倪 超，魏 澍，馮壽華

(1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2. 遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽 110164)

非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF) 是由非洲豬瘟病毒 (African Swine Fever Virus，ASFV) 引起的一種高致病性傳染病。 根據(jù)毒力不同，ASFV 可以分為高致病性、中等毒力、低毒力以及感染無臨床癥狀毒株，其中尤以高致病性ASFV 感染在臨床上最為普遍[1]，高致病性病毒感染的臨床表現(xiàn)多為發(fā)熱，食欲廢絕，呼吸困難，腎、脾、淋巴結(jié)等器官的廣泛性出血，急性感染可導(dǎo)致家豬死亡率近100%[2]。 世界動物衛(wèi)生組織(OIE) 將ASFV列為法定報告的動物疫病之一，目前，ASF 尚無有效的商品化疫苗可以預(yù)防，也不存在有效的藥物進(jìn)行治療，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)只能大規(guī)模撲殺，給生豬產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟影響。 我國對ASF極為重視，并將ASF 列入優(yōu)先防范的13 種重大外來動物疫病。

1 ASF 病原學(xué)

1.1 ASFV 基因組

ASFV 基因組由單分子線性、共價封閉的雙鏈DNA 組成。 不同種類毒株的基因組長度在170 ～190 kbp，編碼151 ～167 個ORF (開放閱讀框)[3]，基因組保守區(qū)長約125 kb，其左側(cè)48 kb 與右側(cè)22 kb 迥然不同，主要體現(xiàn)在中間區(qū)域，這也是直接導(dǎo)致不同非洲豬瘟病毒分離株基因長度出現(xiàn)差異的主要癥結(jié)所在[4]。 ASFV 是一種大型的胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制的病毒，200 nm 直徑的ASFV 粒子呈二十面體對稱，表現(xiàn)為同心圓狀結(jié)構(gòu)[5]，病毒粒子由該基因組完成基因早期轉(zhuǎn)錄所需要的酶以及部分DNA 結(jié)合蛋白組成[6]。 ASFV 可以歸類為核質(zhì)大DNA病毒 (Nucleocytoplasmic Large DNA Viruses，NCLDV) 超家族成員之一。 屬于非洲豬瘟病毒屬，是該屬中唯一成員[7]，也是唯一的蟲媒DNA 病毒。

ASFV 對高溫、腐敗和干燥具有極高的抵抗力[8]。 但也有研究表明，ASFV 在60 ℃時僅15 min 就無法檢驗到病毒粒子[9]，使用脂溶劑及部分對苯基苯酚消毒劑滅活病毒效果較好。

1.2 ASFV 主要蛋白

有研究者發(fā)現(xiàn)，ASFV 所編碼的蛋白中存在多種病毒蛋白能夠誘導(dǎo)感染豬只產(chǎn)生免疫應(yīng)答(五十幾種蛋白)[10，11]。 有學(xué)者利用非洲豬瘟病毒編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，鑒定出的68 種蛋白質(zhì)，占ASFV 基因組編碼能力的39%，其中大部分是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白且至少有54 個[12，13]。 ASFV 的主要致病結(jié)構(gòu)就是衣殼和囊膜，衣殼蛋白主要包括p72 (B646L)和p49 (p B438L)；p12 (O61R)、CD2v、p54( E183L )、p22 ( KR177R )、EP248R、PEP402R、EP199L 和p17 (D117L) 是主要的囊膜蛋白。 目前報道較多主要的結(jié)構(gòu)蛋白p30、p54、p72 等，而研究較少的 pDP71L、pA238L、pE296R 等則屬于典型的非結(jié)構(gòu)蛋白。p72 與p17 是衣殼、內(nèi)膜蛋白的代表蛋白[14]。

圖1 ASFV 的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)組成

ASFV p72 蛋白，它是ASFV 最具代表性、研究最多、最具免疫原性的衣殼蛋白之一，由B646L 基因編碼[15]。 B646L 基因可用于毒株分型與追溯毒株來源，研究病毒的同源與進(jìn)化，p72 蛋白通常在病毒復(fù)制周期的后期表達(dá)[16]。已有實驗表明，重組的p72 載體免疫原性與反應(yīng)原性較好。 可以作為潛在的候選疫苗[17]。

ASFV P17 蛋白是一種病毒內(nèi)囊膜上的晚期膜蛋白，由ASFV D117L 基因編碼，分子量為13.1 kDa 左右[18]。 對于ASFV 的活力而言，p17 非常重要，并且對于病毒前體膜形成二十面體的過程非常關(guān)鍵[19]。 研究表明，p17 表達(dá)被抑制，會造成病毒編碼的pp62 和pp220 水解加工受阻，導(dǎo)致其不能被正常切割而無法成熟，影響其到類核核芯殼的組裝，并最終導(dǎo)致病毒的二十面體顆粒出現(xiàn)缺陷[20]。

