馬 朝，李 潔，余成龍，吳 德，林 燕

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所，四川 成都 611130)

1 前言

在禁抗大環(huán)境下，飼料抗生素的禁用使當(dāng)前的生豬養(yǎng)殖業(yè)保持生豬健康面臨著挑戰(zhàn)，尤其是在仔豬斷奶階段出現(xiàn)的“仔豬斷奶應(yīng)激綜合征” 更是影響著仔豬的生產(chǎn)性能和存活率[1]。 替抗藥物的尋找，成為迫切需要。 前人研究發(fā)現(xiàn)，天然的植物中含有多種多糖和植物精油等植物化學(xué)物質(zhì)[3]。 這些化學(xué)物質(zhì)具有多種生物學(xué)功能，如劉毅等[4]研究的斷奶仔豬在大腸埃希菌攻毒后，基礎(chǔ)日糧中僅添加10 ppm的辣椒油樹脂、大蒜植物和姜黃油樹脂，就能有效緩解大腸桿菌感染引起的腹瀉和炎癥；還有鄒毅等[5]研究的牛至精油，在育肥豬的日糧基礎(chǔ)上連續(xù)補(bǔ)充25 mg/kg 牛至精油4 周，改善了腸道屏障的完整性，促進(jìn)了炎癥基因的表達(dá)。 當(dāng)然還有其他人研究的植物提取物，都有抗生素的效果，使植物化學(xué)物質(zhì)成為了替抗的可能[6-10]。

中醫(yī)開出的藥方集植物精華于一體，尤勝于前人的單個植物化學(xué)物質(zhì)研究。 本試驗(yàn)結(jié)合前人研究，通過在斷奶仔豬日糧中添加不同劑量的復(fù)方中草藥飼料添加劑，研究提高斷奶仔豬生產(chǎn)性能，防止仔豬腹瀉等方面的積極作用。 為探究該復(fù)方中草藥飼料添加劑推廣使用以及替代抗生素和氧化鋅的可行性[11]。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)飼糧

本次試驗(yàn)選取體況相近的DLY 斷奶仔豬60 頭(公母各半)，平均體重約8.7 kg，隨機(jī)分為3 個處理組，即對照組 (基礎(chǔ)日糧＋0.2%氧化鋅＋0.5%酸化劑，T1)，中草藥組1 (基礎(chǔ)日糧＋1 kg/T 中草藥，T2)，中草藥組2 (基礎(chǔ)日糧＋2 kg/T 中草藥，T3)，每個處理組5 個重復(fù)，每個重復(fù)4 頭豬。 飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))%

2.2 飼養(yǎng)管理及樣品采集

動物飼養(yǎng)試驗(yàn)在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行，整個試驗(yàn)期間豬只自由采食和飲水，所有豬只的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件保持一致。 試驗(yàn)預(yù)飼期3 d，正式試驗(yàn)期28 d。 在試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，斷料12 h 后，使用前腔靜脈采集空腹血液5 mL，并分離血清。

2.2.1 生產(chǎn)性能測定 正式試驗(yàn)第1 天、第14 天和第28 天08: 00 對仔豬進(jìn)行稱重(空腹) 并記錄，需計(jì)算平均日增重(ADG)。 每天早上喂料前記錄每個圈的投料量和剩余量，統(tǒng)計(jì)后計(jì)算階段平均日采食量(ADFI)，計(jì)算料肉比(F/G)。

2.2.2 腹瀉評分與腹瀉率 每天07:30 ～21:30 連續(xù)觀測仔豬排糞情況，對每頭豬每次排出的糞便進(jìn)行腹瀉評分，統(tǒng)計(jì)腹瀉個體數(shù)并計(jì)算腹瀉率。

腹瀉評分標(biāo)準(zhǔn): 條形或粒形糞便(0 分)；軟糞、成形(1 分)；稠狀、成形、糞水無分離現(xiàn)象(2 分)；液狀、不成形、糞水有分離現(xiàn)象(3 分)。 得分為2 分和3 分者即為腹瀉。 腹瀉率計(jì)算公式如下: 腹瀉率＝試驗(yàn)期間每日腹瀉頭數(shù)總和/試驗(yàn)豬總數(shù)*試驗(yàn)天數(shù)×100%。

