張小雨,靳文慧,王 佳,王玉濤

(喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院/新疆帕米爾高原生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆喀什 844000)

葉爾羌河位于新疆塔里木盆地的西南面,起源于世界第二大高峰——喬戈里峰,屬于塔里木河水系[1-2]。流域內(nèi)分布的魚類主要為鯉形目的鯉科和鰍科,土著魚以高原鰍屬和裂腹魚屬為主,普通經(jīng)濟(jì)魚類由鯉魚、草魚、鯽魚等構(gòu)成[3]。目前,與葉爾羌河流域相關(guān)的研究日益增多,主要集中在水利水電工程[4]、環(huán)境科學(xué)和資源利用[5]等方面,但從分子水平對(duì)該流域魚類資源狀況的研究鮮見報(bào)道。因此選取適宜的方法對(duì)該流域魚類資源進(jìn)行鑒定及進(jìn)一步的系統(tǒng)進(jìn)化分析極為重要。

王德忠[6]、楊天燕等[7]、陳生熬等[8]均通過形態(tài)學(xué)的方法分別分析了新疆裂腹魚的分布特性和遺傳差異以及葉爾羌高原鰍的種群結(jié)構(gòu)。李國(guó)剛等[9]也曾對(duì)塔里木河等水系的土著魚類資源展開調(diào)查,發(fā)現(xiàn)了水系的特有魚類。隨著種質(zhì)資源鑒定技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展[10]。其中,COI(線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基 Ⅰ )基因的引物通用性和進(jìn)化速度[11]均處于較高水平,而且它的5′端序列的種間差異顯著高于種內(nèi),所以,mtDNA基因被視為物種鑒定的理想基因條形碼之一[12]。2003年,Hebert等[13]首次提出COI基因可以作為基因條形碼對(duì)物種進(jìn)行有效鑒定的觀點(diǎn)。此后,Gomes等[14]利用COI基因?qū)ε佬蓄愇锓N和魚類進(jìn)行鑒定,說明COI基因作為遺傳標(biāo)記鑒定物種的有效性。閆亞利等[15-17]也選擇COI基因?qū)︳~類種質(zhì)鑒定進(jìn)行研究。該研究基于COI基因序列對(duì)葉爾羌河流域5種鯉科魚類的遺傳多樣性進(jìn)行分析,探討COI基因作為分子標(biāo)記對(duì)葉爾羌河魚類進(jìn)行鑒定的有效性和適應(yīng)性,有助于對(duì)葉爾羌河魚類資源狀況展開調(diào)查,為該流域魚類資源的合理開發(fā)及利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料從塔什庫(kù)爾干縣、麥蓋提縣等地的葉爾羌河流域采集魚類樣品共50尾。參照《新疆魚類志》[18]對(duì)采集的魚類樣本進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定,拍照記錄每個(gè)樣本,并剪取魚鰭組織浸泡于95%無(wú)水乙醇,分組編號(hào)后保存于-80 ℃冰箱。

1.2 DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序利用傳統(tǒng)的酚-氯仿法,提取葉爾羌河5種魚類魚鰭或魚肉組織的DNA。該研究相關(guān)引物采用魚類通用引物(FISH-F1:5′-TCAACCAACCACAAAAAGACATTGGCAC-3′;FISH-R1:5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′;FISH-F2:5′-TCGACTAATCATAAAGGATATCGGCAC-3′;FISH-R2:5′-ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA-3′)[19]擴(kuò)增COI片段。PCR反應(yīng)體系為20 μL,包括2×TaqPCR Mix 12 μL、上下游引物(10 mmol/L)各0.4 μL、DNA模板1 μL、ddH2O加至20 μL;PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性30 s,58 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,以上步驟經(jīng)35個(gè)循環(huán)之后,再72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),合格后送樣測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理使用Chromas軟件查看正反雙向測(cè)序結(jié)果峰圖,然后使用DNAStar軟件包進(jìn)行序列的拼接、比對(duì)和校對(duì);利用DnaSP 5.10軟件計(jì)算葉爾羌河5種魚類群體單倍型,并統(tǒng)計(jì)變異位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性指數(shù)(Hd)、核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)、核苷酸差異數(shù)(K)等;采用MEGA 7.0軟件計(jì)算序列核苷酸組成和遺傳距離等,并結(jié)合下載的12條同源序列(具體信息見表1)基于NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 樣本名錄及相關(guān)信息

