李清竹，吳長德

(1. 遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧 沈陽 110866)

仔豬大腸埃希菌病是由致病性大腸埃希菌感染仔豬引起的，臨床上以排出黃白色稀便為特征的疾病。 大腸埃希菌病是危害養(yǎng)豬業(yè)最重要的細(xì)菌性疾病之一，也是導(dǎo)致初生仔豬死亡最常見的原因，尤其是1 周齡內(nèi)的仔豬感染后，病死率極高。 雖然仔豬大腸埃希菌病可以使用抗生素治療，但由于抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的長期、大量、不合理地使用，致使大腸埃希菌新的耐藥菌株不斷產(chǎn)生，耐藥譜不斷擴(kuò)大，尤其是多重耐藥菌株的大量出現(xiàn)，導(dǎo)致本病的防控越來越困難。 本研究對(duì)遼寧地區(qū)某規(guī)?；i場腹瀉仔豬進(jìn)行了大腸埃希菌分離鑒定，并對(duì)其致病力和耐藥性進(jìn)行了研究，以期為遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌病的防控提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)對(duì)象來源

遼寧某規(guī)模化種豬場3 日齡發(fā)病仔豬。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

體重為(20 ±1 g) SPF 級(jí)昆明小鼠，購自遼寧長生生物公司。

1.3 主要試劑

藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒，購自天根生化科技 (北京) 有限公司；DL - 2000Marker、2 ×TaqMasterMix，購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，購自青島高科技工業(yè)園海博生物科技有限公司。

1.4 主要儀器

隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；梯度PCR 儀，德國analytik jena公司；電泳儀，美國Bio -Rad 公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)和純化

無菌采集病死豬的肝臟接種于麥康凱瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，觀察菌落形態(tài)，挑取單一菌落進(jìn)行革蘭染色、鏡檢。從麥康凱瓊脂平板上挑取單一典型菌落，接種于5 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 ～18 h，觀察細(xì)菌生長情況，革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.2 生化試驗(yàn)

將麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落接種于各細(xì)菌微量生化鑒定管中，37 ℃培養(yǎng)24 h 以上后觀察結(jié)果。

2.3 細(xì)菌16SrDNA 的鑒定

以分離菌的基因組DNA 為模板，采用16S rDNA 通用引物(具體見表1)，10 μL 擴(kuò)增體系為: 2 ×Taq PCR Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，模板1 μL，ddH2O 3.6 μL。擴(kuò)增程序?yàn)? 95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)，72 ℃再延伸5 min。 將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1 % 瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。將PCR 結(jié)果陽性的產(chǎn)物送生工生物工程 ( 上海) 股份有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中比對(duì)。

表1 PCR 基因擴(kuò)增的引物信息

2.4 分離菌藥敏試驗(yàn)

藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) (Clinical andLaboratory Standards Institute，CLSI) 制定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，藥敏結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)按NCCLS2010 年標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行判斷。

2.5 分離菌致病性試驗(yàn)

取SPF 昆明鼠20 只，隨機(jī)分為對(duì)照組(10 只) 和試驗(yàn)組(10 只)；用PBS 稀釋營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)12 h 的菌液，使菌液濃度為2.5 ×109cfu/mL，試驗(yàn)組每只腹腔注射菌液0.3 mL，對(duì)照組每只腹腔注射無菌PBS 0.3 mL，接種后每12 h 觀察并記錄小鼠的發(fā)病情況，對(duì)病死鼠及時(shí)進(jìn)行剖檢，觀察病理變化，并無菌采集肝臟，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察菌落形態(tài)，革蘭氏染色，鏡檢，以確定小鼠死亡原因。

2.6 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)2.3 和2.4 試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)GenBank 中已經(jīng)發(fā)表的大腸埃希菌的氨基糖苷類耐藥基因aac (6') -Ⅰb、aac (3') -Ⅱ、armA，β-內(nèi)酰胺類blaSHV、blaTEM、CTX-M，氟喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB、ermC、mefA；毒力基因Iss、iucD、FimH、irp2，由生工生物工程(上海) 股份有限公司設(shè)計(jì)合成引物，引物信息見表1。

2.7 耐藥基因的檢測

分離菌的基因組DNA 為模板，擴(kuò)增體系(10 μL) 為: 2 ×TaqMasterMix5 μL，上、下游引物各0.2 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 3.6 μL；擴(kuò)增程序?yàn)? 94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸1min，共35 個(gè)循環(huán)；72℃再延伸5min。 將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

2.8 毒力基因的檢測

以分離菌的基因組DNA 為模板，擴(kuò)增體系 (10 μL) 為: 2 × TaqMasterMix5μL，上、下游引物各0.2 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 3.6 μL；擴(kuò)增程序?yàn)? 94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。 將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鏡檢結(jié)果

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成粉紅色、邊緣平滑的菌落；營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基明顯渾濁，試管底部見少量白色沉淀。 對(duì)麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上的單菌落及營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，可見革蘭氏陰性中等大小桿菌，符合大腸埃希菌形態(tài)特征。

3.2 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、乳糖等細(xì)菌發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果均為陽性，酚紅試驗(yàn)和M. R試驗(yàn)結(jié)果陽性，V -P 和H2S 試驗(yàn)以及檸檬酸鹽利用試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，生化試驗(yàn)結(jié)果符合大腸埃希菌特性。