2.2.3 免疫器官指數(shù)測定 試驗(yàn)結(jié)束后，在每個處理組中隨機(jī)選擇6 頭仔豬進(jìn)行屠宰，立即取出仔豬的胸腺、脾臟等免疫器官，剝離附著的脂肪后稱重，記錄，最后計(jì)算各免疫器官指數(shù)(公式如下)。 免疫器官指數(shù) (%) ＝[免疫器官重量(g) /屠宰前活重(g)] ×100%。

2.2.4 腸道酶活性 分別取十二指腸、空腸和回腸黏膜樣品，使用南京建成公司的相應(yīng)測試試劑盒進(jìn)行測定，測定上清液中糜蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶的活性以及腸道蛋白總量。

2.2.5 腸道黏膜屏障、養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫功能相關(guān)基因mRNA 相對表達(dá)量測定 總RNA 的提取: 嚴(yán)格按照RNA 提取試劑盒(Vazyme)操作，得到總RNA 后，在核酸蛋白儀上取RNA 樣品測出相應(yīng)的吸光度(OD 260 nm/OD 280 nm)應(yīng)介于1.8 ～2.0。 用1% 瓊脂糖凝膠電泳測定RNA 的質(zhì)量和完整性。 反轉(zhuǎn)錄: 利用反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，所有步驟嚴(yán)格按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme) 說明書進(jìn)行。 反轉(zhuǎn)錄所用pcr 儀(Bio-rad T100)。

引物設(shè)計(jì): 用于實(shí)時(shí)PCR 分析的引物。如表2。

表2 腸道黏膜屏障、養(yǎng)分轉(zhuǎn)運(yùn)、免疫功能相關(guān)基因引物序列

2.2.6 腸道微生物收集仔豬盲腸和結(jié)腸食糜樣品于凍存管中，存放于-80 ℃冰箱。 將食糜寄送(干冰運(yùn)輸) 到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行相關(guān)的微生物組成測序工作。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)先通過EXCL 2019 版進(jìn)行初步的處理，再使用SPSS 27.0 軟件進(jìn)行分析。 采用ANOVA 單因素方差分析和Duncan 多重比較分析。 數(shù)據(jù)用平均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，當(dāng)P＜0.05 時(shí)表示差異顯著，當(dāng)P＜0.01 時(shí)表示差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 中草藥添加劑對仔豬生產(chǎn)性能的影響

由表3 得知在1 ～14 天各處理組平均日增重以及平均日采食量差異不顯著(P＞0.05)，但T2 組日增重高于對照組，且料肉比顯著低于其他處理組(P＜0.05)。 而15 ～28 天以及試驗(yàn)全期來看，T2 組采食量極顯著高于另外兩個組(P＜0.01)，其他指標(biāo)差異不顯著。

表3 中草藥添加劑對仔豬生產(chǎn)性能的影響

3.2 中草藥添加劑對仔豬腹瀉指數(shù)與腹瀉率的影響

由表4 得知15 ～28 天T2 組腹瀉率顯著低于T1 組(P＜0.05)，且在整個試驗(yàn)全期，T2組的腹瀉率和腹瀉指數(shù)都略低于對照組以及T3 組。

表4 中草藥添加劑對仔豬腹瀉率和腹瀉指數(shù)的影響

3.3 中草藥添加劑對仔豬免疫器官指數(shù)的影響

由表5 得知T2 和T3 組脾臟重以及T2 組脾臟體脂數(shù)極顯著高于對照組(P＜0.01)。處理組胸腺重以及胸腺體指數(shù)無顯著差異。

表5 中草藥添劑對仔豬免疫器官指數(shù)的影響

3.4 中草藥添加劑對仔豬腸道發(fā)育以及組織學(xué)形態(tài)的影響

由表6 得知T3 處理組的十二指腸和回腸隱窩深度都極顯著的增加(P＜0.01)。

表6 中草藥添加劑對仔豬腸道組織形態(tài)的影響

3.5 中草藥添加劑對仔豬腸道酶活性的影響

表7 反映了各個處理組腸道各種酶活性測定結(jié)果，T2 組十二指腸脂肪酶活性有增加的趨勢(P＜0.1)，其他各指標(biāo)沒有顯著差異(P＞0.05)。

表7 中草藥添加劑對仔豬腸道酶活性的影響

3.6 中草藥添加劑對仔豬不同腸段腸道相關(guān)基因表達(dá)的影響

從表8 可知，與對照組相比，T2 組可顯著提高十二指腸ZO1 和SGLT1 基因表達(dá)水平(P＜0.05)，TNFα 有降低的趨勢 (P＝0.062)；T3 組可顯著提高CAT1、IL10、IL2基因表達(dá)水平(P＜0.05)。

