存在保護(hù)作用[1]?？ǜ窳袃魹槟壳芭R床應(yīng)用的SGLT2抑制劑之一,本實(shí)驗(yàn)通過建立對照組、糖尿病腎病組、卡格列凈干預(yù)組3種大鼠模型,分別給予蒸餾水及卡格列凈藥物干預(yù),觀察大鼠血糖變化、尿蛋白變化情況,同時(shí)評價(jià)卡格列凈對糖尿病腎病的保護(hù)作用機(jī)制及對TGF-B1及下游因子CTGF表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心提供SPF級雄性 Wistar 大鼠共28只,于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行繁育。選8～10周齡,體重200～250 g進(jìn)行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度(23±3)℃,相對濕度40%～70%。該研究通過新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批,倫理審批號:IACUC-20210425-14。

1.2 主要試劑 (1)45%高脂飼料(日糧型,大鼠)、普通飼料(對照組)(江蘇協(xié)同公司);(2)鏈脲菌素(sigma公司);(3)卡格列凈片(規(guī)格100 mg,生產(chǎn)企業(yè):Janssen-CilagS.p.A.意大利);(4)RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑(博士德公司);(5)山羊抗兔IgG H&L (HRP)、山羊抗小鼠IgG H&L (HRP)(Abcam公司);(6)Rabbit Anti-TGF beta 1 antibody、Rabbit Anti-CTGF antibody等(博奧森公司)。

1.3 主要儀器 手動(dòng)單道移液器(德國Eppendorf公司 Research plus);羅氏(ROCHE)血糖儀家用血糖試紙(羅氏卓越型);電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司DNP-9272);酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad xMarkTM);高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司);漩渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);微量分光光度計(jì)(杭州奧盛Nano-100;BG-Power600i);常規(guī)電泳儀電源(北京百晶生物技術(shù)有限公司BG-Power600i);電泳儀(北京六一DYCZ-21);Real Time PCR instrument(美國ABI 7500 Fast);化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司 Chemiscope 3000);蛋白轉(zhuǎn)膜儀[Bio-Rad(USA) Mini-PROTEAN Tetra system]。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組:將28只雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為:對照組(8只);糖尿病腎病組(10只);卡格列凈干預(yù)組(10只)。

1.4.2 糖尿病腎病大鼠模型造模過程:大鼠普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,繼續(xù)給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)4周(對照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)4周),第5周第1天糖尿病腎病組和卡格列干預(yù)組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kg(pH值4.45、0.01 mol/L無菌檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)1次,對照組大鼠注射等體積溶劑。注射第3天測隨機(jī)血糖1次,隨機(jī)血糖<11.1 mmo/L的大鼠,需重新注射1次STZ(50 mg/kg),7 d后,連續(xù)3 d尾靜脈取血,隨機(jī)血糖≥16.7 mmo/L,若大鼠出現(xiàn)多飲、多食、多尿、體重下降的典型的“三多一少”癥狀,以及尿檢白蛋白升高、毛發(fā)枯黃、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象則證明造模成功。次日開始卡格列凈干預(yù)組給予卡格列凈 (10 mg/kg)灌胃,對照組及糖尿病腎病組給予蒸餾水(等體積)灌胃,持續(xù)灌胃37 d后處死大鼠。

1.4.3 標(biāo)本的收集與處理:①血清樣本收集:大鼠處死以后,收集腹腔動(dòng)脈血>1～2 ml,分離血清,保存于-80℃冰箱中,為檢測空腹血糖,大鼠處死12 h之前禁食;②組織樣本收集:大鼠處死后,收集腎臟組織,稱重完以后,在液氮速凍后,-80℃凍存,用于Westerm blot和RT-PCR檢測。

1.4.4 qRT-PCR檢測腎臟組織中TGF-β1、CTGF基因表達(dá)水平:取腎臟組織提取RNA,進(jìn)行qRT-PCR檢測TGF-β1、CTGF基因表達(dá)水平。