3.3 分離菌株16srDNA 的檢測

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳顯示:擴(kuò)增片段在1 500 bp 左右，與預(yù)期結(jié)果相符(見圖1)。 將PCR 產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測序，結(jié)果: 分離菌16SrDNA 全長1 432 bp，測序結(jié)果與NCBI 中登錄號(hào)為CP031919.1 (其血清型為O145) 基因序列同源性最高，為99.44%，表明分離菌株為血清型O145 大腸埃希菌。

圖1 16srDNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

3.4 藥敏試驗(yàn)

分離菌株對(duì)頭孢噻肟敏感；對(duì)阿米卡星中敏；對(duì)多黏菌素B、頭孢唑啉、阿奇霉素、阿莫西林、大觀霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、多黏菌素E、利福平、復(fù)方磺胺甲唑和多西環(huán)素等11 種藥物均耐藥，見表2。

表2 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3.5 致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組小鼠接種后12 h 出現(xiàn)癥狀，16 h開始小鼠陸續(xù)死亡，至36 h 全部死亡。 從死亡小鼠的肝臟中分離病原菌與接種的菌株比較，菌落形態(tài)和染色鏡檢結(jié)果一致。

3.6 耐藥基因的檢測

結(jié)果如圖2 ～圖5 所示，氨基糖苷類耐藥基因aac (6') -Ⅰb、aac (3') -Ⅱ；β -內(nèi)酰胺類blaTEM；氟喹諾酮類耐藥基因qnrA；大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳顯示: 擴(kuò)增片段分別在370 bp、482 bp、859 bp、627 bp、639 bp 左右，與預(yù)期結(jié)果相符。 陽性PCR 產(chǎn)物送生工生物工程(上海) 股份有限公司測序，結(jié)果與Gen Bank 中公布的目的基因序列一致，說明該菌株攜帶aac (6') -Ⅰb、aac (3') -Ⅱ、bla-TEM、qnrA 和ermB 等耐藥基因。

圖2 氨基糖苷類耐藥基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖3 β-內(nèi)酰胺類耐藥基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖4 氟喹諾酮類耐藥基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖5 大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

3.7 毒力基因的檢測

結(jié)果如圖6 所示，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示: PCR 擴(kuò)增片段分別在309 bp、508 bp、700 bp 左右出現(xiàn)目的條帶，陽性PCR 產(chǎn)物送生工生物工程(上海) 股份有限公司測序，結(jié)果與Gen Bank 中公布的目的基因序列同源性最高，說明該菌株攜帶Iss、FimH、iucD 毒力基因。

圖6 毒力基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

4 討論

近年來，伴隨著養(yǎng)殖規(guī)模和飼養(yǎng)密度的不斷擴(kuò)大，疫病成為養(yǎng)殖業(yè)最大的瓶頸，尤其是2018 年的非洲豬瘟在我國的暴發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的挑戰(zhàn)。 抗生素是養(yǎng)殖過程中控制細(xì)菌性傳染病最有效的方法，但是，由于養(yǎng)殖過程中抗生素的濫用，導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性越來越嚴(yán)重，而且經(jīng)常出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象[1，2]。 本研究從規(guī)?；i場3 日齡腹瀉仔豬分離得到的大腸埃希菌除了對(duì)頭孢噻肟敏感、對(duì)阿米卡星中敏之外，對(duì)多黏菌素B、頭孢唑啉、阿奇霉素、阿莫西林、大觀霉素、環(huán)丙沙星、紅霉素、多黏菌素E、利福平、復(fù)方磺胺甲唑和多西環(huán)素等11 種藥物均呈現(xiàn)耐藥，而且很多藥物抑菌圈是零，因此，導(dǎo)致仔豬大腸埃希菌病等細(xì)菌性傳染病的治療越來越困難。 細(xì)菌所攜帶的毒力基因與其致病性密切相關(guān)[3-5]，毒力基因的攜帶和傳播，是防控仔豬致病性大腸埃希菌病最大的難題。 孔科委等(2014) 研究表明[6]，在毒力較強(qiáng)大腸埃希菌中，iss 基因的PCR 擴(kuò)增頻率高達(dá)92.8%，而在無致病力(或低毒力) 大腸埃希菌中的PCR 擴(kuò)增頻率僅為16.7%。 本研究分離出的大腸埃希菌與腸外致病性大腸埃希菌O145 同源性最高，而腸外致病性大腸埃希菌都具有極強(qiáng)的毒力。 周磊等(2021)[7]對(duì)28 株腸外致病性大腸埃希菌相關(guān)毒力基因進(jìn)行了檢測，結(jié)果fimH、iucD、iss等基因出現(xiàn)的頻率都超過50%，說明fim H、iucD、iss 等基因與大腸埃希菌致病性密切相關(guān)。 此外，不同地區(qū)豬源腸外致病性大腸埃希菌優(yōu)勢血清型存在差異，廣東地區(qū)以O(shè)101 和O157 為優(yōu)勢[8]，河南地區(qū)以O(shè)8、O9、O11、O26、O101、O138 和O161 為優(yōu)勢[9]，河北地區(qū)以O(shè)53、O93 和O157 為優(yōu)勢[10]，黑龍江地區(qū)以O(shè)8、O78 和O120 為優(yōu)勢[11]，而遼寧地區(qū)目前還沒見報(bào)道。 本試驗(yàn)分離菌株與CP031919.1 (血清型為O145 大腸埃希菌) 基因序列同源性最高，而且致病力極強(qiáng)，耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，并出現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象。 本試驗(yàn)的研究結(jié)果為進(jìn)一步研究遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌優(yōu)勢血清學(xué)型毒株提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為下一步研制針對(duì)遼寧地區(qū)乃至全國大腸埃希菌主要流行菌株同血清型疫苗提供了參考。