表8 中草藥添加劑對仔豬十二指腸基因表達(dá)的影響

從表9 可知，與對照組相比，T2 組可提高空腸SGLT1 基因的表達(dá)水平(P＝0.092)；T3 組可顯著提高ZO -1、Claudin -1、IL10、IL2 基因表達(dá)水平(P＜0.05)，對TNFα 基因的表達(dá)有增加的趨勢(P＝0.084)。

表9 中草藥添加劑對仔豬空腸基因表達(dá)的影響

從表10 可知，與對照組相比，T2 組可顯著提高回腸ZO1、CAT1、IL10 基因表達(dá)水平(P＜0.05)；T3 組可顯著提高ZO -1、CAT -1、IL10、IL2 基因表達(dá)水平(P＜0.05)，對Claudin-1 有增加的趨勢(P＝0.058)。

表10 中草藥添加劑對仔豬回腸基因表達(dá)的影響

3.7 中草藥添加劑對仔豬糞便微生物區(qū)系的測序和多樣性的組成分析

通過對仔豬糞便樣品16S rRNA 基因V3 ～V4 區(qū)序列進(jìn)行了測定。 以物種水平97%的序列相似性為標(biāo)準(zhǔn)，共鑒定出871 個OTU，均屬于Greengenes 分類的細(xì)菌域。 圖1A、B 顯示這3 個類群分別有的OTU，主要屬于擬桿菌屬、細(xì)菌屬和變形桿菌屬，在2 個腸段的3 個處理組中OTU 均沒有明顯差異，但是在日糧中添加2 000 g/T 的添加中草藥制劑的OTU 數(shù)量最高。 由圖1C、D 可知，T3 組在結(jié)腸段樣品中顯著增加了結(jié)腸糞便微生物多樣性(P＜0.05)，而在盲腸階段只有增加趨勢，但是T2組的盲腸微生物糞便微生物確是減少狀態(tài)。

圖1 OTU 水平上的Venn 和微生物多樣性指數(shù)

從CLASS 水平上(圖2A、B) 可以看出梭狀芽孢桿菌(Clostridia) 是優(yōu)勢菌，且梭狀芽孢桿菌在結(jié)腸段T1 組和T2 組高于T3 組，而在盲腸段T2 和T3 組基本一致，反而高于T1 組，有趣的是擬桿菌(Bacteroidia) 也是在結(jié)腸隨著復(fù)方中草藥添加劑增加而增加，在盲腸減少。 由細(xì)菌OTUS 的主坐標(biāo)分析(PCoA)顯示，三組微生物群落的組成的糞便微生物有顯著差異(圖2C、D)。 而且在結(jié)腸段的樣品中，T2 組樣品聚類緊密，表明其細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)高度相似且穩(wěn)定，而T1、T3 組樣品聚類較疏松。 表明飼喂中草藥添加劑可以改變仔豬腸道微生物區(qū)系。

圖2 CLASS 水平糞便微生物群落柱形和主坐標(biāo)分析(PCoA)

4 討論

斷奶仔豬腹瀉是影響斷奶仔豬生長性能的重要原因，其中植物提取物，如多糖和精油等，能有效的緩解影響斷奶仔豬腹瀉問題[2]。完整的中草藥飼料添加劑配方可以在生產(chǎn)上發(fā)揮緩解應(yīng)激，調(diào)節(jié)機(jī)體消化吸收的作用，如車向榮、李小成和陳淑珍等[12-14]的研究中表明草藥飼料添加劑有緩解仔豬腹瀉的作用。 本試驗(yàn)的仔豬腹瀉率降低也證實(shí)這一觀點(diǎn)。

斷奶還會引起豬小腸絨毛高度的減少和隱窩深度的增加[15.16]。 根據(jù)對腸道組織形態(tài)測定結(jié)果分析可知，當(dāng)日糧中添加2 000 g/T 的中草藥制劑時(shí)會極為顯著的增加隱窩深度。但從近年研究結(jié)果來看，有關(guān)于中草藥飼料添加劑對于仔豬腸道組織形態(tài)的影響并不都是相同的結(jié)論。 陳清華等[17]研究表明與日糧中添加抗生素相比，添加0.1%牛膝多糖能顯著提高腸道各段的絨毛高度以及降低隱窩深度，而劉惠等[18]研究發(fā)現(xiàn)添加0.06%的白術(shù)多糖對于各小腸段的隱窩深度和絨毛高度沒有顯著性影響。 本試驗(yàn)中采用的中草藥飼料添加劑對于各腸段的絨毛高度沒有顯著性影響。 但當(dāng)日糧中加入2 000 g/T的中草藥飼料添加劑時(shí)會導(dǎo)致十二指腸和回腸隱窩加深，原因可能和中草藥種類，成分以及添加量等因素有關(guān)。