1.4.4.1 RNA提取步驟:將組織在液氮包圍的情況下,研磨成粉,取100 mg加入有1 ml TRLZOL的離心管中,混勻。室溫放置>15 min。加入200 μl的氯仿,顛倒混勻后室溫放置5 min。4℃下12 000 r/mim離心15 min。吸取上清至另一個(gè)新的離心管中,加入等體積的異丙醇混勻,-20℃放置60 min。4℃下12 000 r/min離心15 min,小心倒掉上清液。加入75%的乙醇,使沉淀漂浮起來洗滌。4℃ 12 000 r/min離心15 min,小心倒掉上清液。重復(fù)上述步驟1次?？展茈x心,吸盡液體。用RNase free的水溶解沉淀。核酸蛋白定量儀檢測RNA濃度,瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。RNA反轉(zhuǎn)錄用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4.4.2 第一鏈cDNA合成。

1.4.4.3 熒光定量實(shí)驗(yàn):熒光定量PCR體系包含:Eva Green 2×qPCR MasterMix 10 μl、cDNA 1 μl、RNase-free Water Up to 20 μl,上下游引物各0.6 μl。熒光定量引物信息:Tgfb1-F:5’-CTGCTGACCCCCACTGATAC-3’,Tgfb1-R:5’-AGCCCTGTATTCCGTCTCCT-3’,CTGF-F:5’-CCCAACTATGATGCGAGCCA-3’,CTGF-R:5’-CATTGGTAACC CGGGTGGAG-3’,rat GAPDH_F:5’-CAGGGCTGCCTTCTCTTGTG-3’,rat GAPDH_R:5’-GATGGTGATGGGTTTCCCGT-3’。反應(yīng)條件:95℃ 10 min 預(yù)變性;95℃ 15 s 變性; 60℃ 60 s 退火并延伸;循環(huán)40 次。

1.4.5 Westerm blot檢測腎臟組織中TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)水平:取腎臟組織提取蛋白,Western blot檢測TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠血糖情況 糖尿病腎病組及卡格列凈干預(yù)組的大鼠血糖監(jiān)測水平均明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),卡格列凈干預(yù)組在給藥第18天后血糖水平明顯低于糖尿病腎病組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血糖情況 mmol/L,

2.2 3組大鼠尿液中蛋白情況 注射STZ第2、3天,糖尿病腎病組及卡格列凈干預(yù)組尿液中的蛋白含量均明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);處死前糖尿病腎病組的尿蛋白定量水平明顯高于對照組(P<0.05),卡格列凈干預(yù)組明顯低于糖尿病腎病組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠尿液中蛋白含量情況 mg/L,

2.3 3組大鼠組織中各基因表達(dá)情況 糖尿病腎病組及卡格列凈干預(yù)組的TGF-β1及CTGF的基因表達(dá)水平均明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),卡格列凈干預(yù)組的TGF-β1及CTGF的基因表達(dá)水平明顯低于糖尿病腎病組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠組織中各基因表達(dá)情況

2.4 3組大鼠腎臟組織各蛋白表達(dá)水平情況 糖尿病腎病組及卡格列凈干預(yù)組大鼠腎臟組織中的TGF-β1及CTGF蛋白表達(dá)水平均明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),卡格列凈干預(yù)組大鼠腎臟組織中的TGF-β1及CTGF蛋白表達(dá)水平明顯低于糖尿病腎病組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4,圖1。

圖1 Western blot印跡檢測不同因子在3組中表達(dá)水平

表4 3組大鼠腎臟組織各蛋白表達(dá)水平情況

3 討論

糖尿病腎病是目前導(dǎo)致終末期腎病發(fā)生發(fā)展的主要原因之一,大約25%的糖尿病患者會(huì)出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿和(或)腎小球?yàn)V過率持續(xù)性下降[2]。腎間質(zhì)纖維化的嚴(yán)重程度是反映糖尿病腎病患者腎功能下降程度和預(yù)后判斷的一項(xiàng)重要指標(biāo),也是DKD及其他慢性腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎病的共同致病機(jī)制[3]。持續(xù)高血糖的存在可以導(dǎo)致糖基化中間產(chǎn)物堆積以及脂蛋白代謝異常,使腎臟血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生變化,最終導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生[4]。既往研究證實(shí),高血糖參與調(diào)解TGF-β1的合成,導(dǎo)致基底膜增厚、系膜基質(zhì)增生及腎小球結(jié)節(jié)性硬化的發(fā)生,成為糖尿病腎病發(fā)病的基礎(chǔ)[5]。