2 結(jié)果與分析

2.1COI基因序列特征該研究通過比對(duì)和分析葉爾羌河5種魚類樣本的COI基因片段序列,再結(jié)合從NCBI下載的12條已知的線粒體基因序列,最終保留675 bp的序列。分析結(jié)果表明(表2),葉爾羌河流5種鯉科魚類COI基因序列的平均堿基含量分別為T 28.4%、C 28.2%、A 25.6%、G 17.8%,其中鳥嘌呤含量最低,胸腺嘧啶含量最高,且5種魚類的COI基因片段序列的A+T含量明顯高于G+C,展現(xiàn)出顯著的A/T偏倚性。該研究序列中的變異位點(diǎn)146個(gè),沒有發(fā)現(xiàn)堿基的插入/缺失,平均轉(zhuǎn)換位點(diǎn)和顛換位點(diǎn)分別為41和13,平均堿基轉(zhuǎn)換/顛換(R值)為3.2。

2.2 遺傳多樣性分析對(duì)葉爾羌河5種魚類COI基因的Hd、Pi和K值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(表3),共發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)146個(gè),其中包括了145個(gè)簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn),1個(gè)單一多態(tài)位點(diǎn)。整體的Hd、Pi和K值分別為0.838、0.079 39和53.589。在單倍型多樣性指數(shù)(Hd)中,塔里木裂腹魚最高(Hd=0.509),鯉魚其次(Hd=0.500),均表現(xiàn)出較高的單倍型多樣性,而鯽魚(Hd=0.473)、斑重唇魚(Hd=0.286)和寬口裂腹魚(Hd=0.118)的單倍型多樣性指數(shù)則較低;在核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)中,鯽魚最高(Pi=0.003 18),寬口裂腹魚最低(Pi=0.000 17),表明葉爾羌河5種鯉科魚類群體的核苷酸多樣性均處于較低的水平。

表3 葉爾羌河5種魚類COI基因序列遺傳多樣性參數(shù)

通過MEGA 7.0軟件對(duì)葉爾羌河流域5種魚類的遺傳距離進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果表明(表4),該研究5種魚類的種內(nèi)遺傳距離為0～0.003 2,平均值為0.001 6,其中鯽魚的種內(nèi)遺傳距離最大(0.003 2);種間距離為0.002 4～0.150 5,平均值為0.088 8。其中,斑重唇魚和鯽魚的種間遺傳距離最遠(yuǎn)(0.150 5);塔里木裂腹魚和寬口裂腹魚的種間遺傳距離最小(0.002 4),推測(cè)與兩者親緣關(guān)系較近有關(guān)。

表4 基于COI基因序列的葉爾羌河流域魚類群體遺傳距離

2.3 單倍型分析采用DnaSP 5.10軟件檢測(cè)該研究中50個(gè)樣本的COI片段,一共獲得146個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),10個(gè)單倍型。其中,Hap1、Hap2在斑重唇魚中特有;Hap3、Hap5在塔里木裂腹魚中特有;Hap4在寬口裂腹魚中特有;Hap6、Hap7、Hap8在鯽魚中特有;Hap9、Hap10在鯉屬的鯉魚中特有。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建以黃顙魚(Tachysurusfulvidraco,MH317141.1)作為外群,采用鄰接法(neighbor-joining method,NJ)來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖1所示,該研究中的5種魚類在系統(tǒng)發(fā)育樹上的位置清晰,共分為4大支。其中,第一組寬口木裂腹魚(Schizothoraxeurystomus)和塔里木裂腹魚(Schizothoraxbiddulphi)聚為一支;第二組鯉魚(Cyprinuscarpio)聚為一支;第三組斑重唇魚(Diptychusmaculatus)聚為一支;第四組銀鯽(Carassiusgibelio)、鯽魚(Carassiusauratus)聚為一支。其中,鯽屬、重唇魚屬、鯉屬分別單獨(dú)形成一支,裂腹魚屬的寬口裂腹魚和塔里木裂腹魚則共聚為一大支,表明兩者的親緣系較近。