腸道上皮的變化和腸道通透性增加是胃腸道功能障礙和病理的潛在因素[19，20]。 上皮屏障功能受損會增加細(xì)胞旁的通透性可能會使毒素、細(xì)菌進(jìn)入全身組織，導(dǎo)致炎癥或免疫反應(yīng)[21]。 腸上皮屏障由各種不同的蛋白質(zhì)組成，這些蛋白質(zhì)也是檢測腸道屏障的重要指標(biāo)，如跨膜蛋白o(hù)ccludin、Claudin 和ZO - 1[22-24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在日糧中添加中草藥飼料添加劑，可以顯著增加小腸段的ZO -1 和Claudin-1 基因的mRNA 相對表達(dá)水平，提示中草藥添加劑能顯著提高對腸道屏障功能。

植物提取物可降低豬的腹瀉發(fā)生率，主要是因?yàn)樘崛∥锶缍嗵呛椭参锞偷染哂锌咕匦浴?當(dāng)然不僅僅是抗菌性，中草藥添加劑還具有其他重要特性，如抗炎作用和免疫調(diào)節(jié)特性，可改善腸道免疫功能[25]。 在免疫功能方面，促炎細(xì)胞因子，如TNF - α、IL - 2 和IL-10，以及免疫器官作為淋巴細(xì)胞生成的場所，是檢測免疫功能的重要指標(biāo)。 陳雁南等[26]和陳強(qiáng)等[27]的研究結(jié)果顯示，在仔豬日糧中添加復(fù)方中草藥飼料添加劑能極顯著的提高仔豬脾臟重和脾臟指數(shù)，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。 在日糧中添加中草藥飼料添加劑，其中小腸段的IL-10，IL -2 和TNF -α 表達(dá)基因的顯著提高，能快速反應(yīng)小腸黏膜內(nèi)的炎癥，可以起到抗炎和免疫調(diào)節(jié)的作用。 本試驗(yàn)中，日糧中添加中草藥飼料添加劑對免疫功能相關(guān)表達(dá)基因也有提升的趨勢，與易延彬的研究結(jié)果基本一致[28]。

本研究發(fā)現(xiàn)日糧中添加中草藥添加劑能顯著改變盲腸和結(jié)腸的腸道菌群，更好的維持仔豬腸道健康。 在日糧中添加2 000 g/T 中草藥添加劑后斷奶仔豬小腸絨毛高度有增加的趨勢，這不僅是飼喂中草藥添加劑本身的成分的作用，可能還有腸道菌群的相關(guān)影響[8]。 同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群在維持黏膜內(nèi)環(huán)境平衡中起著關(guān)鍵作用，影響腸道以外的免疫功能[30]。微生物組成的改變會導(dǎo)致免疫刺激增強(qiáng)、上皮功能障礙或黏膜通透性增強(qiáng)等現(xiàn)象[31，32]。 如致病性大腸埃希菌會釋放毒素影響腸道黏膜，破壞微生物群和宿主腸道細(xì)胞之間的相互作用[33]。 結(jié)合上面的討論，日糧中添加中草藥飼料添加劑能有效平衡腸道菌群，達(dá)到緩解仔豬腹瀉，增強(qiáng)TNFα、IL -2 和IL -10 的基因表達(dá)能力，增加血液中IL -2 的含量。 日糧中添加中草藥飼料添加劑可以降低仔豬的腹瀉發(fā)生率，提高抗炎作用和免疫調(diào)節(jié)的特性，改善腸道免疫功能。

5 結(jié)論

本研究證實(shí)，在日糧中添加1 000g/T 該復(fù)方中草藥飼料添加劑能提高仔豬的生產(chǎn)性能，緩解仔豬斷奶腹瀉，增強(qiáng)仔豬免疫能力，同時(shí)穩(wěn)定仔豬腸道微生物菌群。