CD2v 蛋白，一種類似于CD2 的蛋白，具有病毒黏附作用 (T 淋巴細(xì)胞表面黏附受體)[21]，該蛋白由ASFV EP402R 基因編碼。由ASFV ORF E183L 基因編碼的p54 蛋白是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，具有良好的抗原性，病毒粒子攻入動物機體后會刺激針對該蛋白的抗體形成，具有一定的保護(hù)作用，也有報道稱該蛋白與細(xì)胞的凋亡有關(guān)[22，23]。

CP204L 基因編碼的ASFV p30 蛋白，是一種磷酸蛋白。 p30 蛋白的主要功能是改變異質(zhì)核糖核酸蛋白K (hnRNP -K) 在亞細(xì)胞層面的分布，并可能參與ASFV 感染過程中與mRNA 加工和輸出相關(guān)的hnRNP - K 功能的調(diào)控[24]。 據(jù)UnitPro 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)顯示，p30 蛋白在ASFV 不同的分離株中表現(xiàn)出不同的蛋白大小。 ASFV p30 蛋白通常在病毒感染早期大量表達(dá)，亞細(xì)胞定位于宿主細(xì)胞的核與質(zhì)。 并且存在有翻譯后修飾現(xiàn)象，通常在第115 個N 端氨基酸的絲氨酸殘基上進(jìn)行磷酸化[25]。

2 ASFV 流行病學(xué)

ASF 疫情首次報道于1921 年的非洲肯尼亞地區(qū)，2018 年該病毒開始在我國大范圍暴發(fā)[26，27]。 ASF 已經(jīng)蔓延了幾十年。 自2018 年以來，已有包括我國在內(nèi)的14 個國家報告了3 797 例非洲豬瘟病例，其余13 個國家分別為波蘭、俄羅斯、拉脫維亞、捷克共和國、羅馬尼亞、摩爾多瓦、烏克蘭、匈牙利、保加利亞、比利時、南非、科特迪瓦和贊比亞[28]。中國于2018 年在遼寧省出現(xiàn)首例ASF 后[29]，ASF 疫情就在我國多地蔓延并暴發(fā)，截至目前，全國已發(fā)生ASF 疫情200 余起，商品化疫苗的匱乏加之防治措施的不完善使得我國對于ASF 疫情的防控納履踵決，短期內(nèi)病毒將難以徹底根除，ASF 疫情依然是當(dāng)前生豬養(yǎng)殖業(yè)面臨的主要風(fēng)險。

圖2 非洲豬瘟的傳播過程

非洲豬瘟的流行與病毒毒株、宿主、野豬(天然宿主) 分布、地理區(qū)域、蜱的活動以及環(huán)境因素具有相關(guān)性[30]。 ASFV 感染包括家豬、各種野豬等多種豬科動物[31]。 病毒感染的歐洲野豬表現(xiàn)出與家豬感染時相似的癥狀[32]。 而非洲野豬在感染病毒時通常不表現(xiàn)出癥狀，只隱性帶毒，能夠貯存病毒，因此野豬與軟蜱形成的“森林循環(huán)”，是引起ASFV傳播的重要環(huán)節(jié)之一[33]。 在天然宿主中，ASFV 呈現(xiàn)持續(xù)感染趨勢，并且沒有任何明顯癥狀。 感染ASFV 的家豬有別于野豬，ASFV 會造成家豬致命性的出血熱。

3 非洲豬瘟診斷技術(shù)

當(dāng)前，仍然無法通過疫苗免疫來對非洲豬瘟的防控達(dá)到預(yù)期效果，所以，高效、準(zhǔn)確的診斷對于該病早期提示與防控?fù)碛兄匾饬x。ASFV 基因型與血清型的多種多樣，給疾病的早期診斷帶來巨大困難。 國際獸疫局(OIE)推薦的非洲豬瘟的實驗室診斷技術(shù)主要包括:病毒分離、常規(guī)和實時熒光定量PCR 檢測、熒光抗體檢測(FAT)[34]，現(xiàn)階段，均是針對ASFV 的結(jié)構(gòu)蛋白及其編碼基因開發(fā)的診斷與檢測技術(shù)[35]，最為常用的病原學(xué)診斷和更為精準(zhǔn)的血清學(xué)診斷仍是目前該病應(yīng)用最為廣泛的檢測手段。

3.1 病原學(xué)診斷技術(shù)