圖1 基于NJ法構(gòu)建的葉爾羌河5種魚類聚類關(guān)系Fig.1 Clustering relationship of five fish species in Yarkant River based on NJ method

3 結(jié)論與討論

該研究對(duì)葉爾羌河50個(gè)魚類樣本的線粒體COI基因序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示在堿基組成上,堿基T含量最高(28.4%),堿基G最低(17.8%),且堿基A+T的平均含量(54.0%)明顯高于G+C的平均含量(46.0%),這與張桂寧等[17,20-21]的研究結(jié)果類似,即表現(xiàn)出明顯的A/T堿基偏倚性,與魚類mtDNACOI基因序列的堿基特征相符。

遺傳多樣性的大小通常通過Hd和Pi判斷,兩者的數(shù)值越大表示遺傳多樣性越豐富[22]。1998年,Grant等[23]首次提出以0.5作為單倍型多樣性的臨界值,以0.005作為核苷酸多樣性的臨界值。該研究中,塔里木裂腹魚和鯉魚均表現(xiàn)出較高的單倍型多樣性(Hd≥0.5)和較低的核苷酸多樣性(Pi<0.005),表明其可能正處于群體的快速擴(kuò)張階段[24],任永麗[20]通過線粒體COII和ND4基因序列分析3個(gè)塔里木裂腹魚群體發(fā)現(xiàn)其單倍型多樣性和核苷酸多樣性均較高,推測(cè)可能是由于脊椎動(dòng)物不同線粒體基因序列的進(jìn)化速率不同[25]或與地理隔離有關(guān)。而斑重唇魚、寬口裂腹魚和鯽魚均表現(xiàn)出較低的單倍型多樣性(Hd<0.5)和核苷酸多樣性(Pi<0.005),推測(cè)其可能正經(jīng)歷群體瓶頸效應(yīng)[26]。

該研究中的葉爾羌河5種鯉魚類的種內(nèi)平均遺傳距離和種間平均遺傳距離分別是0.001 6和0.088 8,符合Hebert等[13]提出的種間遺傳距離需要大于種內(nèi)遺傳距離的10倍以上,這是利用mtDNACOI基因作為有效鑒定物種的前提。但是該研究中的塔里木裂腹魚與寬口裂腹魚群體之間的遺傳距離最小(0.002 4),遠(yuǎn)低于Herber等[27]提出的物種間最小遺傳距離(0.02),說明該研究中基于COI基因作為分子標(biāo)記未能成功區(qū)分塔里木裂腹魚和寬口裂腹魚,這與海薩·艾也力汗等[26]基于COI基因分析塔里木和流域裂腹魚屬的研究結(jié)果一致。此外,通過分析系統(tǒng)進(jìn)化樹表明,在屬的階元上,該研究中的鯉科4屬5種魚類,即重唇魚屬、裂腹魚屬、鯽屬和鯉屬分別聚為一支,分類明確。但是裂腹魚屬的塔里木裂腹魚和寬口裂腹魚的分類上并不是很清晰?？偟膩碚f,以mtDNACOI基因作為分子標(biāo)記,對(duì)葉爾羌河魚類進(jìn)行種質(zhì)鑒定和多樣性分析是可行的,但是對(duì)于裂腹魚屬最好搭配其他線粒體DNA序列作為分子標(biāo)記來分析效果更好,如D-loop區(qū)[28]、Cytb[29]、COII[30]等。

該研究只分析了葉爾羌河流域5種鯉科魚類的遺傳多樣性,后續(xù)可以進(jìn)一步對(duì)葉爾羌河流域不同區(qū)域開展更為詳細(xì)的資源調(diào)查與遺傳多樣性評(píng)估,從而豐富對(duì)葉爾羌河流域魚類資源狀況的了解,也有助于瀕危魚種保護(hù)、資源合理開發(fā)利用和生態(tài)環(huán)境改善等。