SGLT2抑制劑是一類新型降糖藥物,它通過抑制 SGLT2的轉(zhuǎn)運(yùn)作用從而使腎臟對葡萄糖重吸收減少,促進(jìn)尿糖、尿鈉的排出,為降低糖尿病腎病早期高濾過提供了基礎(chǔ)[6]。SGLT2抑制劑不刺激胰島素分泌,低血糖的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)極低,許多研究均證實(shí)了該藥物的有效性及安全性[7]。研究顯示SGLT2抑制劑除了能有效降低血糖及HbA1c外,對心血管疾病的其他危險(xiǎn)因素包括體重、血壓、血脂、血尿酸、高胰島素血癥、動(dòng)脈硬化及氧化應(yīng)激均有保護(hù)性調(diào)節(jié)作用,同時(shí)可使尿蛋白水平下降[8],以上均提示 SGLT2抑制劑對DKD具有直接或者間接的腎臟保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)建立了對照組、糖尿病腎病組、卡格列凈干預(yù)組3種大鼠模型,分別給予蒸餾水及卡格列凈藥物干預(yù),觀察大鼠血糖變化、尿蛋白變化情況,同時(shí)評價(jià)SGLT2抑制劑對糖尿病腎病的保護(hù)作用機(jī)制及對TGF-B1及其下游因子CTGF表達(dá)的影響。

本研究結(jié)果顯示,卡格列凈干預(yù)組在給藥第18天后血糖水平明顯低于糖尿病腎病組(P<0.05),提示卡格列凈具有較好的降糖作用。糖尿病腎病組、卡格列凈干預(yù)組尿液中的蛋白含量均明顯高于對照組(P<0.05),卡格列凈干預(yù)組在處死前的尿蛋白定量水平明顯低于糖尿病腎病組(P<0.05),提示卡格列凈可降低大鼠的尿蛋白水平,起到一定程度的腎臟保護(hù)作用。

除此之外,本研究結(jié)果顯示糖尿病腎病組、卡格列凈干預(yù)組的TGF-β1及CTGF的基因表達(dá)水平、大鼠腎臟組織中的TGF-β1及CTGF蛋白表達(dá)水平均明顯高于對照組(P<0.05),卡格列凈干預(yù)組的TGF-β1及CTGF的基因表達(dá)水平、大鼠腎臟組織中的TGF-β1及CTGF蛋白表達(dá)水平明顯低于糖尿病腎病組(P<0.05)?？ǜ窳袃羲幬锔深A(yù)治療后TGF-β1和CTGF水平較糖尿病腎病組明顯下降,提示SGLT2抑制劑可能通過抑制TGF-β1及其下游的CTGF途徑發(fā)揮抗纖維化作用,進(jìn)一步保護(hù)腎臟功能。相關(guān)研究表明,轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β1)是一種多肽類調(diào)控蛋白,它調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化主要是通過受體信號通路的傳遞,從而增加其細(xì)胞外基質(zhì)的含量,加重腎小球硬化的進(jìn)展[9]。TGF-β1可刺激腎臟細(xì)胞增殖與分化,并刺激腎臟多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成,同時(shí)也參與抑制細(xì)胞外基質(zhì)的降解過程中[10]。在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中CTGF也是一種新的促進(jìn)纖維化生長因子,廣泛存在于腎臟組織中,它通過增加細(xì)胞外基質(zhì)導(dǎo)致基質(zhì)沉積、調(diào)解細(xì)胞外基質(zhì)的代謝周期、促進(jìn)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)型等多種機(jī)制促進(jìn)腎臟發(fā)生纖維化[11],它的表達(dá)在一定程度上受到TGF-β1的作用調(diào)解,CTGF也在糖尿病腎病的組織中表達(dá)量增加,參與致腎臟纖維化的作用中[12]。本研究結(jié)果顯示SGLT2抑制劑通過降低TGF-β1及其下游因子CTGF的表達(dá)水平,減輕腎臟纖維化,進(jìn)一步達(dá)到腎臟保護(hù)作用。

綜上所述,SGLT2抑制劑通過降低TGF-β1及其下游因子CTGF的表達(dá)水平,發(fā)揮糖尿病腎病保護(hù)作用。本研究結(jié)果為糖尿病腎病的防治提供了新的靶點(diǎn)藥物,為SGLT2抑制劑的腎臟保護(hù)作用提供了更多理論依據(jù)。