病原學(xué)診斷技術(shù)主要是通過病原體確定的檢測方法，它的優(yōu)勢體現(xiàn)在非洲豬瘟疫情暴發(fā)的前期能夠檢測出帶毒的可疑動物。 在ASF 的病原學(xué)診斷技術(shù)中，病毒分離 (Virus isolation) 是首要的病原學(xué)診斷技術(shù)，被視作檢測金標(biāo)準(zhǔn)，成功分離ASFV 可以對毒株基因型、生物學(xué)特性以及可能的傳入來源進(jìn)行分析。 但是，由于ASF 屬于一類動物疫病，分離ASFV過程中耗費時間與資源，因此，病毒分離通常只應(yīng)用在診斷和進(jìn)一步的分子研究過程[36]。ASFV 能夠感染豬外周血白細(xì)胞并在其中復(fù)制，感染后的白細(xì)胞能夠吸附紅細(xì)胞[37]。 紅細(xì)胞吸附實驗 (haemadsoptiontest，HAO) 是鑒定ASFV 是最敏感的一種方法，但也存在耗時又費力的缺陷。 迄今應(yīng)用最為廣泛的分子生物學(xué)檢測手段就是PCR 技術(shù)，主要由變性、退火以及延伸三個步驟組成，也會設(shè)置預(yù)變性和總延伸兩個條件。 在特定引物的作用下可以放大目的DNA 片段，通過基因測序確定目的基因的序列。 PCR 方法具有特異性強，靈敏度高，而且操作簡便，省時省力的優(yōu)點。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(loop - mediated isothermal amplification，LAMP) 技術(shù)，這種方法需要設(shè)計4 個引物和一種DNA 聚合酶，這種酶必須具備鏈置換活性。 在恒定溫度的條件下，這種方法可以特異、高效、快速地擴增目的基因[38]。 韋瑩華等選擇ASFV 的B646L 基因作為檢測的靶標(biāo)，利用Real -time LAMP 確定引物擴增的特異性和效率，并在此基礎(chǔ)上，對兩種ASFV 進(jìn)行了可視化染料的選擇和顯色條件的優(yōu)化，進(jìn)而建立了兩種ASFV 的等溫比色分析方法，真實樣本基因組可以在短時間內(nèi)完成檢測，檢測結(jié)果可通過肉眼判斷[39]。

3.2 血清學(xué)診斷技術(shù)

為了避免假陽性結(jié)果的干擾，依賴抗原抗體的血清學(xué)檢測技術(shù)仍然在疫病確診中起到重要作用。 血清學(xué)診斷技術(shù)的操作簡便、微量、高效使得其成為近年來使用最頻繁應(yīng)用最廣泛的檢測技術(shù)之一。 OIE 當(dāng)前階段批準(zhǔn)的基于ASFV 抗體的檢測方法主要包括ELISA (酶聯(lián)免疫吸附試驗)、Western Blot (免疫印跡實驗)、IIF (間接免疫熒光技術(shù))，IPT (間接免疫過氧化物酶檢測) 等[40，41]。 ASF 血清學(xué)診斷中常用的是ELISA 法，因為不僅可以檢測血清，還可以用于檢測組織液。 為了保證診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，ELISA 法檢測為陽性的樣品，還會用免疫印跡等方法再次進(jìn)行確證。 在大規(guī)模血清普查時ELSIA 與對流免疫電泳具有優(yōu)勢。ELISA 通常用于初篩，Western Blot、IIF 和IPT方法用于進(jìn)一步鑒定。

3.3 液相蛋白芯片檢測技術(shù)

有著生命科學(xué)“登月計劃” 的人類基因組計劃最早由美國科學(xué)家提出，但直至1990 年才正式啟動[42]。 這一計劃的循序漸進(jìn)，使得生物芯片技術(shù)從此欣欣向榮。 從最初生物芯片概念的形成到1995 年的迅猛發(fā)展，生物芯片技術(shù)極大地促進(jìn)了生命信息領(lǐng)域的進(jìn)步，當(dāng)前，該技術(shù)在疾病診斷及藥物研發(fā)等方面均得到了廣泛的研究和應(yīng)用[43]。 生物芯片(Biochips) 是一種基于生物分子之間高特異性作用的機理，融合了微電子、生物化學(xué)、微加工和計算機等多學(xué)科研究成果的一項檢測技術(shù)。 它具有廣闊的應(yīng)用前景，區(qū)別于傳統(tǒng)的分析檢測手段，其構(gòu)建的芯片將生物化學(xué)分析反應(yīng)過程高度整合到一個載體上，可實現(xiàn)對成千盈百種核酸、小分子多肽與蛋白質(zhì)等分子的高通量分析和檢測。 蛋白芯片、基因芯片及芯片實驗室是生物芯片的三大分支領(lǐng)域[44]。 隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷細(xì)化，大規(guī)模、高通量的蛋白質(zhì)分析必不可少，而蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的問世與完善恰好解決了這個問題。

蛋白芯片是將各種蛋白質(zhì)固定于某一固相載體之上，用于對被測樣本中與其發(fā)生特異性反應(yīng)的組分進(jìn)行分析。 該項技術(shù)又稱為蛋白質(zhì)微陣列，從20 世紀(jì)開始出現(xiàn)并被應(yīng)用，它是一門微電子、微機械、化學(xué)等與生命科學(xué)結(jié)合的新興技術(shù)[45]，作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究工具，蛋白質(zhì)微陣列所表現(xiàn)出的高通量、高靈敏度、高特異性等特點比傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法(二維凝膠電泳和酵母雙雜交技術(shù)等) 更具有優(yōu)勢[46]。

液相蛋白芯片檢測技術(shù)作為蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)與流式細(xì)胞術(shù)相嵌合的一種新型多通道高通量生物芯片檢測體系新技術(shù)；該技術(shù)將流式細(xì)胞術(shù)、激光、熒光編碼微球、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)的生物化學(xué)技術(shù)融為一體，將核酸探針、抗原或抗體等生物分子包裹在特殊的微球(聚苯乙烯微球或磁性微球) 上，在液相中與待測物結(jié)合，并添加熒光標(biāo)記的報道分子，最終在流式細(xì)胞儀的協(xié)助下檢測微球表面熒光標(biāo)記物[47-50]。 與傳統(tǒng)的檢測技術(shù)相比，液相蛋白芯片檢測技術(shù)具有較多優(yōu)點，它能對一個樣本，也就是一個反應(yīng)體系，同時檢測500 個目標(biāo)；并且還能對樣本中所含的痕量待檢物進(jìn)行同時測定，具有很高的靈敏度性。 最重要的是它還具有節(jié)約樣品、線性范圍廣、準(zhǔn)確性和低成本等特點。

3.3.1 液相蛋白芯片檢測技術(shù)原理 液相蛋白芯片檢測技術(shù)的運載器是聚苯乙烯微球(直徑為5. 6μm)，現(xiàn)有的微球可分為四大類:xTAG 微球、SeroMap 微球、MagPlex 和Micro Plex 微球。 運用Flex map 三維(Flex map 3D)技術(shù)生產(chǎn)的微球含有3 個不同比例的熒光素，因此通過排列組合可以得到500 種微球。 利用該方法，我們將能夠在同一樣本上對500 個以上的靶標(biāo)分子進(jìn)行同時探測。 將羧基、組胺基等官能團連接到微球上，該官能團可與含有氨基、羧基等官能團的探針分子(抗原、抗體)結(jié)合，此官能團還可實時捕捉載體，實現(xiàn)對待測樣本中目標(biāo)分子的專一結(jié)合。 與此同時，該探針與藻紅蛋白的熒光報告基因結(jié)合，就實現(xiàn)了對該探針的快速、靈敏的檢測。 在讀數(shù)過程中，該裝置發(fā)出兩道激光，一道是紅光，用來鑒定微球自身的熒光，并識別其編號；藻紅蛋白熒光則由另一道綠光來識別，最終根據(jù)熒光的強弱來定量測定。 只有當(dāng)兩個光束都能探測到訊號時所測的結(jié)果才具有可信度，如此一來，其他物質(zhì)的干擾就會被排除。 除此之外，采用液相芯片技術(shù)檢測一個樣品時，每次系統(tǒng)會隨機測定100 個微球的熒光值，并以中間值作為熒光強度值(Median Fluorescent Intensity，MFI)[51，52]。

3.3.2 液相蛋白芯片檢測技術(shù)的應(yīng)用 基于Luminex x MAP 技術(shù)發(fā)展起來的液相芯片技術(shù)是國外Luminex 公司研制的一種新式生物芯片探測技術(shù)平臺，又稱為懸浮芯片技術(shù)[53]。 Luminex 100 是Luminex 公司首次發(fā)布的液相芯片測試系統(tǒng)，F(xiàn)lex map 3D、Luminex 200 技術(shù)是該公司2001 年之后相繼推出的檢測系統(tǒng)。 液相芯片經(jīng)過技術(shù)革新后，形成的Flex map 3D探測技術(shù)可對同一個靶標(biāo)中500 種目的分子進(jìn)行同時檢測，將多通路檢測技術(shù)又拓展到新的高度[54]。

后基因組測序期間，人類已積累了海量的基因組數(shù)據(jù)，對這些數(shù)據(jù)的后續(xù)研究及功能驗證受到了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。 迄今為止，發(fā)展高通量、更快速、高可靠性、更經(jīng)濟的快速檢測方法成為當(dāng)前亟待解決的問題。 在過去的十幾年里，液相蛋白芯片技術(shù)已逐漸成為一種新興的蛋白質(zhì)與基因組學(xué)研究的手段。 該技術(shù)所特有的高通量和高效率特點促進(jìn)了它在新藥物靶標(biāo)、疾病治療等方面研究，使它成為目前已知的更有效、更有前景的研究方法。 該項技術(shù)在人醫(yī)領(lǐng)域的應(yīng)用較為成熟，如Pandey Prashant 等在活體相關(guān)腎移植病例中，基于Luminex 對102 例病例特異性IgG I 類抗體MFI 值的比較分析[55]；Espinosa 等也基于Luminex 技術(shù)以分析血清IP -10 作為狼瘡活性生物標(biāo)志物方面的性能[56]。 目前，液相蛋白芯片檢測技術(shù)在致病微生物、毒素以及致敏性物質(zhì)的檢測中也得到了廣泛的應(yīng)用[57，58]。 液相蛋白芯片檢測技術(shù)在呼吸道、蟲媒介等病毒檢測[59，60]、細(xì)菌檢測[61]、基因檢測[62]、藥物殘留[63]、細(xì)胞因子檢測[64]等許多領(lǐng)域均得到了廣泛的應(yīng)用。同時，這也是美國食品藥品監(jiān)督管理局所認(rèn)可的唯一一項診斷技術(shù)[65]。 由此可見，以液相蛋白芯片技術(shù)為主的檢測手段，已逐步形成一種新的發(fā)展方向，對其開展的研究與應(yīng)用同樣如火如荼。 這為ASFV 的診斷及防治提供了一定的技術(shù)儲備。

4 結(jié)語

ASF 的流行形勢及疫病情況十分復(fù)雜，對其進(jìn)行有效防控是我國生豬生產(chǎn)中的重要組成部分。 截至目前，我國32 個省市和自治區(qū)均發(fā)生ASF 疫情，對我國養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失。 由于缺乏有效的疫苗和藥物進(jìn)行防治，ASF 已成為制約我國養(yǎng)豬業(yè)健康、正向、穩(wěn)定發(fā)展的重要因素[66]。 目前，非洲豬瘟感染性病毒粒子的結(jié)構(gòu)已經(jīng)得到闡明，但大多數(shù)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的定位及功能的研究仍然需要進(jìn)一步的深化研究。 此外ASFV 基因組編碼了許多目前功能未知的蛋白 (如 H240R、E184L、K145R 等在內(nèi)的17 種蛋白)[17]，這些還沒有被完全了解的蛋白在逃避宿主的免疫反應(yīng)過程中同樣具有重要作用，也同樣具有研究價值[67]。 疫苗接種是預(yù)防ASFV 最有效的方法之一，然而，現(xiàn)階段，卻沒有商業(yè)化的疫苗能夠預(yù)防ASFV 的傳播，因此，對ASF 的控制仍是通過檢疫和撲殺來完成。 在過去的幾十年間，人們嘗試了不同的疫苗研制策略，但收效甚微，當(dāng)下，ASF 疫苗的研究熱點主要集中在開發(fā)自然減毒疫苗和基因工程活毒疫苗等方面[68，69]。 研制低毒性、高效價、且適合群體免疫的ASF 商業(yè)化疫苗(亞單位疫苗，多肽疫苗等) 是未來需要繼續(xù)深耕的重要方向。 從全球范圍來看，ASFV 的發(fā)展趨勢仍未見平息，對于ASF 疫情的監(jiān)測和控制應(yīng)是我國應(yīng)對該病毒的主要著力點。 盡管P30、P72、P54 等重要結(jié)構(gòu)蛋白具有作為ASFV 診斷目標(biāo)的潛力[21]，但這些蛋白始終不足以產(chǎn)生應(yīng)對ASF 不同毒株的抗體介導(dǎo)保護(hù)作用[70]。 因此，未來ASFV 新型檢測技術(shù)的開發(fā)多集中于在高通量、低成本、操作簡單、便捷以及可重復(fù)性等方向，同時，應(yīng)具備高特異性和高敏感性，能夠更好地適應(yīng)一線疫情現(xiàn)場檢疫。 這對全球ASF 的有效防控具有重要意義。